Name: differentiation capacity of human aortic perivascular adipose progenitor cells
Uploaded: 2019-03-05T15:00:00
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우리는 임상 조직, Histopathology 및 메인 의료 센터 연구에서 Histomorphometry 코어 (1P20GM121301, L. Liaw PI 지원)의 조달을 위한 메인 의료 센터에서 연구 탐색의 도움을 인정 단면화 및 얼룩에 대 한 연구소입니다. 이 작품은 NIH에 의해 지원 되었다 R01 HL141149 부여 (L. Liaw).

이 연구에서 인간의 조직에의 사용 되었다 평가 하 고는 제도적 검토 보드의 메인 의료 센터에 의해 승인 모든 인사 실험 전에 적절 한 훈련을 받았다.
1입니다. 준비
<ol><li>버퍼를 분리 하 게 50 mg을 재구성 하 여 동물 무료 콜라/dispase 혼합 나 솔루션 nanopure H2o. 준비 1 mg/mL 작업 솔루션의 1 mL 높은 포도 당 1 %w / v BSA 재구성된 콜라에 포함 된 DMEM의 49 mL을 추가 하 여 / dis...

<ol>
	<li>Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells:+biology+and+potential+applications.">Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).</li><li>Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+as+a+regulator+of+vascular+disease+pathogenesis:+identifying+novel+therapeutic+targets.">Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+adipose+stem+cells.">Differentiation of adipose stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+inflammation+in+vascular+disease.">Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitia+and+perivascular+cells.">Adventitia and perivascular cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).</li><li>Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+in+regenerative+medicine.">Adipose tissue stem cells in regenerative medicine.</a> Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).</li><li>Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Safford, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenic+differentiation+of+murine+and+human+adipose-derived+stromal+cells.">Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).</li><li>Ashjian, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+processed+lipoaspirate+cells+into+early+neural+progenitors.">In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).</li><li>Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFATS+collection:+Using+human+adipose-derived+stem/stromal+cells+for+the+production+of+new+skin+substitutes.">IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes.</a> Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li></ol>

다른 플랫폼에서 많은 조상 세포 표현 형 및 차별화 잠재적인9에서 넓게 변화 한다. 3 다른 계보 다운 동시 유도 단일 환자 기증자에서 PVAT 파생 창시자 경작, osteogenic, adipogenic 그리고 chondrogenic,이 소설의 만능 용량 잘 제어 조사에 대 한 수 수 조상 세포의 인구입니다. 인간의 PVAT에서 조상 세포의 분화 능력을 테스트 하 고 PVAT pathologies 및 혈관 음색 통제에 그들의 기능을 이해 하?...

