Name: differentiation capacity of human aortic perivascular adipose progenitor cells
Uploaded: 2019-03-05T15:00:00
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我々 は臨床組織・病理組織学的強度コア (1P20GM121301、l. 俊哉 PI がサポート) メイン医療研究センターの調達を支援するため研究ナビゲーション メイン メディカル センターでの支援を認める区分所染色.この作品は、NIH によって支えられた R01 HL141149 を付与 (L. 俊哉)。

本研究では人間のティッシュの使用は評価し、制度レビュー ボードのメイン州医療センターで、承認、全員が実験の前に適切な訓練を受けた。
1. 準備
<ol><li>解離のバッファーを作る 50 mg を再構成することによって無料の動物コラゲナーゼ/当期ブレンド私溶液 nanopure H2o ・準備 1 mg/mL 作業溶液 1 mL と高グルコース再構成コラゲナーゼに w/v 1 %bsa を含む DMEM の 49 m...

<ol>
	<li>Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells:+biology+and+potential+applications.">Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).</li><li>Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+as+a+regulator+of+vascular+disease+pathogenesis:+identifying+novel+therapeutic+targets.">Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+adipose+stem+cells.">Differentiation of adipose stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Boucher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27a+Regulates+Human+Perivascular+Adipose+Progenitor+Cell+Differentiation.">Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).</li><li>Nosalski, R., Guzik, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+inflammation+in+vascular+disease.">Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifty+shades+of+white:+Understanding+heterogeneity+in+white+adipose+stem+cells.">Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells.</a> Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).</li><li>de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cells+and+Pericytes:+To+What+Extent+Are+They+Related.">Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related.</a> Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).</li><li>Majesky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitia+and+perivascular+cells.">Adventitia and perivascular cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).</li><li>Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+in+regenerative+medicine.">Adipose tissue stem cells in regenerative medicine.</a> Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).</li><li>Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue-Derived+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine.">Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).</li><li>Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose-derived+stem+cells+as+a+novel+tool+for+future+regenerative+medicine.">Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine.</a> Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Safford, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenic+differentiation+of+murine+and+human+adipose-derived+stromal+cells.">Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).</li><li>Ashjian, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+processed+lipoaspirate+cells+into+early+neural+progenitors.">In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).</li><li>Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFATS+collection:+Using+human+adipose-derived+stem/stromal+cells+for+the+production+of+new+skin+substitutes.">IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes.</a> Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li></ol>

別拠点から脂肪前駆細胞は、表現型と分化の潜在的な9が大きく異なります。3 つの異なる系統を同時誘導で単一の患者のドナーから PVAT 由来の前駆細胞を培養、脂肪細胞、骨、および軟骨、この小説の多能性容量の制御された調査可能します。前駆細胞の人口。人間 PVAT 由来の前駆細胞の分化能力をテストし、PVAT 病態と血管トーヌスの調節にその機能を理解する、このレ?...

