Name: differentiation capacity of human aortic perivascular adipose progenitor cells
Uploaded: 2019-03-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells at JoVE.com

Vi erkänner stöd av forskning navigering på Maine Medical Center för att bistå med upphandling av kliniska vävnad, och histopatologi och Histomorphometry kärna (stöds av 1P20GM121301, L. Liaw PI) på Maine Medical Center forskning Institutet för snittning och färgning. Detta arbete stöds av NIH bevilja R01 HL141149 (L. Liaw).

Användningen av mänskliga vävnader i denna studie var utvärderats och godkänts av institutionella i styrelsen av Maine Medical Center, och all personal fått lämplig utbildning före experiment.
1. förberedelser
<ol><li>Gör dissociation buffert genom beredning av 50 mg djurfria kollagenas/dispase blandning jag lösning med 1 mL nanopure H2O. förbereda 1 mg/mL arbetslösning genom att tillsätta höga glukos DMEM som innehåller 1% w/v BSA till den rekonstituerade kollagen...

<ol>
	<li>Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+mesenchymal+stem+cells:+biology+and+potential+applications.">Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).</li><li>Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+as+a+regulator+of+vascular+disease+pathogenesis:+identifying+novel+therapeutic+targets.">Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).</li><li>Brown, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+in+vascular+function+and+disease:+a+review+of+current+research+and+animal+models.">Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).</li><li>Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+adipose+stem+cells.">Differentiation of adipose stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Boucher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab27a+Regulates+Human+Perivascular+Adipose+Progenitor+Cell+Differentiation.">Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).</li><li>Nosalski, R., Guzik, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+adipose+tissue+inflammation+in+vascular+disease.">Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).</li><li>Nadri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+method+for+isolation+of+murine+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells.">An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells.</a> The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).</li><li>Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fifty+shades+of+white:+Understanding+heterogeneity+in+white+adipose+stem+cells.">Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells.</a> Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).</li><li>de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Stem+Cells+and+Pericytes:+To+What+Extent+Are+They+Related.">Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related.</a> Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).</li><li>Majesky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitia+and+perivascular+cells.">Adventitia and perivascular cells.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).</li><li>Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+stem+cells+in+regenerative+medicine.">Adipose tissue stem cells in regenerative medicine.</a> Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).</li><li>Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue-Derived+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine.">Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).</li><li>Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Adipose-derived+stem+cells+as+a+novel+tool+for+future+regenerative+medicine.">Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine.</a> Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue:+implications+for+cell-based+therapies.">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li><li>Safford, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenic+differentiation+of+murine+and+human+adipose-derived+stromal+cells.">Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).</li><li>Ashjian, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+human+processed+lipoaspirate+cells+into+early+neural+progenitors.">In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).</li><li>Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFATS+collection:+Using+human+adipose-derived+stem/stromal+cells+for+the+production+of+new+skin+substitutes.">IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes.</a> Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).</li><li>Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+and+Adipogenesis+Induction+of+Adipocyte+Progenitors+from+Perivascular+Adipose+Tissue+Isolated+by+Magnetic+Activated+Cell+Sorting.">Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).</li></ol>

Fett stamceller från olika depåer varierar kraftigt i fenotyp och differentiering potentiella9. Odling PVAT-derived stamfäder från en enda patient donator i samtidiga induktion ner tre olika härstamningar, möjliggör adipogena, osteogena, och chondrogenic, en väl kontrollerad undersökning av denna roman pluripotenta kapacitet befolkningen av stamceller. Den metod som beskrivs i denna rapport kan användas för att testa kapaciteten differentiering av stamceller från mänskliga PVAT och f?...

