Name: differentiation capacity of human aortic perivascular adipose progenitor cells
Uploaded: 2019-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells at JoVE.com

אנו להכיר את הסיוע של ניווט המחקר במרכז הרפואי מיין עבור סיוע הרכש של רקמות קליני, ואת Histopathology ליבה Histomorphometry (נתמך על-ידי 1P20GM121301, ל Liaw PI)-המחקר במרכז הרפואי מיין מכון חלוקתה, מכתים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH להעניק R01 HL141149 (ל' Liaw).

השימוש ברקמות אנושיות במחקר זה היה מוערך ואושרו על-ידי מוסדיים סקירה הלוח של מיין המרכז הרפואי, כל אנשי הצוות קיבל הכשרה מתאימה לפני הניסויים.
1. תכשירים
<ol><li>להפוך את מאגר דיסוציאציה מאת לשחזר 50 מ"ג ללא בעלי חיים collagenase/dispase תערובת אני פתרון עם 1 מ"ל של nanopure H2O. הכן 1 מ"ג/מ"?...

<ol>
	<li>Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells:+biology+and+potential+applications.">Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).</li><li>Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+as+a+regulator+of+vascular+disease+pathogenesis:+identifying+novel+therapeutic+targets.">Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+adipose+stem+cells.">Differentiation of adipose stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Boucher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27a+Regulates+Human+Perivascular+Adipose+Progenitor+Cell+Differentiation.">Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).</li><li>Nosalski, R., Guzik, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+inflammation+in+vascular+disease.">Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifty+shades+of+white:+Understanding+heterogeneity+in+white+adipose+stem+cells.">Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells.</a> Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).</li><li>de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cells+and+Pericytes:+To+What+Extent+Are+They+Related.">Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related.</a> Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).</li><li>Majesky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitia+and+perivascular+cells.">Adventitia and perivascular cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).</li><li>Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+in+regenerative+medicine.">Adipose tissue stem cells in regenerative medicine.</a> Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).</li><li>Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue-Derived+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine.">Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).</li><li>Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose-derived+stem+cells+as+a+novel+tool+for+future+regenerative+medicine.">Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine.</a> Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Safford, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenic+differentiation+of+murine+and+human+adipose-derived+stromal+cells.">Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).</li><li>Ashjian, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+processed+lipoaspirate+cells+into+early+neural+progenitors.">In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).</li><li>Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFATS+collection:+Using+human+adipose-derived+stem/stromal+cells+for+the+production+of+new+skin+substitutes.">IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes.</a> Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li></ol>

אדיפוז ובתאים של מחסני שונים להשתנות באופן נרחב פוטנציאליים, פנוטיפ ובידול9. Culturing נגזר PVAT אבות מתורם יחיד החולה באינדוקציה סימולטני למטה שלוש שושלות שונות, adipogenic, osteogenic, ו chondrogenic, מאפשר חקירה ומבוקרות היטב pluripotent לקיבולת של הרומן הזה אוכלוסיית ובתאים. המתודולוגיה שתוארו בדו ח...