지방이 많은 직물은 다 강력한 중간 엽 줄기 세포 (MSC)로 분화의 능력의 풍부한 소스 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 계보1. 이 조직을 통해 성숙한 adipocytes의 비 대와 드 노 보 차별화 adipocytes에 거주 MSC의 확장합니다. 혈관 주위 지방 조직 (PVAT) 혈관을 포위 하 고 조절 관 기능2,3. PVAT 확장 비만 유발 심혈 관 병 리 악화. 동안 인간의 피하 지방이 많은 저장소에서 MSC의 multipotent 잠재력 잘 공부4,5, 아니 연구 explanted 고로 인해 가능성이 인간 PVAT 파생 된 조상 세포의 분화 용량 평가 조달의 침입입니다. 따라서,이 작품의 목표 explant에서 심장 혈관 질병을 가진 환자에서 인간의 대동맥 PVAT 조상 세포를 전파 하 고 그들의 성향에 osteogenic 차별화, chondrogenic, 및 adipogenic 계보를 테스트 하는 방법을 제공 하는 것 이다. 관상동맥 바이패스 접목 수술 비만 환자의 대동맥 오름차순에 바이패스 이식의 문 합의 사이트에서 PVAT의 우리의 소스가입니다. 갓 격리 PVAT 효소 해리 이며 stromal 혈관 분수 격리 및 생체 외에서, 처음으로 인간의 PVAT 파생 된 조상 세포의 분화 능력 테스트를 전파.
기본 교양된 인간 PVAT stromal 혈관 분수를 사용 하 여, 줄기/뿌리 세포 osteogenic, adipogenic 또는 chondrogenic 계보 차별화를 유도 하도록 설계 된 3 개의 분석 테스트. 우리의 이전 연구 식별 CD73 +, CD105 + 및 PDGFRa + (CD140a) 튼튼하게 adipocytes6, 차별화 수 있는 세포의 인구 그들의 multipotency 테스트 하지는 않지만. PVAT는 직접 혈관 음색 및 염증7을 통제 한다. 이 새로운 세포 인구의 차별화 가능성을 테스트 하기 위한 근거 혈관 기능에 PVAT의 특수 영향 및 비만 중 PVAT 확장의 메커니즘을 이해 하기 시작 하는. 이 방법론은 지방 조직 파생된 조상 세포의 기능에 대 한 우리의 이해를 강화 하 고 식별 하 고 유사점과 다른 조직 소스에서 조상 세포의 차이점을 비교할 수 있습니다. 우리는 분리 하 고 다른 혈통으로 MSC 차별화에 대 한 설립 및 검증 된 방법에 따라 구축 하 고 인간 PVAT 파생 된 조상 세포의 생존 능력을 극대화 하는 절차를 최적화. 이러한 기술은 줄기와 조상 세포 연구와 지방 조직 개발의 분야에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">animal-free collagenase/dispase blend I &#160;</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">SCR139</td>
			<td style="width:299px;">50mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Alcian Blue</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1003A</td>
			<td>1% Aqueous solution pH 2.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Alizarin Red</td>
			<td style="width:139px;">Amresco</td>
			<td style="width:148px;">9436-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">alpha-MEM</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">12561056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Aniline Blue</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">10073C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">antibiotic/antimycotic</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Beibrich&#39;s scarlet acid fuchsin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A3908-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">b-glycerophosphate</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G9422-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Biebrich Scarlet</td>
			<td style="width:139px;">EKI</td>
			<td style="width:148px;">2248-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">biotin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Bouin&#39;s fixative</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:139px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:148px;">12659</td>
			<td>stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Cell detachment solution</td>
			<td style="width:139px;">Accutase</td>
			<td style="width:148px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">cell strainer (70mm)</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">dexamethasone</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D4902-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMEM</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">10-013-CV</td>
			<td>4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">10565-042</td>
			<td>high glucose, glutamax, sodium bicarbinate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMSO</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:139px;">Atlanta Biologicals&#160;</td>
			<td style="width:148px;">S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FGF2</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td style="width:148px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">formalin</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">gelatin, bovine skin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G9391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">glutamax</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">35050061</td>
			<td>glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">HBSS</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td style="width:148px;">10-547F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">IBMX</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I5879-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">insulin solution</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Oil red O</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">O0625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">pantothenic acid</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P5155-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">15240062</td>
			<td>100ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">permount</td>
			<td style="width:139px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P4006-100G/221856-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">primocin</td>
			<td style="width:139px;">Invivogen</td>
			<td style="width:148px;">ant-pm-1</td>
			<td>Antimicrobial reagent for culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">rosiglitazone</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">R2408-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">TGFb1</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td style="width:148px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Weigert&#39;s hematoxylin</td>
			<td style="width:139px;">EKI</td>
			<td style="width:148px;">4880-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation capacity of human aortic perivascular adipose progenitor cells

