Name: evaluation of keratinocyte proliferation on two- and three-dimensional type i collagen substrates
Uploaded: 2019-04-22T15:00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates at JoVE.com

Wij zijn dankbaar aan Dr. K. Sekiguchi (Instituut voor eiwit Research, Osaka University), Dr. M. Yamada (Instituut voor eiwit Research, Osaka University), Dr. T. Ikejima (China-Japan onderzoek instituut van medische en farmaceutische wetenschappen, Wuya College van Innovatie, Shenyang farmaceutische Universiteit) en T. Hayashi (China-Japan onderzoek instituut van medische en farmaceutische wetenschappen, Wuya College van innovatie, Shenyang farmaceutische Universiteit) voor nuttige opmerkingen.

1. bereiding van Keratinocyt kweekmedium
Opmerking: Voer alle procedures onder aseptische condities.
<ol><li>Voeg 5 mL penicilline-streptomycine en 10 mL van additieve aanvulling K-1 op 500 mL van K110 Type-II-medium (K110) met behulp van een precisiepipet.</li>
</ol>2. voorbereiding van de fibril vorm van controletype I collageen
Opmerking: Voer procedures tot stap 2.6 onder aseptische condities.
<ol><li>Houd 10 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS (-)), gedeïoniseerd water, collageen, een cultuur van de 96-wells-plaat en een lege 2 mL-buis op ijs. Opmerking: Gebruik niet de dezelfde plaat ter voorbereiding van de fibril en niet-vezelachtige vormen.</li>
	<li>1,12 mL gedeïoniseerd water toevoegen aan een lege 2 mL-buis met behulp van een precisiepipet. Voeg 200 µL van 10 x PBS (-) aan het gedeïoniseerd water in de buis van de 2 mL met behulp van een precisiepipet. Voorzichtig schudden de buis meerdere malen.</li>
	<li>Voeg 0,66 mL collageen aan de 2 mL-buis met behulp van een precisiepipet. Zacht en snel schudden de buis meerdere malen. Opmerking: Vermijd luchtbel vorming in de oplossing zo veel mogelijk. Bereid collageen oplossing onmiddellijk voorafgaand aan het gebruiken.</li>
	<li>Giet 100 µL van de collageen-oplossing van stap 2.3 in elk putje van de cultuur van de 96-wells-plaat. Zachtjes schud de plaat van de cultuur in een links naar de juiste beweging. Opmerking: Betrekking hebben op het gehele oppervlak van de putjes met de collageen-oplossing. Als de oplossing heeft geen betrekking op het gehele oppervlak, verspreiden de oplossing met behulp van een pipet tip. Bubble vorming in de oplossing zo veel mogelijk te vermijden.</li>
	<li>Plaats de plaat van de cultuur in een incubator van CO2 en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 h. Check de gelering van collageen en de cultuur-plaat naar een schone bankje. Opmerking: Bevestigen gelering door het kantelen van de cultuur-plaat.</li>
	<li>Giet voorzichtig 150 µL van K110 op de gels met behulp van een precisiepipet langs de muur van de waterput, plaats de cultuur plaat in een incubator van CO2 en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 h. verhuizing de cultuur plaat naar een schone bankje. Voorafgaand aan de cultuur van de cel, zachtjes negeren de K110 met behulp van een precisiepipet. Opmerking: Om te beschermen de gels, het uiteinde van de pipet moet raken de muur van de waterput.</li>
</ol>3. voorbereiding van de niet-vezelig vorm van controletype I collageen
Opmerking: Voer alle procedures onder aseptische condities.