רקמת שומן הוא מקור עשיר ורב עוצמה בתאי גזע mesenchymal (MSC) מסוגל להבדיל לתוך osteogenic, adipogenic, chondrogenic שושלות1. רקמה זו מרחיבה דרך היפרטרופיה של בוגרת adipocytes de novo הבידול של תושב MSC כדי adipocytes. רקמת שומן Perivascular (PVAT) המקיף את כלי הדם, מווסת את תפקוד כלי הדם2,3. השמנת יתר-induced PVAT הרחבה מחריף פתולוגיות לב וכלי דם. ואילו הפוטנציאל multipotent של MSC מן האדם מחסני אדיפוז תת עורית כבר למד היטב4,5, מחקר explanted, הערכת הקיבולת בידול של האדם נגזר PVAT ובתאים, סביר בשל invasiveness הרכש. לפיכך, מטרת עבודה זו היא לספק מתודולוגיה אל explant, להפיץ ובתאים של האדם PVAT של אבי העורקים של חולים עם מחלת לב וכלי דם, כדי לבדוק את הנטייה להבחין ל osteogenic, chondrogenic ו adipogenic שושלות שלהם. מקור שלנו PVAT הוא אתר של השקה של המעקף על עולה אבי העורקים של חולים שמנים שעברו ניתוח השתלת מעקף של עורקים. PVAT בודדים טרי enzymatically-חלופה מועדפת, השבר בכלי הדם סטרומה בודד ולאחר מופצות במבחנה, ומאפשרת לנו לבחון בפעם הראשונה את יכולת התמיינות של האדם נגזר PVAT ובתאים.
השימוש העיקרי תרבותי אנושי PVAT סטרומה וסקולרית שבר, בדקנו שלושה מבחני מתוכנן לגרום גזע/ובתאים להבדיל לכיוון adipogenic, osteogenic, או chondrogenic שושלות. המחקר שלנו מוקדמת לזהות אוכלוסייה של CD73 + CD105 +, תאים PDGFRa + (CD140a) יכולים להתמיין robustly adipocytes6, למרות multipotency שלהם לא נבדקה. PVAT ישירות מסדיר את הטון ודלקת כלי הדם7. הרציונל לבדיקת הפוטנציאל בידול של אוכלוסייה זו תא הרומן היא להתחיל להבין את השפעת PVAT על תפקוד כלי דם מיוחדות, ומנגנונים של התרחבות PVAT במהלך השמנת יתר. מתודולוגיה זו משפרת את ההבנה שלנו של הפונקציות של רקמת שומן נגזרת ובתאים, מאפשרת לנו לזהות ולהשוות והשונה של ובתאים ממקורות רקמות שונות. עלינו לבנות על גישות הוקמה המאומת בידוד, המבדילים MSC לכיוון שושלות שונות, לייעל את ההליכים כדי למקסם את הכדאיות של האדם נגזר PVAT ובתאים. טכניקות אלה יש שימושים רחב בתחומים של גזע קדמון תא רקמת שומן ומחקר ופיתוח.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">animal-free collagenase/dispase blend I &#160;</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">SCR139</td>
			<td style="width:299px;">50mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Alcian Blue</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1003A</td>
			<td>1% Aqueous solution pH 2.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Alizarin Red</td>
			<td style="width:139px;">Amresco</td>
			<td style="width:148px;">9436-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">alpha-MEM</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">12561056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Aniline Blue</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">10073C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">antibiotic/antimycotic</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Beibrich&#39;s scarlet acid fuchsin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A3908-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">b-glycerophosphate</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G9422-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Biebrich Scarlet</td>
			<td style="width:139px;">EKI</td>
			<td style="width:148px;">2248-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">biotin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Bouin&#39;s fixative</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:139px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:148px;">12659</td>
			<td>stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Cell detachment solution</td>
			<td style="width:139px;">Accutase</td>
			<td style="width:148px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">cell strainer (70mm)</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">dexamethasone</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D4902-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMEM</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">10-013-CV</td>
			<td>4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">10565-042</td>
			<td>high glucose, glutamax, sodium bicarbinate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMSO</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:139px;">Atlanta Biologicals&#160;</td>
			<td style="width:148px;">S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FGF2</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td style="width:148px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">formalin</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">gelatin, bovine skin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G9391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">glutamax</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">35050061</td>
			<td>glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">HBSS</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td style="width:148px;">10-547F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">IBMX</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I5879-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">insulin solution</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Oil red O</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">O0625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">pantothenic acid</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P5155-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">15240062</td>
			<td>100ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">permount</td>
			<td style="width:139px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P4006-100G/221856-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">primocin</td>
			<td style="width:139px;">Invivogen</td>
			<td style="width:148px;">ant-pm-1</td>
			<td>Antimicrobial reagent for culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">rosiglitazone</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">R2408-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">TGFb1</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td style="width:148px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Weigert&#39;s hematoxylin</td>
			<td style="width:139px;">EKI</td>
			<td style="width:148px;">4880-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation capacity of human aortic perivascular adipose progenitor cells

