Name: differentiation capacity of human aortic perivascular adipose progenitor cells
Uploaded: 2019-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells at JoVE.com

Vi erkjenner hjelp av forskning navigasjon Maine Medical Center for å assistere med anskaffelse av klinisk vev, og histopatologi og Histomorphometry kjernen (støttet av 1P20GM121301, L. Liaw PI) for Maine Medical Center forskning Institutt for skjæring og flekker. Dette arbeidet ble støttet av NIH gi R01 HL141149 (L. Liaw).

Bruk av menneskelig vev i denne studien ble evaluert og godkjent av institusjonelle gjennomgang styret av Maine medisinsk senter og alle fått riktig trening før eksperimentering.
1. forberedelser
<ol><li>Gjøre dissosiasjon buffer av gjenoppbygge 50 mg dyr-fri collagenase/dispase blanding jeg løsning med 1 mL av nanopure H2O. forberede 1 mg/mL fungerende løsning ved å legge til 49 mL av høy glukose DMEM som inneholder 1% w/v BSA til den rekonstituerte collagenase / dispase l...

<ol>
	<li>Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells:+biology+and+potential+applications.">Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).</li><li>Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+as+a+regulator+of+vascular+disease+pathogenesis:+identifying+novel+therapeutic+targets.">Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+adipose+stem+cells.">Differentiation of adipose stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Boucher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27a+Regulates+Human+Perivascular+Adipose+Progenitor+Cell+Differentiation.">Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).</li><li>Nosalski, R., Guzik, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+inflammation+in+vascular+disease.">Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifty+shades+of+white:+Understanding+heterogeneity+in+white+adipose+stem+cells.">Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells.</a> Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).</li><li>de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cells+and+Pericytes:+To+What+Extent+Are+They+Related.">Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related.</a> Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).</li><li>Majesky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitia+and+perivascular+cells.">Adventitia and perivascular cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).</li><li>Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+in+regenerative+medicine.">Adipose tissue stem cells in regenerative medicine.</a> Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).</li><li>Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue-Derived+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine.">Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).</li><li>Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose-derived+stem+cells+as+a+novel+tool+for+future+regenerative+medicine.">Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine.</a> Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Safford, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenic+differentiation+of+murine+and+human+adipose-derived+stromal+cells.">Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).</li><li>Ashjian, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+processed+lipoaspirate+cells+into+early+neural+progenitors.">In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).</li><li>Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFATS+collection:+Using+human+adipose-derived+stem/stromal+cells+for+the+production+of+new+skin+substitutes.">IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes.</a> Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li></ol>

Adipose progenitor celler fra ulike depoter varierer mye i fenotypen og differensiering potensielle9. Dyrking PVAT-avledet progenitors fra en enkelt pasient donor i samtidige induksjon ned tre forskjellige linjene, gir adipogenic, osteogenic, og chondrogenic, en godt kontrollerte undersøkelse av pluripotent kapasiteten til denne romanen befolkningen i progenitor celler. Metodikk beskrevet i denne rapporten kan brukes til å teste differensiering kapasitet progenitor celler fra menneskelig PVAT og...