<ol><li>Voeg 4 µL van collageen tot 1,2 mL 1 mM zoutzuur (HCl) in een tube van 1,5 mL en meng voorzichtig met behulp van een precisiepipet. Opmerking: Bereiden collageen onmiddellijk voorafgaand aan het gebruiken. Houd collageen en HCl gekoeld tot het tijdstip van gebruik.</li>
	<li>Giet 100 µL van collageen in ieder putje van een cultuur van de 96-wells-plaat met behulp van een precisiepipet. Zachtjes schud de plaat van de cultuur in een links naar rechts beweging en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Opmerking: Zorg ervoor dat het gehele oppervlak van de putten met de oplossing bedekt is.</li>
	<li>Na de incubatie, negeren de collageen-oplossing en was de putjes met PBS (-) tweemaal met behulp van een precisiepipet.</li>
	<li>Pour 150 µL van 1% boviene serum albumine/PBS (-) (1% BSA) aan een putje van de cultuur van de 96-wells-plaat en Incubeer bij kamertemperatuur voor 1 h. voorafgaand aan de celcultuur, negeren de 1% BSA. Opmerking: Zorg ervoor dat het gehele oppervlak van de putten met de oplossing bedekt is.</li>
</ol>4. cultuur van FEPE1L-8 cellen
Opmerking: Voer alle procedures onder aseptische condities.
<ol><li>FEPE1L-8 cellen in K110 in een 100 mm cultuur schotel in een incubator van CO2 en geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO2, semi-confluency handhaven.</li>
	<li>Bereiden van K110, trypsine en trypsine remmer in een waterbad bij 37 ° C.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig het medium van de cultuur-schotel, voeg 3 mL 0,05% trypsine met behulp van een precisiepipet, zet de schotel in een incubator van CO2 en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Controleer na incubatie, mobiele-detachement van het oppervlak van de cultuur-schotel met fase contrast microscopie bij 10 x vergroting. Opmerking: De morfologie van de vrijstaande cellen wordt ronde. Als de cellen verspreiden, Incubeer gedurende een aanvullende periode van 5 min.</li>
	<li>Voeg 3 mL trypsine-remmer en het verzamelen van de vrijstaande cellen in een tube van 15 mL centrifuge met behulp van een precisiepipet. Centrifugeer de cellen in een centrifugebuis 15 mL bij 200 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 mL K110 met behulp van een precisiepipet. Met behulp van microscopie fase contrast bij 10 x vergroting cellen tellen en cel concentratie op 5.0 x 104 cellen/mL te bereiden door aangewezen verdunning met K110.</li>
	<li>Zachtjes zaad 0,1 mL K110 met cellen in elk putje van de plaat van de cultuur met behulp van een precisiepipet langs de muur van de waterput. Plaats de plaat van de cultuur in een incubator van CO2 en Incubeer bij 37 ° C gedurende de aangegeven tijd (2 h, 1 dag, 3 dagen). Opmerking: Om te beschermen de gels, het uiteinde van de pipet moet raken de muur van de waterput.</li>
</ol>5. de schatting van het aantal levensvatbare cellen
<ol><li>Incubeer K110 in een waterbad bij 37 ° C. Mix 130 µL van tetrazolium zout, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, mononatriumzout (WST-8) en K110 in een 2-mL-buis met behulp van een precisiepipet 1.3 aantal milliliters.</li>
	<li>De cultuur-plaat naar een schone bankje en zachtjes negeren de K110 met behulp van een precisiepipet. Zachtjes wegwassen niet-aanhanger cellen met K110 door met behulp van een precisiepipet</li>
	<li>Voeg 110 µL van K110 vermengd met WST-8 in elke goed met behulp van een precisiepipet, plaats van de cultuur-plaat in een incubator van CO2 en Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur.</li>
	<li>De cultuur-plaat naar een schone bankje, 100 µL van het geconditioneerde medium verzamelen van elk putje en verplaatsen in een putje van een andere cultuur van de 96-wells-plaat. Meet de extinctie bij een golflengte van 450 nm (OD450) met behulp van een microplate reader en de schatting van het aantal levensvatbare cellen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kanta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+as+a+tool+in+studying+fibroblastic+cell+behavior.">Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 9 (4), 308-316 (2015).</li><li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+adhesion+to+collagen+substrates.">Fibroblast adhesion to collagen substrates.</a> Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).</li><li>Kleinman, H. K., Haralsonand, M. A., Hassell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+extracellular+matrix+and+its+components+in+culture.">Use of extracellular matrix and its components in culture.</a> Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. , 289-301 (1995).</li><li>Yamato, M., Hayashi, T., Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+distribution+of+collagen+binding+sites+on+fibroblasts+cultured+within+collagen+gels.">Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels.</a> Extracellular Matrix-Cell Interaction. , 123-140 (1998).