Name: differentiation capacity of human aortic perivascular adipose progenitor cells
Uploaded: 2019-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells at JoVE.com

Мы признаем помощи исследования навигации в Мэн медицинский центр для оказания помощи с закупками клинических ткани, гистопатология и Histomorphometry Core (при поддержке 1P20GM121301, л Liaw PI) в Мэн медицинский центр исследований Институт для разрезания и пятнать. Эта работа была поддержана NIH Грант R01 HL141149 (L. Liaw).

Использование человеческих тканей в этом исследовании был оценены и одобрены организационного обзора Совет от Мэн медицинский центр, и все сотрудники получили соответствующую подготовку до экспериментов.
1. Подготовка
<ol><li>Сделать диссоциации буфера путем воссоздани?...

<ol>
	<li>Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells:+biology+and+potential+applications.">Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).</li><li>Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+as+a+regulator+of+vascular+disease+pathogenesis:+identifying+novel+therapeutic+targets.">Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+adipose+stem+cells.">Differentiation of adipose stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Boucher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27a+Regulates+Human+Perivascular+Adipose+Progenitor+Cell+Differentiation.">Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).</li><li>Nosalski, R., Guzik, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+inflammation+in+vascular+disease.">Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifty+shades+of+white:+Understanding+heterogeneity+in+white+adipose+stem+cells.">Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells.</a> Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).</li><li>de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cells+and+Pericytes:+To+What+Extent+Are+They+Related.">Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related.</a> Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).</li><li>Majesky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitia+and+perivascular+cells.">Adventitia and perivascular cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).</li><li>Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+in+regenerative+medicine.">Adipose tissue stem cells in regenerative medicine.</a> Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).</li><li>Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue-Derived+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine.">Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).</li><li>Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose-derived+stem+cells+as+a+novel+tool+for+future+regenerative+medicine.">Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine.</a> Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Safford, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenic+differentiation+of+murine+and+human+adipose-derived+stromal+cells.">Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).</li><li>Ashjian, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+processed+lipoaspirate+cells+into+early+neural+progenitors.">In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).</li><li>Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFATS+collection:+Using+human+adipose-derived+stem/stromal+cells+for+the+production+of+new+skin+substitutes.">IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes.</a> Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li></ol>

Жировой прогениторных клеток с разных складов различаются в фенотип и дифференциации потенциальных9. Выращивание PVAT-производные прародителей от одного пациента донора в одновременной индукционной вниз три различных линий, адипогенном, остеогенные и хондрогенном, позвол...