Fettvev er en rik kilde av flere potente mesenchymal stamceller (MSC) i stand til å skille i osteogenic, adipogenic, og chondrogenic linjene1. Dette vevet utvides gjennom hypertrofi av eldre adipocytter og de novo differensiering av bosatt MSC til adipocytter. Perivascular fettvev (PVAT) omgir blodkar og regulerer vaskulær funksjon2,3. Fedme-indusert PVAT ekspansjon forverrer hjerte patologi. Mens multipotent potensialet i MSC fra menneskelige subkutan adipose depoter har vært godt studert4,5, har ingen studier explanted og vurdert differensiering kapasiteten av menneskelig PVAT-avledet stamfar celler, sannsynlig grunn invasiveness av innkjøp. Dermed er målet med dette arbeidet å gi en metodikk explant og utbre progenitor celler fra menneskelige aorta PVAT fra pasienter med hjerte-og karsykdommer og teste deres tilbøyelighet til å skille til osteogenic, chondrogenic og adipogenic linjene. Vår kilde til PVAT er området av anastomose av omkjøringsvei graft på stigende aorta av overvektige pasienter som gjennomgår Koronar bypass pode kirurgi. Fersk-isolert PVAT er enzymatisk avstand og pancreatic er isolert og overført i vitro, slik at vi kan teste for første gang differensiering kapasiteten til menneskelig PVAT-avledet progenitor celler.
Bruke primære kultivert menneskelig PVAT pancreatic, testet vi tre analyser for å indusere stammen/stamfar celler å skille mot adipogenic, osteogenic, eller chondrogenic linjene. Vår tidligere studie identifisert en befolkning på CD73 + CD105 + og PDGFRa + (CD140a) celler som kan robust differensiere i adipocytter6, selv om deres multipotency ikke var testet. PVAT regulerer direkte vaskulær tone og betennelse7. Begrunnelsen for testing differensiering potensialet i denne romanen celle befolkningen er å begynne å forstå spesialiserte påvirkning av PVAT på vaskulær funksjonen og mekanismer for PVAT utvidelse i fedme. Denne metoden øker vår forståelse av funksjonene av fettvev avledet stamfar celler og kan vi identifisere og sammenligne likheter og forskjeller stamfar celler fra ulike vev kilder. Vi bygge på etablerte og validert tilnærminger for å isolere og skille MSC mot ulike overleveringslinjer og optimalisere prosedyrer for å maksimere levedyktigheten til menneskelig PVAT-avledet progenitor celler. Disse teknikkene har bred programmer innen stammen og stamfar cellen forskning og fettvev utvikling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">animal-free collagenase/dispase blend I &#160;</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">SCR139</td>
			<td style="width:299px;">50mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Alcian Blue</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1003A</td>
			<td>1% Aqueous solution pH 2.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Alizarin Red</td>
			<td style="width:139px;">Amresco</td>
			<td style="width:148px;">9436-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">alpha-MEM</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">12561056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Aniline Blue</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">10073C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">antibiotic/antimycotic</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Beibrich&#39;s scarlet acid fuchsin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A3908-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">b-glycerophosphate</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G9422-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Biebrich Scarlet</td>
			<td style="width:139px;">EKI</td>
			<td style="width:148px;">2248-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">biotin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Bouin&#39;s fixative</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:139px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:148px;">12659</td>
			<td>stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Cell detachment solution</td>
			<td style="width:139px;">Accutase</td>
			<td style="width:148px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">cell strainer (70mm)</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">dexamethasone</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D4902-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMEM</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">10-013-CV</td>
			<td>4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">10565-042</td>
			<td>high glucose, glutamax, sodium bicarbinate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMSO</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:139px;">Atlanta Biologicals&#160;</td>
			<td style="width:148px;">S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FGF2</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td style="width:148px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">formalin</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">gelatin, bovine skin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G9391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">glutamax</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">35050061</td>
			<td>glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">HBSS</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td style="width:148px;">10-547F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">IBMX</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I5879-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">insulin solution</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Oil red O</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">O0625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">pantothenic acid</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P5155-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">15240062</td>
			<td>100ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">permount</td>
			<td style="width:139px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P4006-100G/221856-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">primocin</td>
			<td style="width:139px;">Invivogen</td>
			<td style="width:148px;">ant-pm-1</td>
			<td>Antimicrobial reagent for culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">rosiglitazone</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">R2408-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">TGFb1</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td style="width:148px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Weigert&#39;s hematoxylin</td>
			<td style="width:139px;">EKI</td>
			<td style="width:148px;">4880-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation capacity of human aortic perivascular adipose progenitor cells