</li><li>Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+collagen+molecules+from+the+aspect+of+fibril+formation:+Acid-soluble,+alkali-treated+and+MMP1-digested+fragments+of+type+I+collagen.">Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen.</a> Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).</li><li>Fujisaki, H., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+apoptosis+on+type+I+collagen+gel+caused+by+lack+of+laminin+5/10/11+deposition+and+Akt+signaling.">Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling.</a> Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).</li><li>Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delay+of+cell+cycle+progression+and+induction+of+death+of+cancer+cells+on+type+I+collagen+fibrils.">Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils.</a> Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).</li><li>Wang, Z., Li, R., Zhong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+promotes+proliferation,+migration+and+airway+smooth+muscle+cells+in+a+rat+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+via+upregulation+of+the+PI3K/AKT+signaling+pathway.">Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).</li><li>Shih, Y. -. R., Tseng, K. F., Lai, H. -. Y., Lin, C. -. H., Lee, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+stiffness+regulation+of+integrin&#8208;mediated+mechanotransduction+during+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Matrix stiffness regulation of integrin&#8208;mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).</li><li>Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+basement+membrane:+The+foundation+of+epidermal+integrity-+BM+functions+and+diverse+roles+of+binding+molecules+nidogen+and+perlecan.">Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan.</a> BioMed Resesrch International. , 179784 (2013).</li><li>Fujisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respective+optimal+calcium+concentrations+for+proliferation+on+type+I+collagen+fibrils+in+two+keratinocyte+line+cells,+HaCaT+and+FEPE1L-8.">Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8.</a> Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).</li><li>Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+primary+human+epithelial+cells+by+cloned+cervical+carcinoma+DNA+containing+human+papillomavirus+type+16+E6/E7+open+reading+frames.">Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames.</a> Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).</li><li>Kaur, P., Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+expression+and+differentiation+in+transformed+human+epidermal+cells+is+regulated+by+fibroblasts.">Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).</li><li>Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+differentiation+and+proliferation+are+regulated+by+adhesion+to+the+three-dimensional+meshwork+structure+of+type+IV+collagen.">Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen.</a> Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).</li><li>Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+to+a+quiescent+and+contractile+phenotype+from+a+proliferative+phenotype+of+myofibroblast-like+human+aortic+smooth+muscle+cells+by+culture+on+type+IV+collagen+gels.">Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels.</a> Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).</li><li>Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Sensitivity+of+Epithelial+Cells+to+Extracellular+Matrix+in+Polarity+Establishment.">Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment.</a> Plos One. 9, 112922 (2014).</li><li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Involvement+of+Aminotelopeptide+in+Self-assembly+and+Thermal+Stability+of+Collagen+I+as+Revealed+by+Its+Removal+with+Proteases.">Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).</li><li>Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelation+of+lens+capsule+type+IV+collagen+solution+at+a+neutral+pH.">Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH.</a> Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).</li><li>Hattori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+-Type+IV+collagen+hybrid+gel.">Type I -Type IV collagen hybrid gel.</a> European patent. , (2015).</li><li>Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+with+fibrillar+collagen+inhibits+melanoma+cell+proliferation+by+up-regulating+p27KIP1.">Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+levels+of+reactive+oxygen+species+in+murine+preadipocyte+3T3-L1+cells+cultured+on+type+I+collagen+molecule-coated+and+gel-covered+dishes+exert+opposite+effects+on+NF-&#954;B-mediated+proliferation+and+migration.">Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-&#954;B-mediated proliferation and migration.</a> Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).