脂肪組織が豊富な万能幹細胞 (MSC) に分化骨、脂肪細胞と軟骨細胞系統1。この組織は、成熟脂肪細胞の肥大と脂肪細胞に常駐の MSC の de novo 分化を通じて展開します。血管周囲脂肪組織 (PVAT) は血管を囲むし、血管機能2,3を調節します。PVAT 肥満膨張は、心血管系の病態を悪化させます。人間の皮下脂肪のデポから MSC の多能性の可能性はよく勉強4,5をされている、どんな研究が仔あり、ために可能性が高い人間 PVAT 由来神経前駆細胞の分化能力を評価調達の侵襲。したがって、この作業の目的は、外植体し、心血管疾患を持つ患者から人間の大動脈 PVAT から前駆細胞を伝播し、彼らに骨を区別する傾向、軟骨細胞、脂肪細胞系統をテストする方法を提供します。PVAT のわれわれの情報源は、肥満患者の冠動脈バイパス術後大動脈のバイパスの吻合部からです。離 PVAT は酵素によって解離と間質の血管の一部が分離され、in vitro で初めて人間 PVAT 由来神経前駆細胞の分化能力をテストする私たちを有効に伝達されます。
プライマリの培養ひと PVAT 間質血管分数を使用すると、脂肪細胞、骨、または軟骨系統の方向へ分化する幹細胞/前駆細胞を誘導するために設計された 3 つのアッセイをテストしました。私たちの以前の研究は、その率はテストしていませんが CD73 +、CD105 +、および脂肪細胞6に区別できる頑健 PDGFRa + (CD140a) 細胞の人口を識別されます。PVAT は直接血管の緊張や炎症の7を調整します。この細胞集団の微分の潜在性をテストするための理論的根拠は、専門 PVAT 血管機能に及ぼすと PVAT 拡張肥満のメカニズムを理解し始めるためです。この方法は脂肪組織の派生前駆細胞の機能の私達の理解を高めるおよび識別し、類似点と異なる組織由来の前駆細胞の違いを比較することが出来ます。我々 は確立され、検証されたアプローチを分離し、異なる系統へ MSC の差別化のために構築し、人間 PVAT 由来神経前駆細胞の生存率を最大化するための手順を最適化します。これらのテクニックは、幹・前駆細胞の研究と脂肪組織開発の分野で広範なアプリケーションを持っています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">animal-free collagenase/dispase blend I &#160;</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">SCR139</td>
			<td style="width:299px;">50mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Alcian Blue</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1003A</td>
			<td>1% Aqueous solution pH 2.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Alizarin Red</td>
			<td style="width:139px;">Amresco</td>
			<td style="width:148px;">9436-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">alpha-MEM</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">12561056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Aniline Blue</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">10073C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">antibiotic/antimycotic</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Beibrich&#39;s scarlet acid fuchsin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A3908-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">b-glycerophosphate</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G9422-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Biebrich Scarlet</td>
			<td style="width:139px;">EKI</td>
			<td style="width:148px;">2248-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">biotin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Bouin&#39;s fixative</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:139px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:148px;">12659</td>
			<td>stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Cell detachment solution</td>
			<td style="width:139px;">Accutase</td>
			<td style="width:148px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">cell strainer (70mm)</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">dexamethasone</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D4902-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMEM</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">10-013-CV</td>
			<td>4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">10565-042</td>
			<td>high glucose, glutamax, sodium bicarbinate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMSO</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:139px;">Atlanta Biologicals&#160;</td>
			<td style="width:148px;">S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FGF2</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td style="width:148px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">formalin</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">gelatin, bovine skin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G9391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">glutamax</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">35050061</td>
			<td>glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">HBSS</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td style="width:148px;">10-547F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">IBMX</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I5879-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">insulin solution</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Oil red O</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">O0625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">pantothenic acid</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P5155-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">15240062</td>
			<td>100ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">permount</td>
			<td style="width:139px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P4006-100G/221856-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">primocin</td>
			<td style="width:139px;">Invivogen</td>
			<td style="width:148px;">ant-pm-1</td>
			<td>Antimicrobial reagent for culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">rosiglitazone</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">R2408-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">TGFb1</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td style="width:148px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Weigert&#39;s hematoxylin</td>
			<td style="width:139px;">EKI</td>
			<td style="width:148px;">4880-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation capacity of human aortic perivascular adipose progenitor cells

脂肪組織が豊富な万能幹細胞 (MSC) に分化骨、脂肪細胞、軟骨細胞の血統。前駆細胞の脂肪細胞分化は、肥満に対する脂肪組織拡大と機能不全を運転する主要なメカニズムです。血管周囲脂肪組織 (PVAT) に変化を理解、代謝性疾患の臨床的に関連性の高いです。しかし、以前の研究は主にマウスや他の動物の実行をされているモデル。このプロトコルは、冠動脈バイパス手術を受けている患者から収集した人間の呼吸器 PVAT サンプルを使用します。上行大動脈からの脂肪組織は収集され、間質血管の端数の植用します。我々 は以前脂質含有に分化する能力を持つ人間 PVAT 脂肪前駆細胞の存在を確認した脂肪細胞。本研究では、おそらく万能幹細胞を含む間質血管分数からの細胞の微分の潜在性我々 さらに分析。ひと骨髄 MSC の脂肪、骨、軟骨細胞系統に分化する PVAT 由来細胞を比較しました。次の分化の 14 日は、特定の汚れ (オイル赤い O) 脂肪細胞における脂質の蓄積を検出を利用した骨形成系細胞 (アリザリン赤) やグリコサミノグリカンとコラーゲン軟骨幹細胞 (マッソンの Trichrome) の石灰鉱床。骨髄 MSC は効率的にすべての 3 つの系統に分化、PVAT 由来細胞が脂肪細胞と軟骨細胞の潜在的なしかし、骨の強い潜在性を欠けていた。

人間 PVAT 血管間質画分の分離
図 1 aは、上行大動脈を覆う PVAT が得られた解剖学的領域の概略を示しています。我々 は以前からこれらのサンプルあった派生6冠動脈バイパス術を受ける患者の集団を説明します。図 1 bは、手術後得られた人間 PVAT ?...