Fettväv är en rik källa av flera potenta mesenkymala stamceller (MSC) kan differentiera till osteogent, adipogena, och chondrogenic härstamningar1. Denna vävnad expanderar genom hypertrofi av mogen adipocyter och de novo differentiering av bosatta MSC till adipocyter. Perivaskulär fettväv (PVAT) omger blodkärl och reglerar vaskulär funktion2,3. Fetma-inducerad PVAT expansion förvärrar kardiovaskulära patologier. Medan Multipotenta potentialen hos MSC från mänskliga subkutana fett depåer har varit studerade4,5, har inga studier explanterad och utvärderas differentiering kapaciteten av mänsklig PVAT-derived stamceller, sannolikt på grund invasivitet av upphandling. Målet med detta arbete är således att tillhandahålla metoder att explant och propagera stamceller från mänskliga aorta PVAT från patienter med hjärtkärlsjukdom och testa deras benägenhet att differentiera till osteogent, chondrogenic och adipogena härstamningar. Våra PVAT kommer från platsen för anastomos av bypass transplantat på stigande aorta av överviktiga patienter som genomgick koronar bypass kirurgi. Färsk-isolerad PVAT är enzymatiskt-differentierade och stromal vaskulär fraktionen är isolerade och förökade in vitro gör det möjligt för oss att testa för första gången differentiering kapaciteten av mänsklig PVAT-derived stamceller.
Med primära odlade mänskliga PVAT stromal vaskulär bråkdel, testade vi tre analyser för att inducera stamceller/stamceller att differentiera mot adipogena, osteogena, eller chondrogenic härstamningar. Vår tidigare studie identifierat en befolkning på CD73 +, CD105 + och PDGFRa + (CD140a)-celler som kraftfullt kan skilja i adipocyter6, även om deras multipotency inte testades. PVAT reglerar direkt vaskulär tonen och inflammation7. Grunden för testning differentiering potentialen i denna roman cell befolkningen är att börja förstå specialiserade påverkan av PVAT på vaskulär funktion och mekanismer för PVAT expansion under fetma. Denna metod ökar vår förståelse för funktionerna av fettvävnad härledda stamceller och gör det möjligt för oss att identifiera och jämföra likheter och skillnader av stamceller från olika vävnad källor. Vi bygger på etablerade och validerade metoder för isolering och differentiera MSC mot olika härstamningar och optimera procedurer för att maximera lönsamheten för mänskliga PVAT-derived stamceller. Dessa tekniker har bred applikationer i fälten av stammen och progenitor cell forskning och fettvävnad utveckling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:884px;" width="884">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">animal-free collagenase/dispase blend I &#160;</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">SCR139</td>
			<td style="width:299px;">50mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Alcian Blue</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1003A</td>
			<td>1% Aqueous solution pH 2.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Alizarin Red</td>
			<td style="width:139px;">Amresco</td>
			<td style="width:148px;">9436-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">alpha-MEM</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">12561056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Aniline Blue</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">10073C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">antibiotic/antimycotic</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Beibrich&#39;s scarlet acid fuchsin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">A3908-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">b-glycerophosphate</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G9422-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Biebrich Scarlet</td>
			<td style="width:139px;">EKI</td>
			<td style="width:148px;">2248-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">biotin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Bouin&#39;s fixative</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1020A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:139px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:148px;">12659</td>
			<td>stored at 4C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Cell detachment solution</td>
			<td style="width:139px;">Accutase</td>
			<td style="width:148px;">AT104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">cell strainer (70mm)</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">dexamethasone</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D4902-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMEM</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td style="width:148px;">10-013-CV</td>
			<td>4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">10565-042</td>
			<td>high glucose, glutamax, sodium bicarbinate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">DMSO</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:139px;">Atlanta Biologicals&#160;</td>
			<td style="width:148px;">S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">FGF2</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td style="width:148px;">100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">formalin</td>
			<td style="width:139px;">NewComerSupply</td>
			<td style="width:148px;">1090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">gelatin, bovine skin</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">G9391-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">glutamax</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">35050061</td>
			<td>glutamine supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">HBSS</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td style="width:148px;">10-547F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">IBMX</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I5879-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">insulin solution</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Oil red O</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">O0625-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">pantothenic acid</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P5155-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">penicillin-streptomycin solution</td>
			<td style="width:139px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:148px;">15240062</td>
			<td>100ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">permount</td>
			<td style="width:139px;">Fisher</td>
			<td style="width:148px;">SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:299px;">phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">P4006-100G/221856-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">primocin</td>
			<td style="width:139px;">Invivogen</td>
			<td style="width:148px;">ant-pm-1</td>
			<td>Antimicrobial reagent for culture media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">rosiglitazone</td>
			<td style="width:139px;">Millipore-Sigma</td>
			<td style="width:148px;">R2408-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">TGFb1</td>
			<td style="width:139px;">Peprotech</td>
			<td style="width:148px;">100-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:299px;">Weigert&#39;s hematoxylin</td>
			<td style="width:139px;">EKI</td>
			<td style="width:148px;">4880-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation capacity of human aortic perivascular adipose progenitor cells