</li></ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Sommige ECM-componenten, met inbegrip van type I collageen, formulier driedimensionale structuren in vivo1. Kweken op dergelijke een driedimensionale, gel substraat biedt meer fysiologische omstandigheden in vitro dan op een twee-dimensionale, kunststof oppervlak1,2,3,4. Talrijke protocollen met betrekking tot de methode van de cultuur van de gel zijn gemeld, zoals het gebruik van type I collageen1,2,3,4,6,7, 11, type IV collageen14,15en16van de Matrigel. Controletype I collageen is een welomschreven en gebruikte materiaal vanwege de overvloed en gebruiksgemak. De functies van gezuiverde type I collageen is afhankelijk van de dierlijke soorten, leeftijd en zuivering methoden5,17. Controletype I collageen gezuiverd kan worden met behulp van azijnzuur en/of proteasen, zoals pepsine, papaïne en proctase5,17. In zuur oplosbaar collageen onderhoudt amino-telopeptides en protease-oplosbare collageen zijn gekloofd amino-telopeptides5,17. De gereserveerde lengte van amino-telopeptides hangt af van het soort proteasen, en de aanwezigheid van telopeptides beïnvloedt fibril morfologie en gel sterkte5,17. De viscositeit van zuur oplosbaar collageen fibrillen is groter dan die van protease-behandeld collagens17. In deze studie, gebruikten we in zuur oplosbaar runderen controletype I collageen. Pepsine-ontbindend collageen kan ook worden gebruikt in dit gel cultuur protocol; de kracht van de gel is echter zwakker17. Deze verschillen in materialen veroorzaken cel gedrags verschillen, maar ze zijn momenteel niet goed begrepen.
Het gel cultuur protocol beschreven in deze studie is zeer eenvoudig. Veel wijzigingen van deze methode zijn gemeld. Een eventuele wijziging van de cultuur van keratinocyten is om na te bootsen de kelder-membraan. Type IV collageen gels wellicht beter om te houden van de structuur van een kelder membraan-achtige substraat in vitro15,18. Een lange incubatietijd is echter vereist voor de bereiding van type IV collageen gels14,15,18. In plaats daarvan, het mengen van type IV collageen met controletype I collageen gels kunnen produceren roman cultuur substraten (typ ik / type IV collageen hybride gels)19. Deze hybride gels zijn gemakkelijk te verwerken, vereisen een korte tijd voor gelering, en meer kelder membraan-achtige voorwaarden keratinocyten opleveren. Op typ ik / type IV collageen hybride gels, keratinocyten overleven, vormen van kolonies, en veroorzaken terminal differentiatie19. Deze hybride methode heeft veelzijdige toepassingen.
Met behulp van de op-gel cultuur controletype I collageen is van invloed op kankercellen. Op het formulier fibril van type I collageen, Akt activering en groei van Caco-2 cellen (de cellijn van een dikke darm-kanker) zijn onderdrukt7. Daarnaast wordt de groei van menselijke melanoom cellen (M24met) op het fibril-formulier bij de G1/S checkpoint20gearresteerd. Bovendien zijn aanzienlijk verhoogde niveaus van reactieve zuurstof soorten waargenomen in lymfkliertest 3T3-L1 preadipocytes gekweekt op het formulier fibril. Anderzijds celproliferatie en -migratie worden gestimuleerd in tegengestelde richtingen door de niet-vezelig en fibril vormen van controletype I collageen21.

Interstitiële bindweefsels bestaat uit een driedimensionale eiwit Zitschalen van heterogene samenstelling, voornamelijk samengesteld uit type I collageen fibrillen1. Collageen fibrillen spelen een belangrijke rol als een steiger voor cellen1,2,3 en interactie met andere extracellulaire matrix (ECM) eiwitten3. In vitro, verschillende vormen van controletype I collageen kan worden gebruikt als substraten voor de cultuur van de cel afhankelijk van de behandeling methode1,,2,,3,4. Typ onder zure omstandigheden, ik collageen onderhoudt de niet-vezelig formulier5. Coating het oppervlak van cultuur gerechten met de niet-vezelig vorm bevordert cel adhesie en proliferatie6,7. Bij fysiologische pH en temperatuur, typ ik collageen moleculen herassembleren in fibrillen die vormen gels bezitten een driedimensionale structuur1,2,3,4, 5,6,7,8. Er zijn verscheidene belangrijke verschillen tussen de fibril en niet-vezelig vormen van type I collageen, met inbegrip van matrix stijfheid en de efficiëntie van de wederopbouw van ECM componenten door de cellen tijdens de cultuur1. Stijfheid van de matrix is één van de meest bestudeerde regelgevende factoren van1, 9van de cultuur van de cel. De complexe interacties tussen substraten en cellen moeten echter nog worden verduidelijkt. Om de complexe interacties tussen cellen en milieufactoren te onderzoeken, is een eenvoudig systeem handig. Vergelijking van het gedrag van de cellulaire op de twee verschillende vormen van collageen kan bijdragen tot vereenvoudiging van het effect van milieufactoren. Afhankelijk van het doel van hun gebruik, de verschillende vormen van type I kan collageen worden selectief gebruikt. Normaal gesproken keratinocyten zijn in contact met het membraan van de kelder, maar niet met type I collageen. Echter tijdens de wondgenezing, keratinocyten verplaatsen naar de dermale bindweefsel, vermenigvuldigen, en genezen van de wond10.