지방이 많은 직물은 다 강력한 중간 엽 줄기 세포 (MSC)로 분화의 능력의 풍부한 소스 osteogenic, adipogenic, 및 chondrogenic 계보. Adipogenic 조상 세포의 분화 응답 비만으로 지방 조직 확장 및 부전을 운전 하는 주요 메커니즘입니다. 혈관 주위 지방 조직 (PVAT)에 대 한 이해 변경 임상 관련 대사 질환에 따라서 이다. 그러나, 이전 연구는 주로 마우스와 다른 동물에서 수행 되었습니다 모델. 이 프로토콜은 관상동맥 바이패스 접목 수술 환자에서 인간의 흉부 PVAT 샘플을 사용 합니다. 오름차순 대동맥에서 지방 조직 수집 되었고 stromal 혈관 분수의 explantation에 대 한 사용. 우리는 이전을 포함 하는 지질으로 차별화 하는 수 용량을 가진 인간 PVAT에 많은 조상 세포의 존재 확인 adipocytes. 이 연구에서 우리가 더 분석 stromal 혈관 분수에서 세포의 감 별 법 잠재력 아마도 다 강력한 조상 세포를 포함 하. 우리는 인간의 골 수 MSC osteogenic, adipogenic 및 chondrogenic 계보에 차별화를 PVAT 파생 셀 비교. 차별화의 14 일, 다음 특정 얼룩 adipocytes (기름 빨간 O)에서 지질 축적을 감지 활용 했다 osteogenic 셀 (Alizarin Red), 또는 있다 chondrogenic 셀 (Masson의 Trichrome) 콜라겐에 calcific 예금. MSC는 효율적으로 모든 3 개의 계보에 분화 하는 골 수, 동안 셀 PVAT 파생 했다 adipogenic 및 chondrogenic 잠재적인, 하지만 강력한 osteogenic 잠재력 부족.

인간 PVAT에서 stromal 혈관 분수의 절연
그림 1A 는 오름차순 대동맥 overlying PVAT 획득 했다 해 부 지역의 회로도 보여준다. 우리는 이전 관상동맥 바이패스 접목에서이 샘플은 파생된6받고 환자 인구를 설명 합니다. 그림 1B 수술 후 얻은 인간 PVAT의 예를 ?...

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Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

이 프로토콜의 목적은 여러 셀 혈통으로 차별 하는 인간의 혈관 주위 지방 조직에서 파생 된 조상 세포의 능력을 테스트 하는. 체형, osteocyte, 및 chondrocyte 혈통으로 차별화 하는 데 알려져 있다 인간의 골 수에서 파생 된 중간 엽 줄기 세포 분화와 비교 되었다.