רקמת שומן הוא מקור עשיר ורב עוצמה בתאי גזע mesenchymal (MSC) מסוגל להבדיל לתוך osteogenic, adipogenic, ו chondrogenic שושלות. Adipogenic הבידול של ובתאים הוא מנגנון מרכזי הנהיגה הרחבה רקמת שומן ועל תפקוד בתגובה השמנת יתר. הבנת שינויים רקמת שומן perivascular (PVAT) היא לפיכך הרלוונטית קלינית במחלה מטבולית. עם זאת, מחקרים קודמים היו יוכפל לאחר המרתו הופיעה העכבר, חיה אחרת מודלים. פרוטוקול זה משתמש אנושי דגימות PVAT בית החזה שנאספו בחולים שעברו ניתוח השתלת מעקף של עורקים. רקמת שומן מן העורקים נאסף ומשומשים עבור explantation של השבר בכלי הדם סטרומה. לנו קודם לכן אישר את הנוכחות של אדיפוז ובתאים ב PVAT האדם את היכולת להתמיין המכילים שומנים בדם adipocytes. במחקר זה, בהמשך ניתחנו את פוטנציאל התמיינות של תאים מן השבר בכלי הדם סטרומה, ככל הנראה המכיל ובתאים רב עוצמה. השווינו נגזר PVAT לתאי מח עצם האדם MSC עבור בידול לתוך adipogenic, osteogenic, chondrogenic שושלות. לאחר 14 ימים של בידול, כתמים מסוימים נוצלו לאתר הצטברות שומנים בדם adipocytes (שמן אדום O), פיקדונות calcific תאים osteogenic (Alizarin אדום), או glycosaminoglycans, קולגן בתאים chondrogenic (Trichrome של מאסון). בזמן מח העצם MSC ביעילות הבדיל לתוך כל שלוש שושלות, תאים PVAT, נגזר היה adipogenic ו- chondrogenic פוטנציאל, אבל חסרה פוטנציאל osteogenic חזקים.

בידוד של סטרומה השבר בכלי הדם מן האדם PVAT
איור 1A מראה סכימטי של האזור האנטומי שבו הושג PVAT המכסים של אבי העורקים. תיארנו קודם לכן החולה האוכלוסיות שעברו מעקף עורקים הרכבה שמהם הדגימות היו נגזרת6. <strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells at JoVE.com

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

המטרה של פרוטוקול זה היא לבחון את היכולת של ובתאים נגזר רקמת שומן perivascular האדם להתמיין שושלות תאים מרובים. בידול היה לעומת גזע mesenchymal הנגזרות מח אנושי, אשר ידועה להבדיל לתוך adipocyte, osteocyte ו- chondrocyte שושלות.