Onlangs, we aangetoond dat de concentratie van de extracellulaire calcium belangrijk voor de verspreiding van Keratinocyt is lijn cellen met behulp van het systeem van de cultuur op de fibril vorm van controletype I collageen, het nabootsen van de dermale bindweefsel11. Toen de Keratinocyt cellijn FEPE1L-8 werd gekweekt op het formulier fibril van type I collageen, de vorm van de cellen was ronde en hun proliferations werden tegengehouden bij een concentratie van de extracellulaire calcium van 30 μM11. De concentratie van calcium werd verhoogd tot 1,8 mM, toen celgroei herstelde11. De cellen groeide onder beide concentraties van de calcium (30 μM en 1,8 mM) wanneer gekweekt op de niet-vezelig formulier11, terwijl ze gevoeliger zijn voor de concentratie van de exogene calcium wanneer gekweekt op het formulier fibril. FEPE1L-8 werd gegenereerd door middel van transfectie met het papillomavirus type 16 transformerende genen E6 en E7 van menselijke cervicale carcinoom, niet-tumorigene, remmen onbeperkt proliferatie met beperkte differentiatie potentiële zoals normale keratinocyten 12,,13. FEPE1L-8 cellen kunnen worden gehandhaafd door het gebruik van bepaalde soorten Keratinocyt specifieke medium, met inbegrip van K110 Type-II met additieve supplement K-1 (K110)6. Hier beschrijven we het protocol van de cultuur van de menselijke Keratinocyt cellijn op de niet-vezelig en fibril vormen van controletype I collageen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1096px;" width="1094">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">Albumin, from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">A4503</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">1 % BSA&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">A4503</td>
			<td>Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo Molecular Technologies, Inc.</td>
			<td>347-07621</td>
			<td>tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H&#160;tetrazolium, monosodium salt (WST-8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen type I (Acid soluble collgen)</td>
			<td>Nippi Inc.</td>
			<td>ASC-1-100-20</td>
			<td>from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate</td>
			<td>ADVANTEC Co., LTD.</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human keratinocyte line cell&#160; FEPE1L-8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA)&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">K-1</td>
			<td style="width:253px;">Kyokuto Seiyaku Inc.</td>
			<td style="width:127px;">28204</td>
			<td>additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 &#181;g of h-EGF and 5 mg of heparin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K110 Type-II medium</td>
			<td>Kyokuto Seiyaku Inc.</td>
			<td>28204</td>
			<td>keratinocyte basal culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:401px;">K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110)</td>
			<td style="width:253px;">Kyokuto Seiyaku Inc.</td>
			<td style="width:127px;">28204</td>
			<td>Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">PBS (-)&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">P-5368</td>
			<td>Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">10x PBS (-)</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">P-5368</td>
			<td>Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>1670049</td>
			<td>10000 units/mL of penisillin G and 10,000&#956;g/mL of streptmycin sulfate in physiological saline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:401px;">Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">P-5368-10 pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">0.05 % trypsin&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">T4799</td>
			<td>Dissolve 0.25 g of&#160; trypsin and&#160; 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-)&#160; and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation</td>
			<td>202-20123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation</td>
			<td>202-20123</td>
			<td>Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of keratinocyte proliferation on two- and three-dimensional type i collagen substrates

Controletype I collageen, nuttig als een substraat voor de cultuur van de cel, bestaat in twee vormen: de vorm van twee-dimensionale, niet-vezelig en driedimensionale, fibril vorm. Beide formulieren kunnen bereid worden met hetzelfde type I collageen. In het algemeen, bevordert de niet-vezelig vorm cel adhesie en proliferatie. De fibril vorm (gels) biedt meer fysiologische omstandigheden in vele soorten cellen; gel cultuur is dus nuttig voor de behandeling van fysiologische gedrag van cellen, zoals drug werkzaamheid.