Fettvev er en rik kilde av flere potente mesenchymal stamceller (MSC) i stand til å skille i osteogenic, adipogenic, og chondrogenic linjene. Adipogenic differensiering av stamfar celler er en viktig mekanisme kjøring fettvev utvidelse og dysfunksjon svar til fedme. Forståelse endringer perivascular fettvev (PVAT) er dermed klinisk relevant i metabolsk sykdom. Tidligere studier har imidlertid vært hovedsakelig utført i musen og andre dyr modeller. Denne protokollen bruker thorax PVAT prøver fra mennesker samlet inn fra pasienter som gjennomgår Koronar bypass pode kirurgi. Fettvev fra stigende aorta ble samlet inn og brukt til explantation av pancreatic. Vi tidligere bekreftet tilstedeværelse av adipose progenitor celler i menneskelig PVAT med kapasitet til å skille ut lipid inneholder adipocytter. I denne studien analysert vi videre differensiering potensialet i celler fra pancreatic, antagelig inneholder flere potente progenitor celler. Vi sammenlignet PVAT-avledet celler til human benmarg MSC for differensiering i adipogenic, osteogenic, og chondrogenic linjene. Etter 14 dager av differensiering, bestemte flekker ble benyttet til å oppdage lipid akkumulering i adipocytter (olje røde O), calcific innskudd i osteogenic celler (Alizarin rød), eller glycosaminoglycans og kollagen i chondrogenic celler (Masson's Trichrome). Mens benmargen MSC effektivt differensiert i alle tre linjene, PVAT-avledet celler hadde adipogenic og chondrogenic potensial, men manglet robust osteogenic potensial.

Isolering av pancreatic fra menneskelig PVAT
Figur 1A viser en skjematisk av anatomiske området der PVAT overliggende stigende aorta ble innhentet. Vi beskrev tidligere pasientgrupper gjennomgår Koronar bypass pode som disse prøvene var avledet6. Figur 1B viser et eksempel på den menneskelige PVAT innhentet etter operasjonen....

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells at JoVE.com

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Målet med denne protokollen er å teste muligheten for stamfar celler avledet fra menneskelige perivascular fettvev å skille ut flere celle overleveringslinjer. Differensiering var i forhold til stamceller fra human benmarg, som er kjent for å differensiere i adipocyte, osteocyte og chondrocyte linjene.

Differensiering kapasitet på menneskelig aorta Perivascular liggende under Adipose Progenitor celler