Жировой ткани является богатым источником нескольких мощных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) способны дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном линий1. Эта ткань расширяет через гипертрофия адипоцитов зрелой и de novo дифференциация резидентов КБМ адипоцитов. Периваскулярной жировой ткани (PVAT) окружает кровеносных сосудов и регулирует функции сосудистого2,3. Ожирение индуцированной PVAT расширения усугубляет сердечно-сосудистой патологии. Хотя Multipotent с потенциал MSC от человека подкожных жировых депо были хорошо изучены4,5, исследования не описаны и оценены возможности дифференцировки клеток-предшественников человека PVAT-производные, вероятно, из-за инвазивность закупок. Таким образом цель этой работы заключается в обеспечивают методологию для explant и распространять клетки-предшественники из человека PVAT аорты у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями и проверки их склонность различать на остеогенные, хондрогенном и адипогенном линий. Наш источник PVAT — сайт анастомоза шунтирования на восходящей аорты ожирением пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование трансплантата. Свеже изолированные PVAT ферментативно отделить и стромы сосудистой фракции изолированных и распространяются в пробирке, позволяя нам в первый раз проверить возможности дифференциации клеток-предшественников человека PVAT-производные.
С помощью первичных искусственного человека PVAT стромальные сосудистой дроби, мы проверили три анализов, призванных побудить стволовых/прогениторных клеток дифференцировать сторону адипогенном, остеогенные, или хондрогенном линий. Наши предыдущие исследования определили населения CD73 +, CD105 + и PDGFRa + (CD140a) клеток, которые могут надежно дифференцировать в адипоцитов6, хотя их multipotency не был протестирован. PVAT непосредственно регулирует сосудистый тонус и воспаление7. Обоснование для тестирования потенциал дифференциации населения этот роман клеток является чтобы начать понимать специализированные влияние PVAT на сосудистой функции и механизмы расширения PVAT при ожирении. Эта методология расширяет наше понимание функций производным прародителя жировой клетки и позволяет нам определить и сравнить сходства и различия клетки-предшественники из источников различных тканей. Мы строим на установленные и проверенные подходы для изоляции и дифференциации MSC направлении различных линий и оптимизировать процедуры для обеспечения максимальной жизнеспособности клеток-предшественников человека PVAT-производные. Эти методы имеют широкое применение в области стволовых и прогениторных клеток жировой ткани и исследования развития.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">animal-free collagenase/dispase blend I &#160;</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">SCR139</td>
			<td style="width:299px;">50mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Alcian Blue</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1003A</td>
			<td>1% Aqueous solution pH 2.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Alizarin Red</td>
			<td style="width:139px;">Amresco</td>
			<td style="width:148px;">9436-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">alpha-MEM</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">12561056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Aniline Blue</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">10073C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">antibiotic/antimycotic</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Beibrich&#39;s scarlet acid fuchsin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A3908-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">b-glycerophosphate</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G9422-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Biebrich Scarlet</td>
			<td style="width:139px;">EKI</td>
			<td style="width:148px;">2248-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">biotin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Bouin&#39;s fixative</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:139px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:148px;">12659</td>
			<td>stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Cell detachment solution</td>
			<td style="width:139px;">Accutase</td>
			<td style="width:148px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">cell strainer (70mm)</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">dexamethasone</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D4902-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMEM</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">10-013-CV</td>
			<td>4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">10565-042</td>
			<td>high glucose, glutamax, sodium bicarbinate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMSO</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:139px;">Atlanta Biologicals&#160;</td>
			<td style="width:148px;">S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FGF2</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td style="width:148px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">formalin</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">gelatin, bovine skin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G9391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">glutamax</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">35050061</td>
			<td>glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">HBSS</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td style="width:148px;">10-547F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">IBMX</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I5879-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">insulin solution</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Oil red O</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">O0625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">pantothenic acid</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P5155-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">15240062</td>
			<td>100ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">permount</td>
			<td style="width:139px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P4006-100G/221856-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">primocin</td>
			<td style="width:139px;">Invivogen</td>
			<td style="width:148px;">ant-pm-1</td>
			<td>Antimicrobial reagent for culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">rosiglitazone</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">R2408-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">TGFb1</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td style="width:148px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Weigert&#39;s hematoxylin</td>
			<td style="width:139px;">EKI</td>
			<td style="width:148px;">4880-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation capacity of human aortic perivascular adipose progenitor cells

Жировой ткани является богатым источником нескольких мощных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) способны дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном родов. Адипогенном дифференцировки клеток-предшественников является механизмом основных вождения расширения жировой ткани и дисфункции в ответ на ожирение. Таким образом, понимание изменения периваскулярной жировой ткани (PVAT) является клинически значимых метаболических заболеваний. Однако, предыдущие исследования были преимущественно в мыши и других животных моделей. Этот протокол использует человеческой грудной PVAT пробах из пациентов, перенесших аортокоронарное шунтирование трансплантата. Жировой ткани от восходящей части аорты был собирается и используется для эксплантация стромальные сосудистой дроби. Мы ранее подтвердил наличие жировых прогениторных клеток в человека PVAT мощностью дифференцироваться в содержащих липидов адипоцитов. В этом исследовании мы дополнительно проанализировать потенциал дифференцировки клеток стромы сосудистой фракции, предположительно содержащих несколькими мощными прогениторных клеток. Мы сравнили PVAT-производные клеток костного мозга человека MSC для дифференциации в адипогенном, остеогенные и хондрогенном родов. После 14 дней дифференциации, конкретные пятна были использованы для выявления накопление липидов в адипоцитов (масло красный O), calcific месторождения в Остеогенные клетки (ализарин красный), или гликозаминогликанов и коллагена в клетках хондрогенном (Массон в Trichrome). Хотя костного MSC эффективно продифференцировано во всех трех линий, PVAT-производные клетки были адипогенном и хондрогенном потенциал, но не хватает надежных Остеогенные потенциал.