Onderzoekers kunnen selecteren van de juiste vorm volgens het doel van het gebruik ervan. Bijvoorbeeld in het geval van keratinocyten, is op-gel cultuur gebruikt als een wond genezing model. FEPE1L-8, een cellijn Keratinocyt gekweekt op het niet-vezelig formulier van type I collageen, cel adhesie te bevorderen. Keratinocyt proliferatie is met name langzamer op het fibril-formulier dan de niet-vezelig vorm. Protocollen voor de bereiding van type I collageen voor cultuur van de cel zijn eenvoudige en brede toepassingen afhankelijk van de experimentele behoeften.

Een schematische weergave van de behandeling van de oppervlakken van cultuur gerechten, gebruikmakend van controletype I collageen is afgebeeld in Figuur 1. Cel morphologies waargenomen op de niet-vezelig en fibril vormen worden gepresenteerd in de panelen van de linker - en rechterkant van Figuur 2, respectievelijk. FEPE1L-8 cellen werden gekweekt voor 2 h (bovenste panelen) en 3 dagen (lagere panelen). In de eerste 2 h van het kweken, de cellen vastgehouden en verspreid over beide soorten collageen (Figuur 2, bovenste panelen). Drie dagen na het zaaien, cellen op het niet-vezelig formulier verder verspreid en cel nummers verhoogd (Figuur 2, lagere linker paneel). Daarentegen toonde de cellen op het fibril-formulier beperkte verspreiding (Figuur 2, lagere rechter paneel). FEPE1L-8 cellen blijven vermenigvuldigen op het niet-vezelig formulier van type I collageen (Figuur 3, effen zwarte lijn, gesloten zwarte cirkels) en op de onbehandelde schotel oppervlakken (Figuur 3, gestippelde grijze lijn, gesloten omringd door grijze rondjes). Daarentegen de cellen niet vermenigvuldigen op het fibril-formulier (Figuur 3, stippellijn, open cirkels). Figuur 2 en Figuur 3 zijn gewijzigd van Fujisaki et al.11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig1v2.jpg"> Figuur 1 : Schematische voorstellingen van cultuur schotel oppervlakken behandeld met type I collageen. Onder zure omstandigheden, typ ik collageen moleculen worden geadsorbeerd aan het oppervlak van een schotel in de niet-vezelig vorm (linkerdeel). Neutrale omstandigheden bij 37 ° C, Typ onder ik collageen moleculen zijn samengevoegd in fibrillen en geadsorbeerd aan het oppervlak van de gerechten in de vorm van gel (rechtervenster). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig2.jpg"> Figuur 2 : Morfologie van cellen van de FEPE1L-8. FEPE1L-8 cellen in K110 werden gekweekt met behulp van de niet-vezelig vorm (10 µg/mL; links panelen) of fibril vorm (1 mg/mL; juiste panelen) van type I collageen voor 2 h (bovenste panelen) of 3 dagen (lagere panelen). Witte balken geven aan 100 µm. Figuur 2 is gewijzigd van Fujisaki et al. in Figuur 1E – H11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig3v3.jpg"> Figuur 3 : Proliferatie van FEPE1L-8 cel. Het aantal levensvatbare cellen werden geschat op het niet-vezelig formulier (zwarte ononderbroken lijn, zwarte gevulde cirkels) of op de fibril vorm (stippellijn, open cirkel) van type I collageen, of onbehandeld schotel oppervlakken (grijze stippellijn, gevulde omringd door grijze rondjes) voor 2 h, 1 dag, en 3 dagen. Experimenten werden uitgevoerd in triplicates en waarden worden weergegeven als middelen + SD. Dit cijfer is gewijzigd van Fujisaki et al. in Figuur 1J11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates at JoVE.com

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Hier presenteren we een protocol voor de voorbereiding van twee verschillende vormen van cultuur substraten met behulp van controletype I collageen. Afhankelijk van hoe collageen wordt afgehandeld, collageen moleculen onderhouden twee-dimensionale, niet-vezelig vorm of Monteer in driedimensionale, fibril formulier. Celproliferatie op typ ik collageen wordt drastisch beïnvloed door de vorming van de fibril.