בידול קיבולת של האדם-אבי העורקים Perivascular שומן ובתאים

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

רקמת שומן כלי הדם מקיפה את כלי הדם ומווסתת את הפיזיולוגיה הלב וכלי הדם. פרוטוקול זה משמש כדי לענות על שאלות מפתח הקשורות לתפקוד של מגניטורים שומן אנושי microenvironment כלי הדם. תאי השומן משתנים בהתאם למיקום האנטומי שלהם.אנו מראים כי אוכלוסייה של אאוגניטורים רב תכליתיים ניתן להפיק בהצלחה רקמת שומן כלי הדם מחולים עם מחלות לב וכלי דם. הדגמת ההליך תהיה ספנסר סקוט, סטודנט לרפואה מהמעבדה שלי. השג חתיכה של 500 מיליגרם של רקמת שומן כלי הדם האנושית או PVAT מחדר הניתוח כמתואר בפרוטוקול הטקסט.העבר PVAT אנושי טרי מ DMEM לצינור חרוט 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של פתרון אנטיביוטי. דגירה עם נדנדה במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בעוד PVAT הוא בת פתרון אנטיביוטי, להפשיר aliquot של חיץ דיסוציאציה ב 37 מעלות צלזיוס.הוסף 50 microliters של 100x אנטיביוטיקה / פתרון אנטימיקוטי לחמישה מיליליטר של חיץ דיסוציאציה ועיקור באמצעות מסנן מזרק מיקרון 0.22. מוסיפים מיליליטר אחד של תוסף ג'לטין ל באר אחת של צלחת של 24 בארות. במכסה המנוע לזרימה למינארית, השתמש במטסים סטריליים ומספריים כדי להעביר PVAT מהתווית האנטיביוטית לצלחת פטרי סטרילית.הוסף מיליליטר אחד של חיץ דיסוציאציה מחומם מראש לרקמה. טחון דק את הרקמה כולה לתוך תרחיף באמצעות מדפים סטריליים ומספריים ניתוח. מעבירים את תרחיף מיליליטר אחד לארבעה מיליליטר של חיץ דיסוציאציה.הדגירה את הצינור על צידו בשייקר מסלולי מחומם מראש 37 מעלות צלזיוס ב 200 סל"ד במשך שעה אחת. לאחר שעה אחת, אין חתיכות רקמה גלוי צריך להיות נוכח הפתרון יופיע כמו השעיה תא מעונן. לסנן את הפתרון באמצעות מסננת תא 70 מיקרון להגדיר על גבי צינור חרוט 50 מיליליטר.לשטוף את מסננת עם 10 מיליליטר נוספים של פתרון אנטיביוטי כדי ללכוד תאים רבים ככל האפשר. אל תלחץ על מסננת. עכשיו גלולה התאים במשך 12 דקות ב 300 פעמים g בצנטריפוגה דלי מתנדנד.לאחר צנטריפוגה, הצינור יופרד לשכבה תחתית שומנית של אדיפוזיטים, אינטרפייס וכדור. גלולה היא שבר כלי דם סטרומה המכיל תאים אנדותל, תאים חיסוניים, תאי דם ותאי קדמון. תן שימוש חוזר את גלולה ב 10 מיליליטר של HBSS וצנטריפוגה במשך חמש דקות ב 300 פעמים g.חזור על שלב זה עבור סך של שתי שטיפות ב- HBSS. עכשיו שאף את הג'לטין מצלחת של 24 בארות. יש לשטוף בעדינות את הגם פעם אחת עם HBSS כדי להסיר ג'לטין לא מאוגד.תוריד מחדש את גלולת שבר כלי הדם הסטרומאליים עם תאי דם אדומים שלמים במיליליטר אחד של מדיום צמיחה וזרע על היטב מצופה ג'לטין. לאחר מכן להוסיף FGF2 אנושי לריכוז סופי של 25 ננוגרם למיליליטר במדיום תרבות. דגירה במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.לאחר גידול התאים במשך 24 שעות, להסיר את מדיית הצמיחה ולשטוף את התאים חמש פעמים עם HBSS. שלב כביסה זה מסיר תאי דם אדומים ותאים מתים. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של מדיה צמיחה טרי בתוספת 25 ננוגרם למיליליטר FGF2 לכל באר.שנה את המדיה כל 48 שעות הקפד להשלים עם 25 ננוגרם למיליליטר FGF2 טרי בכל פעם. תאי מעבר ברגע שהם מגיעים 100% confluence שבעה עד 10 ימים לאחר explant. כדי לעשות זאת, שאפו את המדיה צמיחה ולשטוף את monolayer פעמיים עם HBSS מיליליטר אחד.שאפו את כל HBSS מה בארות והוסיפו כמה טיפות של פתרון דיסוציאציה של תאים. הקש וסובב את הצלחת מספר פעמים ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 במשך חמש עד שבע דקות כדי להרים את התאים. לאחר מכן מוסיפים כמיליליטר של מדיום תרבות טרי לתאים המנותקים.להפיץ 500 microliters של התאים המנותקים לשתי בארות של צלחת 24 באר כל מכיל 500 microliters של מדיה צמיחה ו 25 ננוגרם FGF2. כמו כן, תרבות מח עצם אנושי תאי גזע Mesenchymal או מושבות MSC כמתואר בפרוטוקול הטקסט. צלחת המספרים המתאימים של מח עצם ותאים נגזר PVAT לכל באר של צלחת 12 באר.עבור תנאים אדיפוגניים ואוסטאוגניים, צלחת כ 200, 000 כדי 225, 000 תאים לגם. בעוד עבור תנאים כונדרוגניים, צלחת 150, 000 כדי 175, 000 תאים לגם. לאחר מכן לנתק תאים הן מאוכלוסיית תאי הצאצאים של PVAT האנושית והן מאוכלוסיית MSC מח העצם האנושית על ידי הוספת פתרון ניתוק תאים.הדגירה את התאים בתסכול הניתוק ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 במשך חמש דקות. משוך את האוכלוסיות לתוך 15 בקבוקונים חרוטיים נפרדים מיליליטר. לסובב את הבקבוקונים למטה ב 500 פעמים g במשך שבע דקות כדי גלולה את התאים.