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Perivascular fettvev omgir blodkar og regulerer kardiovaskulær fysiologi. Denne protokollen brukes til å svare på viktige spørsmål knyttet til funksjonen til menneskelige fettstammenn i vaskulær mikromiljø. Fett stamceller varierer i henhold til deres anatomiske plassering.Vi viser at en populasjon av multipotente forfedre kan utledes med hell fra perivascular fettvev fra pasienter med kardiovaskulær sykdom. Å demonstrere prosedyren vil være Spencer Scott, en medisinsk student fra laboratoriet mitt. Få et 500 mg stykke humant perivascular fettvev eller PVAT fra operasjonssalen som beskrevet i tekstprotokollen.Overfør fersk menneskelig PVAT fra DMEM til et 50 milliliter konisk rør som inneholder 25 milliliter antibiotikaoppløsning. Inkuber med gynge i 20 minutter ved fire grader Celsius. Mens PVAT er i antibiotikaløsning, tine en aliquot av dissosiasjon buffer ved 37 grader Celsius.Tilsett 50 mikroliter med 100x antibiotika/antimykotisk oppløsning til fem milliliter dissosiasjonsbuffer og steriliser ved hjelp av et 0,22 mikron sprøytefilter. Tilsett en milliliter gelatinoppløsning til en brønn av en 24-brønns plate. I en laminær strømningshette bruker du sterile tang og saks til å overføre PVAT fra antibiotikaløsningen til en steril petriskål.Tilsett en milliliter forhåndsoppvarmet dissosiasjonsbuffer til vevet. Fin hakke hele vevet i en slurry ved hjelp av sterile tang og disseksjon saks. Overfør en milliliter slurry til fire milliliter dissosiasjonsbuffer.Inkuber røret på siden i en forhåndsoppvarmet 37 grader Celsius orbital shaker på 200 rpm i en time. Etter en time skal ingen synlige vevsstykker være til stede, og løsningen vil vises som en overskyet cellesuspensjon. Filtrer løsningen gjennom et 70 mikron cellesilsett på toppen av et konisk rør på 50 milliliter.Skyll silen med ytterligere 10 milliliter antibiotikaløsning for å fange opp så mange celler som mulig. Ikke klem silen. Pellet cellene i 12 minutter ved 300 ganger g i en svingende bøtte sentrifuge.Etter sentrifugering vil røret bli delt inn i et fett topplag av adipocytter, en interfase og en pellet. Pellet er den stromale vaskulære fraksjonen som inneholder endotelceller, immunceller, blodceller og stamceller. Resuspend pellet i 10 milliliter HBSS og sentrifuge i fem minutter ved 300 ganger g.Gjenta dette trinnet for totalt to vasker i HBSS. Nå aspirerer gelatinen fra en 24-brønns tallerken. Vask brønnen forsiktig én gang med HBSS for å fjerne ubundne gelatin.Resuspend stromal vaskulær fraksjon pellet med intakte røde blodlegemer i en milliliter vekst medium og frø på gelatin-belagt godt. Deretter legger menneskelig FGF2 til en endelig konsentrasjon på 25 nanograms per milliliter i kulturmedium. Inkuber i 24 timer ved 37 grader Celsius med 5%CO2.Etter å ha dyrket cellene i 24 timer, fjern vekstmediet og vask cellene fem ganger med HBSS. Dette vasketrinnet fjerner røde blodlegemer og døde celler. Deretter legge til en milliliter av fersk vekst media supplert med 25 nanograms per milliliter FGF2 til hver brønn.Endre media hver 48 timer sørge for å supplere med 25 nanograms per milliliter frisk FGF2 hver gang. Passage celler når de når 100% samløpet syv til 10 dager etter explant. For å gjøre dette, aspirere vekstmedier og vask monolayer to ganger med en milliliter HBSS.Aspirer alle HBSS fra brønnene og tilsett noen dråper celledissosiasjonsløsning. Trykk og virvle platen flere ganger og inkuber ved 37 grader Celsius med 5% CO2 i fem til syv minutter for å løfte cellene. Tilsett deretter omtrent en milliliter frisk kultur medium til de frittliggende cellene.Fordel 500 mikroliter av de frittliggende cellene til to brønner av en 24-brønnsplate som hver inneholder 500 mikroliter vekstmedier og 25 nanogram FGF2. Også kultur menneskelig benmarg Mesenchymal stamceller eller MSC kolonier som beskrevet i tekstprotokollen. Plate de riktige antall benmarg og PVAT-avledede celler per brønn av en 12-brønn plate.For adipogenic og osteogene forhold, plate ca 200, 000 til 225, 000 celler per brønn. Mens for kondrogene forhold, plate 150, 000 til 175, 000 celler per brønn. Deretter dissosiere celler fra både den menneskelige PVAT stamcellepopulasjonen og den menneskelige benmargen MSC befolkningen ved å legge celle løsrivelse løsning.Inkuber cellene i løsrivelsesløsningen ved 37 grader Celsius og 5% CO2 i fem minutter. Trekk populasjonene inn i separate 15 milliliter koniske hetteglass. Spinn hetteglassene ned på 500 ganger g i syv minutter for å pellet cellene.Deretter bruker cellene på nytt i en milliliter PBS og bruker et hemocytometer for å estimere cellenummeret. Plate cellene i 12-brønnretter som før. Gi