Evaluatie van Keratinocyt proliferatie op twee - en drie - dimensional Type I collageen substraten

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Deze video laat zien hoe je twee verschillende soorten celkweeksubstraten voorbereiden met behulp van collageen van type I en tweedimensionale en driedimensionale kweekmethode. De driedimensionale cultuurmethode wordt beschouwd als de biologische omgeving, waaruit blijkt hoe gemakkelijk een driedimensionaal cultuursubstraat voor te bereiden is nuttig voor studies. In tal van celtypen, ondanks het gebruik van hetzelfde collageen, celgedrag varieert aanzienlijk tussen twee-dimensionale en driedimensionale substraten.Met behulp van driedimensionale cultuur substraat, celgedrag dat meer lijkt op die van levende organismen kan gemakkelijk worden onderzocht. Deze methode is zeer eenvoudig en vereist minimale speciale reagens. Visuele demonstratie is van cruciaal belang, want hoewel we willen aantonen dat deze methode gemakkelijk kan worden geprobeerd, is de driedimensionale gel kwetsbaar en is het erg belangrijk om er goed mee om te gaan.Om te beginnen, de voorbereiding van de juiste cultuur medium. Om te beginnen met de voorbereiding van het collageen, plaats 10x PBS, gedeïmiseerd water, collageen, een 96-well cultuurplaat, en een lege twee-milliliter buis op ijs. Voeg met behulp van een pipet 1,12 milliliter gedeïsized water toe aan de lege buis van twee milliliter.Voeg 200 microliter van 10x PBS toe aan het gedeïioneerde water en schud de buis meerdere keren voorzichtig. Voeg onmiddellijk voor gebruik 0,66 milliliter collageen toe aan de buis van twee milliliter. Schud de buis voorzichtig en snel meerdere keren.Giet 100 microliter van deze collageenoplossing in elke put van de 96-put kweekplaat, om ervoor te zorgen dat het hele oppervlak van de putten te dekken. Schud de plaat voorzichtig met een beweging van links naar rechts. Broed de kweekplaat in een koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius gedurende een uur.Dan kantelen van de plaat om de gelatie van het collageen te bevestigen, en verplaats de cultuurplaat naar een schone bank. Giet voorzichtig 150 microliter K110 op de gels door langs de muur van de put te pipetten. Incubeer in een koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius gedurende een uur.Verplaats hierna de cultuurplaat naar een schone bank. Onmiddellijk voorafgaand aan de celcultuur, gebruik een pipet om de K110 voorzichtig weg te gooien. Gebruik eerst een pipet om vier microliter collageen toe te voegen aan 1,2 milliliter van een millimolar zoutzuur in een buis van 1,5 milliliter, en voorzichtig mengen.Giet 100 microliter van dit collageenmengsel in elke put van een nieuwe 96-put kweekplaat. Schud de plaat voorzichtig in een beweging van links naar rechts en 1000 uur lang bij kamertemperatuur. Gooi hierna de collageenoplossing weg.Met behulp van een pipet, was elk goed met PBS. Voeg 150 microliter van 1%BSA en PBS toe aan elke put van de kweekplaat en broed een uur lang bij kamertemperatuur uit. Gooi de 1%BSA-oplossing voor de celcultuur weg.Om te beginnen, bereid de FEPE1L-8 cellen en de K110, trypsine, en trypsine remmer zoals beschreven in het tekstprotocol. Verwijder het medium voorzichtig uit de kweekschaal en gebruik een pipet om drie milliliter van 0,05% trypsine toe te voegen. Plaats de schotel terug in de koolstofdioxide incubator, en uitbroeden op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten.Gebruik vervolgens fasecontrastmicroscopie bij 10x vergroting om te controleren op celloslating van het oppervlak van de