לאחר מכן השתמש שוב בתאים במיליליטר אחד של PBS ולהשתמש hemocytometer כדי להעריך את מספר התא. צלחת התאים ב 12 גם מנות כמו קודם. לספק מנות נפרדות עבור המושרה ולא המושרה תנאים אדיפוגניים ואוסטאוגניים.ולהוסיף 1.5 מיליליטר של מדיה אדיפוגנית ואוסטיאוגנית ללכת לכל באר של המצב המושרה. לאחר מכן הוסיפו 1.5 מיליליטר של מדיה לא אינדוקציה אדיפוגנית ואוסטאוגנית לכל באר של המצב שאינו המושרה. התחל דגירה של אדיפוגנית אוסטאוגנית המושרה ואוכלוסיות תאים שאינם המושרה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5%CO2.לסובב את הנפח הנותר של תאי PVAT אנושיים ו- MSCs מח עצם אנושי במשך שבע דקות ב 500 פעמים g. לקבוע את הנפח הדרוש כדי להשתמש מחדש את מח העצם הנותר כדורי תא נגזר PVAT כדי להשיג צפיפות של 100, 000 תאים לכל 10 microliters. לאחר מכן בצע שימוש חוזר כדורי בנפח המחושב של מדיה צמיחה MSC עבור אינדוקציה שושלת כונדרוגניים.הזז בעדינות את עוצמת התאים למעלה ולמטה באמצעות פיפטה כדי להבטיח התפלגות הומוגנית. עכשיו פיפטה טיפה 10 microliter של פתרון התא המרוכז למרכז של כל באר כדי ליצור מסה מיקרו של 100, 000 תאים. מניחים מיליליטר אחד של מים סטריליים באר הסמוכה כדי למנוע אידוי.הדגירה תרבויות מיקרו מסה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 כדי לאפשר את המסה מיקרו לצבור. לאחר שעתיים, בזהירות להוסיף מדיה התברואה chondrogenic זינק עם 10 ננוגרם למיליליטר אנושי TGF-בטא-אחד לכל אחת בארות מצב המושרה. עכשיו בזהירות להוסיף 1.5 מיליליטר של מדיה אי אינדוקציה ל בארות מצב שאינם המושרה.לגרד או לשפוך את מסת המיקרו במצב chondrogenic המושרה לתוך קלטת על מנת לייבש, להטביע, ולהכתים את המדגם כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מחקרי ההידול האדיפוגניים בוצעו במקביל לתאי MSC ומופקים ממח עצם אנושי ותאי גוף שמקורם ב- PVAT. במצב שאינו מושרה, אין הצטברות שומנים ניכרת.זאת בניגוד למצב המושרה המוצג לאחר הכתמת שומנים ניטרליים עם שמן אדום O.בעוד מידת ההבחנה בתאים האנושיים שמקורם ב- PVAT היא חזקה יותר, שני מקורות התא האנושי הציגו את היכולת להבדיל בין שושלת השומן. פרוטוקול ההידול האוסטאוגני שימש עבור MSCs שמקורם במח העצם האנושי ותאים שמקורם ב- PVAT. תאים שאינם מושרה לא הכתימו עם אליזרין אדום.לאחר פרוטוקול ההתברכות האוסטאוגנית, MSCs האנושיים פיתחו גושים הסתיידים שהוכתמו באדום אליזארין בעוד שתאי PVAT של האאורטיק האנושי לא. תאים שמקורם הן MSCs מח עצם אנושי PVAT האנושי הציג תכונות האופייניות ההתברלות chondrogenic עם הצטברות קולגן בשפע במסת מיקרו. מסה מיקרו נוצרת MSCs מח עצם אנושי ותאים שמקורם PVAT בירך גם הפגינו הצטברות בשפע של glycosaminoglycans כפי שצוין על ידי כתמים כחולים אלקיים.מבחינה מורפולוגית, מבנים דומים ללקונה זוהו עם תאים יושבים בחללים מוקפים בתצהיר קולגן. זה קריטי כדי טחון דק רקמת שומן כלי דם לפני התנתקות אנזימטית כדי להבטיח צפיפות התא הנכון מצופים עבור כל מיפוי בידול שושלת. בעקבות הליך זה, PCR כמותי בשילוב עם כתם מערבי ציטומטריה זרימה יש להשתמש כדי לאפיין סמנים ספציפיים לשושלת של האבות מובחנים ממקורות שומן ומח עצם.עם טכניקה זו, אנו יכולים להתחיל להבין את המנגנונים המסדירים את הרחבת רקמת השומן הדם וכלי הדם ואת תפקוד לקוי במהלך השמנת יתר ואת ההשלכות שיש לתאי אבי העורף על תפקוד כלי הדם ומחלות לב וכלי דם.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

הערכת יכולת ההפרשה של תאי הלבלב Acinar

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

הערכה של תגובתיות וסקולרית באמצעות העורקים המבודדים הבודדים באמצעות התמקדות באפנון על ידי פריסקולרית של הרקמות

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

מפרט פרוגניטור בכבד מתאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות מערכת בידול מוגדרת

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

בידוד והעשרה של תאי אב אפיתל הריאה האנושיים לתרבית אורגנואידית

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

הכנת תאי אדיפוס אבות מרקמות שומן אפידימליות עכבר

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

בידוד, שגשוג והתמיינות של תאי גזע שמקורם בשומן מקוק רזוס

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...