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Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

このプロトコルの目的は、複数の細胞系統に分化する人間の血管周囲脂肪組織由来幹細胞の能力をテストすることです。分化は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨に区別するために知られている人間の骨髄由来間葉系幹細胞と比較しました。

ヒト大動脈血管周囲脂肪前駆細胞の分化能力

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

血管周囲脂肪組織は血管を取り囲み、心血管生理を調節します。このプロトコルは、血管微小環境におけるヒト脂肪前駆体の機能に関連する主要な質問に答えるために使用される。脂肪前駆細胞は、解剖学的位置によって変化する。我々は、多能性前駆物質の集団が心血管疾患患者から血管内脂肪組織から正常に誘導できることを示す。手順を実証することは、私の研究室の医学生であるスペンサー・スコットです。テキストプロトコルに記載されているように、手術室からヒト血管内脂肪組織またはPVATの500ミリグラムの部分を取得します。新鮮なヒトPVATをDMEMから25ミリリットルの抗生物質溶液を含む50ミリリットルの円錐管に移す。摂氏4度で20分間ロッキングでインキュベートします。PVATが抗生物質溶液にある間、摂氏37度で解離緩衝液のアリコートを解凍する。50マイクロリットルの抗生物質/抗ミキサイト溶液を5ミリリットルの解離バッファーに加え、0.22ミクロンのシリンジフィルターを使用して滅菌します。24ウェルプレートの1つの井戸にゼラチン溶液を1ミリリットル加えます。薄層流れフードでは、滅菌鉗子とはさみを使用して、抗生物質溶液から無菌ペトリ皿にPVATを移します。組織に予温解離バッファーの 1 ミリリットルを追加します。.滅菌鉗子と解剖はさみを使用して、組織全体をスラリーに細かくミンチします。1ミリリットルのスラリーを4ミリリットルの解離バッファーに移します。200 rpm で摂氏37度の軌道シェーカーで、側面のチューブを1時間インキュベートします。1時間後、目に見える組織片が存在しなく、溶液が曇った細胞懸濁液として現れる。50ミリリットルの円錐チューブの上に設定された70ミクロンの細胞ストレーナーを介して溶液をフィルタリングします。できるだけ多くの細胞を捕捉するために、抗生物質溶液の追加10ミリリットルでストレーナーをリンスします。ストレーナーを絞らない。今度は、振るバケツ遠心分離機で300回gで12分間細胞をペレット化する。遠心分離後、チューブは脂肪細胞の脂肪の上層、相間およびペレットに分離される。ペレットは、内皮細胞、免疫細胞、血液細胞および前駆細胞を含む間質血管分率である。ペレットをHBSSと遠心分離機の10ミリリットルで300倍gで5分間再懸濁します。HBSS での合計 2 回のスッシュに対してこの手順を繰り返します。今、24ウェルプレートからゼラチンを吸引します。HBSSで井戸を1回静かに洗い、バインドされていないゼラチンを取り除きます。成長培地の1ミリリットルの赤血球とゼラチンコーティングウェルに種子を含む間質血管分画ペレットを再懸濁します。次に、培地中の培地に1ミリリットル当たり25ナノグラムの最終的な濃度にヒトFGF2を加える。5%CO2で摂氏37度で24時間インキュベートします。細胞を24時間増殖させた後、増殖培地を取り出し、HBSSで5回洗浄します。この洗浄ステップは、赤血球および死んだ細胞を除去する。その後、新鮮な成長培地の1ミリリットルを追加します 25 各ウェルにミリリットルFGF2あたりナノグラム.毎回1ミリリットル新鮮なFGF2あたり25ナノグラムで補うことを確認するために48時間ごとにメディアを変更します。通過細胞は、外植から7~10日後に100%合流に達すると。これを行うには、成長培地を吸引し、1ミリリットルHBSSで単層を2回洗浄する。ウェルからすべてのHBSSを吸引し、細胞解離溶液の数滴を追加します。プレートを数回タップして渦巻き、5%CO2で摂氏37度で5〜7分間インキュベートし、細胞を持ち上げます。次に、分離した細胞に約1ミリリットルの新鮮な培養培地を加える。500マイクロリットルの成長培地と25ナノグラムのFGF2を含む24ウェルプレートの2つの井戸に、取り外された細胞の500マイクロリットルを分配します。また、ヒト骨髄間葉系幹細胞またはMSCコロニーの培養は、テキストプロトコルに記載されている。12ウェルプレートのウェルごとに骨髄およびPVAT由来細胞の適切な数をプレートします。小児性および骨形成状態の場合、ウェルあたり約200,000〜225,000個の細胞をプレートします。一方、軟骨形成状態に対して、プレート150,000〜175,000細胞当たり175,000個の細胞。次に、細胞剥離液を添加することにより、ヒトPVAT前駆細胞集団およびヒト骨髄MSC集団の両方から細胞を解離する。