Fettväv är en rik källa av flera potenta mesenkymala stamceller (MSC) kan differentiera till osteogent, adipogena, och chondrogenic härstamningar. Adipogena differentiering av stamceller är en viktig mekanism körning adipose vävnadsexpansion och dysfunktion i svar till fetma. Förståelse ändringar perivaskulär fettvävnad (PVAT) är alltså kliniskt relevanta i metabola sjukdomar. Tidigare studier har dock huvudsakligen utförs i musen och andra djur modeller. Detta protokoll använder mänskliga bröstkorg PVAT prover som samlats in från patienter som genomgick koronar bypass kirurgi. Fettvävnad från aorta ascendens var samlas och används för explantation av stromal vaskulär fraktionen. Vi tidigare bekräftat förekomsten av fett stamceller i mänskliga PVAT med förmåga att differentieras till lipid-innehållande adipocyter. I denna studie analyserade vi ytterligare differentiering potential celler från den stromal vaskulära fraktionen, som förmodligen innehåller flera potenta stamceller. Vi jämförde PVAT-derived celler till mänsklig benmärg MSC för differentiering in adipogena, osteogena, och chondrogenic härstamningar. Efter 14 dagar av differentiering, utnyttjades specifika fläckar för att upptäcka lipid ackumulering i adipocyter (olja röd O), förkalkade inlåning i osteogena celler (Alizarin Red), eller glykosaminoglykaner och kollagen i chondrogenic celler (Masson's Trichrome). Samtidigt benmärg MSC effektivt differentieras efter alla tre härstamningar, PVAT-derived celler hade adipogena och chondrogenic potentiella, men saknade robust osteogent potential.

Isolering av stromal vaskulär fraktionen från mänskliga PVAT
Figur 1A visar en Schematisk bild av anatomiska regionen där den PVAT överliggande aorta ascendens erhölls. Vi beskrev tidigare de patientgrupper som genomgick koronar bypass ympning som dessa prover var härledda6. Figur 1B visar ett exempel på den mänskliga PV...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells at JoVE.com

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Målet med detta protokoll är att testa stamceller som härrör från mänskliga perivaskulär fettvävnad förmåga att differentieras till flera cell härstamningar. Differentiering jämfördes mesenkymala stamceller som härrör från human benmärg, som är känd att differentieras till fettceller, osteocyte och chondrocyte härstamningar.