인간의 대동맥 혈관 주위 지방 조상 세포의 분화 능력

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

지방 분지 조직은 혈관을 둘러싸고 심혈관 생리학을 조절합니다. 이 프로토콜은 혈관 미세 환경에서 인간 지방 선조의 기능과 관련된 주요 질문에 대답하는 데 사용됩니다. 지방 전구 세포는 해부학적 위치에 따라 다릅니다.우리는 다능한 선조의 인구가 심혈관 질병을 가진 환자에게서 심분 지방 조직에서 성공적으로 파생될 수 있다는 것을 보여줍니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 의대생 인 스펜서 스콧이 될 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 수술실에서 인간 인분면 지방 조직 또는 PVAT의 500 밀리그램 조각을 가져옵니다.DMEM에서 항생제 용액 25 밀리리터를 포함하는 50 밀리리터 원내 튜브로 신선한 인간 PVAT를 전송합니다. 섭씨 4도에서 20분 동안 흔들면 배양하세요. PVAT는 항생제 용액에있는 동안, 섭씨 37도에서 해리 버퍼의 알리쿼시를 해동.100x 항생제/항진화 용액 50마이크로리터를 5밀리리터의 해리 버퍼에 추가하고 0.22 미크론 주사기 필터를 사용하여 살균합니다. 24웰 플레이트의 한 웰에 젤라틴 용액 1밀리리터를 추가합니다. 라미나르 플로우 후드에서 멸균 집게와 가위를 사용하여 항생제 용액에서 멸균 페트리 접시로 PVAT를 전송합니다.조직에 미리 따뜻해지는 해리 버퍼 1밀리리터를 추가합니다. 멸균 집게와 해부 가위를 사용하여 전체 조직을 슬러리로 미세하게 다진다. 1 밀리리터 슬러리를 4밀리리터의 해리 버퍼로 옮기습니다.1시간 동안 200rpm에서 미리 따뜻워진 섭씨 37도 의 궤도 셰이커로 튜브를 배양합니다. 1 시간 후에 눈에 보이는 조직 조각이 없어야하며 용액이 흐린 세포 현탁액으로 나타납니다. 50 밀리리터 원원형 튜브 꼭대기에 놓인 70마이크론 세포 스트레이너를 통해 용액을 필터링합니다.가능한 한 많은 세포를 포착하기 위해 항생제 용액의 추가 10 밀리리터로 여과기를 헹구세요. 스트레이너를 짜내지 마십시오. 이제 스윙 버킷 원심분리기에서 300배 g에서 12분 동안 세포를 펠릿합니다.원심분리 후, 튜브는 지방상 층, 상간 및 펠릿으로 분리됩니다. 펠릿은 내피 세포, 면역 세포, 혈액 세포 및 선조 세포를 포함하는 기질 혈관 분획입니다. 300배g에서 5분간 HBSS와 원심분리기의 10밀리리터에서 펠릿을 다시 분리합니다.HBSS에서 총 2개의 세치에 대해 이 단계를 반복합니다. 이제 24웰 플레이트에서 젤라틴을 흡인합니다. HBSS로 한 번 잘 부드럽게 씻고 바운드되지 않은 젤라틴을 제거합니다.기질 혈관 분획 펠릿을 그대로 적혈구로 재중단하고 성장 배지의 1 밀리리터에 씨를 잘 뿌린다. 그런 다음 인간 FGF2를 배양 배지에서 밀리리터당 25 나노그램의 최종 농도에 추가합니다. 5%의 CO2로 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하세요.24 시간 동안 세포를 성장 한 후, 성장 매체를 제거하고 HBSS로 세포를 다섯 번 세척. 이 세척 단계는 적혈구와 죽은 세포를 제거합니다. 그런 다음 각 웰에 밀리리터 FGF2 당 25 나노그램으로 보충된 신선한 성장 매체의 1밀리리터를 추가합니다.매 번 미디어를 변경 48 시간 으로 보충 하는 확인 25 밀리 리터 신선한 FGF2 때마다 나노 그램. 통로 세포는 일단 100%에 도달하면 병절 후에 7 10 일 합류합니다. 이렇게하려면 성장 매체를 흡인하고 단일 층을 1 밀리리터 HBSS로 두 번 씻으세요.우물에서 모든 HBSS를 흡인하고 세포 해리 솔루션의 몇 방울을 추가합니다. 접시를 여러 번 탭하고 소용돌이치는 경우 37도에서 5%의 CO2로 배양하여 세포를 들어 올립니다. 그런 다음 분리 된 세포에 신선한 배양 배지의 약 1 밀리리터를 추가합니다.분리된 세포의 500마이크로리터를 각각 24웰 플레이트의 2개의 우물에 분배하여 500마이크로리터의 성장 매체와 25나노그램 FGF2를 함유하고 있다. 또한, 문체 프로토콜에 기재된 바와 같이 인간 골수 골수 중년줄기 세포 또는 MSC 콜로니를 배양한다. 12웰 플레이트의 웰당 골수 및 PVAT 유래 세포의 적절한 숫자를 플레이트.선화 및 골성 질환의 경우, 약 200, 000 ~ 225, 000 세포당 플레이트. 연골 질환의 경우, 플레이트 150, 000 ~ 175, 000 세포가 잘 생성됩니다. 그런 다음 세포 분리 용액을 추가하여 인간 PVAT 전구 세포 집단과 인간 골수 MSC 인구 모두에서 세포를 분리합니다.분리 용액의 세포를 섭씨 37도, CO2 5%에서 5분간 배양합니다. 인구를 별도의 15 밀리리터 원물 바이알로 끌어당깁니다. 