剥離液中の細胞を摂氏37度、5%CO2で5分間インキュベートします。別々の15ミリリットル円錐バイアルに集団を引っ張ります。バイアルを500倍gで7分間回転させ、細胞をペレットにします。その後、PBSの1ミリリットルで細胞を再懸濁し、ヘモサイトームを使用して細胞数を推定する。以前のように12ウェル皿に細胞を盛り付けます。誘発および非誘導の浸食および骨形成状態のための別々の皿を提供する。そして、誘発された状態の各ウェルに1.5ミリリットルの有数および骨形成伝導媒体を加える。その後、非誘発状態の各ウェルに1.5ミリリットルの有量および骨形成性非誘導培地を加える。37°Cおよび5%CO2で、有数および骨形成性の誘導および非誘導細胞集団のインキュベーションを開始する。ヒトPVAT前駆細胞およびヒト骨髄MCの残量を500倍gで7分間スピンダウンします。残りの骨髄およびPVAT由来の細胞ペレットを再懸濁して、10マイクロリットル当たり100,000細胞の密度を達成するために必要な体積を決定します。次に、軟骨系系統誘導のためのMSC成長培地の計算された体積中のペレットを再懸濁する。ピペットを使用して細胞の体積を上下に静かに動かして、均質な分布を確保します。今ピペット濃縮細胞溶液の10マイクロリットルの液滴を各ウェルの中心に入れて、100,000個の細胞のマイクロ質量を形成する。蒸発を防ぐために、隣接する井戸に1ミリリットルの滅菌水を入れます。マイクロマスを37°C、5%CO2で2時間培養し、マイクロマスを凝集させます。2時間後、誘導された状態の各ウェルに、1ミリリットルのヒトTGF-β-1当たり10ナノグラムでスパイクした軟骨発生分化培地を慎重に添加する。今慎重に非誘導培地の1.5ミリリットルを非誘導状態の井戸に加える。テキストプロトコルに記載されているようにサンプルを脱水、埋め込み、染色するために、誘導された軟骨発生状態のマイクロ質量をカセットに擦り付けたり、注いだりします。アディポジェニック分化研究は、ヒト骨髄由来MSCおよびPVAT由来前駆細胞と並行して行った。非誘導状態では、脂質蓄積は明らかでない。これは、油赤Oを用いた中性脂質の染色後に示される誘導状態とは対照的であるが、ヒト大動脈PVAT由来細胞における分化の程度はより強いが、ヒト細胞源はいずれも脂肪系系統について分化する能力を示した。骨形成分化プロトコルは、ヒト骨髄由来のMSCおよびPVAT由来細胞に使用された。非誘導細胞はアリザリンレッドで染色しなかった。骨形成分化プロトコルの後、ヒトMSPはアリザリンレッドで染色された石灰化結節を開発したが、ヒト大動脈PVAT細胞は染色しなかった。ヒト骨髄MSCとヒトPVATの両方に由来する細胞は、微量のコラーゲン蓄積を伴う軟骨発生分化の特徴を示す。ヒト骨髄MCsおよび大動脈PVAT由来細胞から形成された微量は、アルシアンブルー染色で示されるように糖アミノグリカンの豊富な蓄積も示した。形態学的には、ラクナエに似た構造が、コラーゲン沈着に囲まれた空洞に座っている細胞で検出された。酵素的解離の前に血管内脂肪組織を細かくミンチし、各系統分化アッセイに適切な細胞密度をメッキすることが重要です。この手順に従って、ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリーと組み合わせた定量PCRを使用して、血管内脂肪および骨髄源からの分化前駆物質の系統特異的マーカーを特徴付けるべきである。この技術により、肥満時に血管内脂肪組織の拡張と機能不全を調節するメカニズムと、前駆細胞が血管機能や心血管疾患に及ぼす影響を理解し始めることができます。

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

人間の脂肪吸引物からの脂肪由来幹細胞を手動で隔離

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

膵臓腺房細胞の分泌能力を評価する

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

血管周囲脂肪組織による変調に焦点を当てた孤立腸間膜動脈を用いた血管緊張応答性の評価

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

定義された分化系を用いた多能性幹細胞からの肝前駆体仕様

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

オルガノイド培養のためのヒト肺上皮前駆細胞の単離と濃縮

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

マウス上端体脂肪組織からの脂肪前駆細胞の調製

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

アカゲザル脂肪由来幹細胞の単離・増殖・分化

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...