Изоляция стромальные сосудистой дроби от человека PVAT
На рисунке 1A показана схема анатомического региона, где был получен PVAT, обволакивающие восходящей части аорты. Ранее мы описали популяциях пациентов, прохо...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells at JoVE.com

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Цель настоящего Протокола заключается в проверить способность прародитель клетки, полученные из жировой ткани человека периваскулярной дифференцироваться в несколько линий клеток. Дифференциация была по сравнению с мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга человека, который известен дифференцироваться в Адипоцит, остеоциты и хондроцитов линий.

Дифференциация способности человека аорты периваскулярной жировой клетки-предшественники

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Периваскулярная жировая ткань окружает кровеносные сосуды и регулирует сердечно-сосудистую физиологию. Этот протокол используется для ответа на ключевые вопросы, связанные с функцией человеческих жировых прародителей в сосудистой микроокноронности. Клетки-предшественники adipose различаются в зависимости от их анатомического местоположения.Мы показываем, что популяция мультипотентных прародителей может быть успешно получена из периваскулярной жировой ткани у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Демонстрацией процедуры будет Спенсер Скотт, студент-медик из моей лаборатории. Получить 500 миллиграмм кусок человека Perivascular жировой ткани или PVAT из операционной, как описано в текстовом протоколе.Перенесите свежий человеческий PVAT из DMEM в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую 25 миллилитров раствора антибиотиков. Инкубировать с качания в течение 20 минут при четырех градусах по Цельсию. В то время как PVAT находится в растворе антибиотиков, оттепель aliquot буфера диссоциации на 37 градусов по Цельсию.Добавьте 50 микролитров 100-кратного антибиотика/антимикотического раствора в пять миллилитров буфера диссоциации и стерилизовать с помощью фильтра шприца 0,22 микрона. Добавьте один миллилитр желатина раствора в один колодец из 24-хорошо пластины. В ламинарный капюшон потока, использовать стерильные миппы и ножницы для передачи PVAT от антибиотика раствор стерильной чашки Петри.Добавьте в ткань один миллилитр предварительно разогретого буфера диссоциации. Мелко фарш всей ткани в суспензию с использованием стерильных типсов и ножницами вскрытия. Перенесите одноми миллилитровую суспензию на четыре миллилитров буфера диссоциации.Инкубировать трубку на бок в предварительно разогретой 37 градусов по Цельсию орбитальный шейкер при 200 об / мин в течение одного часа. Через час видимых частей ткани присутствовать не должно, и раствор будет отображаться как облачная подвесная клетка. Фильтр раствор через 70 микрон клеток ситечко установить на вершине 50 миллилитров конической трубки.Промыть ситечко с дополнительными 10 миллилитров раствора антибиотика, чтобы захватить как можно больше клеток, как это возможно. Не сжимайте сите ситечко. Теперь гранулы клеток в течение 12 минут при 300 раз г в размахивая центрифуги ведро.После центрифугации трубка будет разделена на жирный верхний слой адипоцитов, интерфазы и гранулы. Гранулы стромальной сосудистой фракции, содержащей эндотелиальные клетки, иммунные клетки, клетки крови и клетки-предшественники. Переусердствойте гранулы в 10 миллилитров HBSS и центрифуги в течение пяти минут при 300 раз г.Повторите этот шаг в общей сложности две стирки в HBSS. Теперь аспирировать желатин из 24-хорошо пластины. Аккуратно мыть хорошо один раз с HBSS для удаления несвего желатина.Resuspend стромальной сосудистой фракции гранулы с нетронутыми красными кровяными клетками в один миллилитр среднего роста и семян на желатин покрытием хорошо. Затем добавьте FGF2 человека к окончательной концентрации 25 нанограмм на миллилитр в среде культуры. Инкубировать в течение 24 часов при 37 градусах по Цельсию с 5%CO2.