바이알을 500배 g로 7분간 회전하여 세포를 펠릿합니다.그런 다음 PBS의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 혈종계를 사용하여 세포 수를 추정합니다. 이전과 같이 12 웰 요리에 세포를 접시. 유도 및 비 유도 된 비 유도 된 선화 및 골성 조건에 대 한 별도 접시를 제공 합니다.그리고 유도된 상태의 각 웰에 1.5 밀리리터의 선포성 및 골성 전도 성 전도 성 매체를 추가한다. 그런 다음 비 유도되지 않은 상태의 각 웰에 1.5 밀리리터의 선포겐성 및 골성 비 유도 매체를 추가합니다. 섭씨 37도 및 5%CO2에서 비자극성 및 골성 유도 및 비유도 세포 집단의 배양을 시작합니다.인간 PVAT 전구 세포와 인간 골수 MSC의 남은 부피를 500배 g에서 7분간 스핀다운합니다. 10 마이크로리터 당 100, 000 세포의 밀도를 달성하기 위해 나머지 골수와 PVAT 유래 세포 펠릿을 다시 중단하는 데 필요한 부피를 결정합니다. 그런 다음 연골계계 유도를 위해 MSC 성장 매체의 계산된 부피에서 펠릿을 재중단한다.피펫을 사용하여 셀의 부피를 위아래로 부드럽게 이동하여 균질 분포를 보장합니다. 이제 파이펫은 농축 된 세포 용액의 10 마이크로 리터 액액을 각 우물의 중심으로 하여 100, 000 세포의 마이크로 질량을 형성합니다. 증발을 방지하기 위해 인접한 우물에 멸균 수1 밀리리터를 놓습니다.마이크로 질량을 집계할 수 있도록 섭씨 37도, CO2 5%에서 2시간 동안 마이크로 질량 배양을 배양합니다. 2 시간 후, 신중하게 유도 된 상태 우물각각에 밀리리터 인간 TGF 베타 -1 당 10 나노 그램으로 스파이크 연골 생성 분화 매체를 추가합니다. 이제 비 유도 매체의 1.5 밀리리터를 유도되지 않은 상태 우물에 신중하게 추가합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 시료를 탈수, 임베드 및 얼룩시키기 위해 유도된 연골학적 조건에서 마이크로 질량을 긁어내거나 카세트로 부었다. 아디포겐성 분화 연구는 인간 골수 유래 MSC 및 PVAT 유래 전구 세포와 병행하여 수행하였다. 유도되지 않은 상태에서지질 축적이 분명하지 않습니다.이는 오일 레드 O.와 중성 지질의 염색 에 따른 유도된 상태와 는 대조적으로, 인간 대동맥 PVAT 유래 세포에서 분화의 정도가 더 견고하지만, 두 인간 세포 소스 모두 사이포원 혈통을 분화하는 능력을 나타냈다. 골성 분화 프로토콜은 인간 골수 유래 MSC 및 PVAT 유래 세포에 사용되었다. 유도되지 않은 세포는 Alizarin Red로 얼룩지지 않았습니다.골성 분화 프로토콜 후, 인간 MSC는 인간 대동맥 PVAT 세포가 하지 않는 동안 알리자린 레드로 염색석석질 결절을 개발했습니다. 인간 골수 MSC와 인간 PVAT 모두에서 유래된 세포는 마이크로 질량에 풍부한 콜라겐 축적을 통해 연골분화의 특징을 나타냈다. 마이크로 질량은 인간 골수 MSC및 대동맥 PVAT 유래 세포에서 형성되어 알시안 블루 염색에 의해 표시된 글리코사미노 글리칸의 풍부한 축적을 나타낸다.형태학적으로, 라쿠나에 유사한 구조물은 콜라겐 증착에 둘러싸인 구멍에 앉아있는 세포로 검출되었다. 효소 분리 전에 체분 지방 조직을 미세하게 다진 하고 각 계보 분화 분석에 대해 적절한 세포 밀도가 도금되도록 하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 서양 블롯 및 유동 세포측정과 결합된 정량적인 PCR은 각지방 및 골수 소스로부터 분화된 선조의 계보 특이적 마커를 특성화하기 위해 사용되어야 합니다.이 기술로, 우리는 비만 도중 지방 조직 확장 및 기능 장애를 인식하는 기계장치 및 전구 세포가 혈관 기능 및 심장 혈관 질병에 있다는 것을 이해하기 시작할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

연구

생물학

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

인간 Lipoaspirates에서 지방 유래 줄기 세포를 수동으로 분리

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

췌장 선포 세포의 분비 능력 평가

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

혈관 주위 지방 조직에 의해 변조에 초점을 맞춘 분리 된 장 간 동맥을 사용 하 여 혈관 톤 응답성의 평가

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

붉은털원숭이 지방유래 줄기세포의 분리, 증식 및 분화

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...