separate retter for induserte og ikke-induserte adipogenic og osteogene forhold.Og tilsett 1,5 milliliter av adipogenic og osteogene ledningsmedier til hver brønn av den induserte tilstanden. Tilsett deretter 1,5 milliliter av adipogenic og osteogene ikke-induksjonsmedier til hver brønn av den ikke-induserte tilstanden. Begynn inkubasjon av de adipogenic og osteogene induserte og ikke-induserte cellepopulasjonene ved 37 grader Celsius og 5% CO2.Spinn ned det gjenværende volumet av humane PVAT stamceller og humane benmargs MSCer i syv minutter ved 500 ganger g. Bestem volumet som trengs for å gjenbruke de resterende benmargen og PVAT-avledede cellepellets for å oppnå en tetthet på 100 000 celler per 10 mikroliter. Deretter gjenbruke pellets i beregnet volum av MSC vekstmedier for kondrogen avstamning induksjon.Flytt forsiktig volumet av celler opp og ned ved hjelp av en pipette for å sikre en homogen fordeling. Nå pipette en 10 mikroliter dråpe av konsentrert celle løsning i midten av hver brønn for å danne en mikromasse på 100.000 celler. Legg en milliliter sterilt vann i den tilstøtende brønnen for å forhindre fordampning.Inkuber mikromassekulturene i to timer ved 37 grader Celsius og 5% CO2 for å tillate mikromassen å samle. Etter to timer, nøye legge kondrogen differensiering media spiked med 10 nanograms per milliliter menneskelig TGF-beta-en til hver av de induserte tilstand brønner. Tilsett nå nøye 1,5 milliliter av ikke-induksjonsmediet til de ikke-induserte tilstandsbrønnene.Skrap eller hell mikromassen i den induserte kondrogene tilstanden i en kassett for å dehydrere, bygge inn og flekke prøven som beskrevet i tekstprotokollen. Adipogenic differensieringsstudier ble utført parallelt med humane benmargsavledede MSC- og PVAT-avledede stamceller. I ikke-indusert tilstand er ingen lipidakkumulering tydelig.Dette er i motsetning til den induserte tilstanden som vises etter farging av nøytrale lipider med Oljerød O.Mens graden av differensiering i de menneskelige aorta PVAT-avledede cellene er mer robust, viste begge menneskelige cellekilder evnen til å differensiere for den adipogenic avstamning. Osteogen differensieringsprotokoll ble brukt for humane benmargsavledede MSCer og PVAT-avledede celler. Ikke-induserte celler flekket ikke med Alizarin Red.Etter osteogen differensieringsprotokoll utviklet de menneskelige MSCene forkalkede knuter som farget med Alizarin Red mens humane aorta PVAT-celler ikke gjorde det. Celler avledet fra både menneskelig benmarg MSCer og menneskelig PVAT viste egenskaper som er karakteristiske for kondrogen differensiering med rikelig kollagenakkumulering i mikromassen. Mikromasse er dannet av menneskelige benmarg MSCer og aorta PVAT-avledede celler viste også rikelig akkumulering av glykososaoglykaner som indikert av Alcian Blue farging.Morfologisk ble strukturer som ligner lacunae oppdaget med celler som sitter i hulrom omgitt av kollagendeponering. Det er viktig å fin hakke perivascular fettvev før enzymatisk disassociation og for å sikre riktig celle tettheter er belagt for hver avstamning differensiering analyse. Etter denne prosedyren bør kvantitativ PCR kombinert med vestlig flekk og strømningscytometri brukes til å karakterisere avstamningsspesifikke markører av differensierte forfedre fra perivascular fett- og benmargskilder.Med denne teknikken kan vi begynne å forstå mekanismene som regulerer perivascular fettvevsutvidelse og dysfunksjon under fedme og implikasjonene som stamceller har på vaskulær funksjon og kardiovaskulær sykdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Human Cardiomyocytes: En Differensiering Protokoll fra mater-frie menneskeskapte pluripotent stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Manuell Isolering av adipose-avledet stamceller fra menneske Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Vurdere sekretoriske Kapasitet av bukspyttkjertelen akinærceller

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Vurdering av vaskulær tone respons ved hjelp av isolerte Chrezbryzheechno arterier med fokus på modulering av inflammasjon fettvev

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Hepatisk stamcellespesifikasjon fra pluripotente stamceller ved hjelp av et definert differensieringssystem

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Isolering og anrikning av humane lungeepiteliale stamceller for organoidkultur

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Fremstilling av fett stamceller fra mus epididymal fettvev

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Isolering, proliferasjon og differensiering av Rhesus Macaque fettavledede stamceller

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...