После роста клеток в течение 24 часов, удалить рост средств массовой информации и мыть клетки пять раз с HBSS. Этот шаг стирки удаляет красные кровяные тельца и мертвые клетки. Затем добавьте один миллилитр свежих средств роста, дополненный 25 нанограммами на миллилитр FGF2 к каждой хорошо.Изменение средств массовой информации каждые 48 часов убедившись, что дополнить 25 нанограмм на миллилитр свежих FGF2 каждый раз. Проходные клетки, как только они достигают 100% слияния от семи до 10 дней после экспланта. Для этого аспирируют средства роста и мыть монослой дважды одним миллилитровым HBSS.Аспирировать все HBSS из скважин и добавить несколько капель раствора диссоциации клеток. Нажмите и вихрем пластины несколько раз и инкубировать при 37 градусов по Цельсию с 5%CO2 в течение пяти-семи минут, чтобы поднять клетки. Затем добавьте приблизительно один миллилитр свежей среды культуры к отделенным клеткам.Распределим 500 микролитров отдельных клеток на две скважины из 24-колодцев, каждая из которых содержит 500 микролитров средств роста и 25 нанограмм FGF2. Кроме того, культура человеческого костного мозга Мезенхимальные стволовые клетки или MSC колоний, как описано в текстовом протоколе. Плита соответствующие номера костного мозга и PVAT-производных клеток на колодец 12-хорошо пластины.Для адипогенных и остеогенных состояний, пластины примерно 200 000 до 225 000 клеток на колодец. В то время как для хондрогенных условий, пластины 150000 до 175000 клеток на колодец. Затем отмежевать клетки как от популяции клеток-предшественников человека PVAT, так и от популяции MSC костного мозга человека, добавляя раствор клеточного отслоения.Инкубировать клетки в растворе отслоения при 37 градусах Цельсия и 5%CO2 в течение пяти минут. Потяните популяции в отдельные 15 миллилитровых конических флаконов. Спин флаконы вниз на 500 раз g в течение семи минут, чтобы гранулы клеток.Затем повторное использование клеток в один миллилитр PBS и использовать гемоцитометр для оценки числа клеток. Плита клетки в 12-хорошо блюда, как и раньше. Обеспечить отдельные блюда для индуцированных и не индуцированных адипогенных и остеогенных условиях.И добавить 1,5 миллилитров адипогенных и остеогенных средств проводимой к каждой колодец индуцированного состояния. Затем добавьте 1,5 миллилитров адипогенных и остеогенных неиндукционных средств к каждому колодец неиндуцированных состояний. Начните инкубацию адипогенных и остеогенных индуцированных и неиндуцированных популяций клеток при 37 градусах Цельсия и 5%CO2.Спин вниз оставшийся объем человеческих клеток-предшественников PVAT и человеческого костного мозга MSCs в течение семи минут в 500 раз г. Определите объем, необходимый для повторного перерасхода оставшегося костного мозга и гранул клеток, полученных из PVAT, для достижения плотности 100 000 клеток на 10 микролитров. Затем повторное использование гранул в расчетном объеме средств роста MSC для индукции хондрогенной линии.Аккуратно переместите объем ячеек вверх и вниз с помощью пипетки, чтобы обеспечить однородное распределение. Теперь пипетка 10 микролитров капли концентрированного клеточного раствора в центре каждой хорошо, чтобы сформировать микро-массу 100000 клеток. Поместите один миллилитр стерильной воды в соседний колодец, чтобы предотвратить испарение.Инкубировать микро-массы культур в течение двух часов при 37 градусов по Цельсию и 5%CO2, чтобы микро-массы для агрегирования. Через два часа, тщательно добавить хондрогенной дифференциации средств массовой информации шипами с 10 нанограмм на миллилитр человека TGF-бета-один к каждому из индуцированных состояния скважин. Теперь аккуратно добавьте 1,5 миллилитров неиндукционных средств к неиндуцированным состояниям скважин.