Differentiering kapacitet av mänskliga aorta perivaskulär Adipose stamceller

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Perivaskulär fettvävnad omger blodkärlen och reglerar kardiovaskulär fysiologi. Detta protokoll används för att besvara viktiga frågor som rör funktionen hos mänskliga adipose progenitors i den vaskulära mikromiljö. Adipose progenitor celler varierar enligt deras anatomiska plats.Vi visar att en population av multipotenta progenitors kan härledas framgångsrikt från perivaskulära fettvävnad från patienter med hjärt-kärlsjukdom. Demonstrerar proceduren blir Spencer Scott, en läkarstudent från mitt laboratorium. Skaffa en 500 milligram bit human perivaskulär Fettvävnad eller PVAT från operationssalen som beskrivs i textprotokollet.Överför färskt humant PVAT från DMEM till ett koniskt rör på 50 milliliter som innehåller 25 milliliter antibiotikalösning. Inkubera med gunga i 20 minuter vid fyra grader Celsius. Medan PVAT är i antibiotikalösning, tina en alikvot av dissociation buffert vid 37 grader Celsius.Tillsätt 50 mikroliter 100x antibiotika/antimykotisk lösning till fem milliliter dissociationsbuffert och sterilisera med hjälp av ett 0,22 mikronsprutfilter. Tillsätt en milliliter gelatinlösning till en brunn av en 24-brunnsplatta. I en laminär flödeshuva, använd sterila tlys och sax för att överföra PVAT från antibiotikalösningen till en steril Petriskål.Tillsätt en milliliter förvuppverad dissociationsbuffert till vävnaden. Finhacka hela vävnaden till en slurry med hjälp av sterila kraftplysslingar och dissekering sax. Överför en milliliterslammry till fyra milliliter dissociationsbuffert.Inkubera röret på sin sida i en förvörd 37 grader Celsius orbital shaker på 200 rpm i en timme. Efter en timme bör inga synliga vävnadsbitar vara närvarande och lösningen kommer att visas som en grumlig cell suspension. Filtrera lösningen genom en 70 mikron cell sil som ovanpå en 50 milliliter koniska röret.Skölj silen med ytterligare 10 milliliter antibiotikalösning för att fånga upp så många celler som möjligt. Kläm inte silen. Nu pellet cellerna i 12 minuter vid 300 gånger g i en svängande hink centrifug.Efter centrifugeringen kommer röret att separeras till ett fett toppskikt av adipocyter, en interfas och en pellet. Pelleten är den stromala kärlfraktionen som innehåller endotelceller, immunceller, blodkroppar och progenitorceller. Resuspend pelleten i 10 milliliter av HBSS och centrifug i fem minuter vid 300 gånger g.Upprepa detta steg för totalt två tvättar i HBSS. Nu aspirera gelatinet från en 24-brunnsplatta. Tvätta försiktigt brunnen en gång med HBSS för att avlägsna obundet gelatin.Resuspend den stromala kärlfraktionen pellet med intakta röda blodkroppar i en milliliter av tillväxt medium och utsäde på gelatin-belagda väl. Lägg sedan till mänskliga FGF2 till en slutlig koncentration av 25 nanogram per milliliter i odlingsmedium. Inkubera i 24 timmar vid 37 grader Celsius med 5%CO2.Efter odling av cellerna i 24 timmar, ta bort tillväxtmedia och tvätta cellerna fem gånger med HBSS. Denna tvättsteg avlägsnar röda blodkroppar och döda celler. Tillsätt sedan en milliliter färsk tillväxt media kompletteras med 25 nanogram per milliliter FGF2 till varje brunn.Ändra media var 48 timmar att se till att komplettera med 25 nanogram per milliliter färsk FGF2 varje gång. Passageceller när de når 100%sammanflödet sju till 10 dagar efter explant. För att göra detta, aspirera tillväxtmedia och tvätta monolayern två gånger med en milliliter HBSS.Aspirera alla HBSS från brunnarna och tillsätt några droppar cell dissociation lösning. Knacka och snurra plattan flera gånger och inkubera i 37 grader Celsius med 5%CO2 i fem till sju minuter för att lyfta cellerna. Tillsätt sedan ungefär en milliliter färskt odlingsmedium till de fristående cellerna.Fördela 500 mikroliter av de fristående cellerna till två brunnar av en 24-brunnsplatta som vardera innehåller 500 mikroliter tillväxtmedier och 25 nanogram FGF2. Även kultur mänskliga benmärg Mesenchymala Stamceller eller MSC kolonier som beskrivs i textprotokollet. Platta lämpliga nummer av benmärg och PVAT-härledda celler per brunn av en 12-brunnsplatta.För adipogena och osteogena tillstånd, platta cirka 200, 000 till 225, 000 celler per brunn. Medan för chondrogenic villkor, platta 150, 000 till 175, 000 celler per brunn. Sedan dissociate celler från både den mänskliga PVAT stamcellspopulationen och den mänskliga benmärgen MSC befolkningen genom att lägga till cellavlossning lösning.Inkubera cellerna i lossningslösningen vid 37 grader Celsius och 5%CO2 i fem minuter. Dra in populationerna i separata 15 milliliter koniska injektionsflaska. Snurra injektionsflaskan nedåt med 500 gånger g i sju minuter för att pelleta cellerna.Sedan resuspend cellerna i en milliliter av PBS och använda en hemocytometer för att uppskatta cellen antalet. Tallrik cellerna i 12-brunnsrätter som tidigare. Tillhandahålla separata rätter för de inducerade och icke-inducerade adipogena och osteogena