Очистить или залить микро-массу в индуцированном хондрогенном состоянии в кассету, чтобы обезвоживать, вставлять и окрашивать образец, описанный в текстовом протоколе. Исследования адипогенной дифференциации проводились параллельно с клетками-предшественниками, полученными из костного мозга человека, и клетками-предшественниками, полученными из PVAT. В неиндуцированных условиях, нет накопления липидов очевидна.Это в отличие от индуцированного состояния показано после окрашивания нейтральных липидов с маслом красный O.While степень дифференциации в человеческой аорты PVAT полученных клеток является более надежным, как человеческие источники клеток продемонстрировали способность дифференцировать для адипогенической линии. Протокол остеогенной дифференциации использовался для клеток, полученных из костного мозга человека, и клеток, полученных из ПВАТ. Неинндуцированные клетки не окрашивали Алисарин Красный.После протокола остеогенной дифференциации, человеческие MSCs разработали кальцифицированные узелки, которые окрашены Alizarin Красный в то время как человеческие клетки аорты PVAT не сделал. Клетки, полученные как из человеческого костного мозга MSCs и человека PVAT отображается особенности, характерные для хондрогенной дифференциации с обильным накоплением коллагена в микро-массы. Микро масса образуется из человеческого костного мозга MSCs и аорты PVAT полученных клеток также выставлены обильное накопление гликозаминогликканов, как указано на Alcian Blue окрашивания.Морфологически структуры, похожие на лакуны, были обнаружены с клетками, сидящими в полости, окруженные осаждением коллагена. Очень важно, чтобы мелко фарш периваскулярной жировой ткани до энзиматической диссоциации и обеспечить надлежащее плотность клеток помылись для каждой линии дифференциации анализа. После этой процедуры, количественные ПЦР в сочетании с западной помарки и цитометрии потока должны быть использованы для характеристики линии конкретных маркеров дифференцированных прародителей из периваскулярных жировой и костного мозга источников.С помощью этого метода, мы можем начать понимать механизмы, регулирующие перивазкулярного расширения жировой ткани и дисфункции во время ожирения и последствия, которые клетки-предшественники имеют на сосудистой функции и сердечно-сосудистых заболеваний.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Выделение и расширение добычи взрослых человеческих эндотелиальных клеток, образующих колонии Прародитель

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Дифференциация эмбриональных стволовых клеток в олигодендроцитов прекурсоров

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Поколению прав кардиомиоцитов: Дифференциация Протокол от Ф-свободной человеческой индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Руководство Выделение полученные из жировой ткани стволовые клетки из человека Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Оценивая секреторную способность ацинарных клетках поджелудочной железы

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Оценка сосудистого тонуса реагирования с использованием изолированных Мезебарных артерий с акцентом на модуляции Периваскулярных жировых тканей

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Спецификация печеночного прародителя из плюрипотентных стволовых клеток с использованием определенной системы дифференцировки

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Выделение и обогащение эпителиальных клеток-предшественников легких человека для органоидной культуры

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Подготовка адипозы Клетки-предшественники из мыши Эпидидимальные жировые ткани

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Выделение, пролиферация и дифференциация стволовых клеток, полученных из адипозы макаки-резуса

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...