tillstånden.Och lägg 1,5 milliliter av adipogenic och osteogenic ledningsmedia till varje brunn av inducerad villkoret. Tillsätt sedan 1,5 milliliter av adipogenic och osteogenic icke-induktionsmedia till varje brunn av icke-inducerad skick. Påbörja inkubation av de adipogenic och osteogenic inducerad och icke-inducerad cell populationer vid 37 grader Celsius och 5%CO2.Snurra ner den återstående volymen av mänskliga PVAT progenitor celler och mänskliga benmärg MSCs i sju minuter vid 500 gånger g. Bestäm den volym som behövs för att återanvända den återstående benmärgen och PVAT-härledda cellpellets för att uppnå en densitet på 100, 000 celler per 10 mikroliter. Sedan resuspend pellets i den beräknade volymen av MSC tillväxt media för chondrogenic härstamning induktion.Flytta försiktigt cellernas volym uppåt och nedåt med hjälp av en pipett för att säkerställa en homogen fördelning. Nu pipetter en 10 mikroliter droppe av den koncentrerade celllösningen i mitten av varje brunn för att bilda en mikromassa på 100, 000 celler. Placera en milliliter sterilt vatten i den intilliggande brunnen för att förhindra avdunstning.Inkubera mikromassakulturerna i två timmar vid 37 grader Celsius och 5%CO2 så att mikromassan kan aggregera. Efter två timmar, noggrant lägga chondrogenic differentiering media spetsade med 10 nanogram per milliliter mänskliga TGF-beta-en till var och en av de inducerade villkor brunnar. Nu noggrant lägga 1,5 milliliter av icke-induktionsmedia till icke-inducerad tillstånd brunnar.Skrapa eller häll mikromassan i det inducerade kondrogena tillståndet i en kassett för att dehydrera, bädda in och färga provet enligt beskrivningen i textprotokollet. Adipogenic differentiering studier utfördes parallellt med mänskliga benmärg-härledda MSC och PVAT-härledda stamceller. I det icke-inducerade villkoret är ingen lipid ackumulering uppenbart.Detta är i motsats till det inducerade tillstånd som visas efter färgning av neutrala lipider med Oil Red O.Medan graden av differentiering i de mänskliga aorta PVAT-härledda cellerna är mer robust, uppvisade både mänskliga cellkällor förmågan att differentiera för den adipogenic härstamning. Osteogenic differentiering protokollet användes för mänskliga benmärg-härledda MSCs och PVAT-härledda celler. Icke-inducerade celler fläckade inte med Alizarin Red.Efter osteogenic differentiering protokollet, de mänskliga MSCs utvecklat calcified härdarna som färgas med Alizarin Red medan mänskliga aortic PVAT celler inte. Celler som härrör från både mänskliga benmärg MSCs och mänskliga PVAT visas funktioner som kännetecknar chondrogenic differentiering med riklig kollagen ackumulering i mikro massan. Mikro massa bildas från mänskliga benmärg MSCs och kolorat PVAT-härledda celler uppvisade också riklig ansamling av glykosaminoglykaner som anges av Alcian Blue färgning.Morfologiskt, strukturer som liknar lacunae upptäcktes med celler som sitter i håligheter omgiven av kollagen nedfall. det är kritiskt att finhacka perivascular fettvävnad före enzymatisk disassociation och för att säkerställa korrekt cellen tätheter är pläterade för varje härstamning differentiering assay. Efter detta förfarande bör kvantitativa PCR kombinerat med västra blot och flöde cytometry användas för att karakterisera härstamning-specifika markörer av differentierade progenitors från perivascular fett och benmärg källor.Med denna teknik kan vi börja förstå de mekanismer som reglerar perivaskulära fettvävnad expansion och dysfunktion under fetma och de konsekvenser som progenitor celler har på vaskulär funktion och hjärt-kärlsjukdom.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Isolering och storskalig expansion av vuxen människa Endothelial kolonibildande progenitorceller

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiering av embryonala stamceller till Oligodendrocyte Prekursorer

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generering av Human Cardiomyocytes: differentiering protokoll från Feeder-fria mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Manuell Isolering av Fett-härledda stamceller från mänskliga Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

Bedöma Sekretorisk Kapacitet på bukspottskörteln acinarceller

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Bedömning av vaskulär tonen respons med isolerade mesenteric artärer med fokus på modulering av perivaskulär adipose vävnader

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Leverprogenitorspecifikation från pluripotenta stamceller med hjälp av ett definierat differentieringssystem

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Isolering och anrikning av humana lungepitelceller för organoidkultur

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Beredning av fett stamceller från mus epididymal fettvävnader

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Isolering, spridning och differentiering av Rhesus macaque fett-härledda stamceller

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...