kweekschaal. Voeg drie milliliter trypsine remmer, en gebruik een pipet om de losgemaakte cellen te verzamelen in een 15-milliliter centrifuge buis. Centrifuge op 200 keer g gedurende vijf minuten.Gooi hierna de supernatant weg en verleg de pellet in 10 milliliter K110. Gebruik fasecontrastmicroscopie bij 10x vergroting om de cellen te tellen en verdun de cellen met K110 tot een celdichtheid van 50.000 cellen per milliliter. Voorzichtig zaad 0,1 milliliter van de cel suspensie in elke put van de cultuur plaat door pipetten langs de muur van de put.Incubeer in een koolstofdioxide incubator bij 37 graden Celsius voor de juiste tijd. Meng eerst 130 microliter tetrazoliumzout en WST-8 met 1,3 milliliter voorverwarmde K110 in een buis van twee milliliter. Verplaats de kweekplaat naar een schone bank en gebruik een pipet om de K110 voorzichtig uit de putten te gooien.Spoel voorzichtig weg en niet-loodhoudende cellen met K110. Voeg vervolgens 110 microliter K110 gemengd met WST-8 aan elke put. Incubeer in een koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius gedurende twee uur.Verplaats hierna de cultuurplaat naar een schone bank. Verzamel 100 microliter van het geconditioneerde medium van elke put, en verplaats het in de putten van een nieuwe 96-put cultuurplaat. Met behulp van een microplate-lezer meet u de absorptie op 450 nanometer en schat u het aantal levensvatbare cellen.De celmorfologie wordt waargenomen op de niet-vezelige en fibril vormen worden hier getoond. In de eerste twee uur van het kweken, de cellen hechten en verspreiden op beide vormen van collageen. Drie dagen na het zaaien, blijven de cellen op de niet-vezelige vorm zich uitspreiden, en de celaantallen stijgen, terwijl de cellen op de fibrilvorm beperkte verspreiding tonen.FEPE1L-8 cellen blijven zich vermenigvuldigen op de niet-vezelige vorm van type I collageen en op de onbehandelde schotel oppervlakken. In tegenstelling, de cellen niet vermenigvuldigen op de fibril vorm. Bij het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat de driedimensionale gel is zeer kwetsbaar.Men moet ervoor zorgen dat de oplossing of tips niet in direct contact komen met de gels. Deze methode kan op tal van manieren worden gewijzigd. Bijvoorbeeld, om specimen membraan componenten te mengen, kan men een cel cultuur substraat die een kelder membraan na te bootsen.In tal van gevallen zijn de functies van de extracellulaire matrix in levende lichamen onbekend. Om cellen op de driedimensionale cultuur te kweken, kan men de functie van extracellulaire matrixcomponent onderzoeken die meer op het levende lichaam lijkt. Door het toepassen van driedimensionale gel cultuur technieken, kan men effectief testen van de concentratie van geneesmiddelen in cellen.Dit protocol, gebaseerd op iemands doel, kan worden gebruikt om complexe driedimensionale cultuursubstraten te ontwikkelen door andere EGM-componenten of groeifactoren te mengen tijdens gelaties.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Drie-dimensionale Optische resolutie Fotoakoestisch Microscopie

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Alginaat Hydrogelen voor Three-Dimensional orgelcultuur van de eierstokken en eileiders

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Vlakke en Three-Dimensional Printing van geleidende inkten

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Drie-dimensionale Cultuur van de Cel Model voor het meten van de effecten van het interstitiële vocht Flow op tumorcel invasie

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cel Patterning op fotolithografisch Defined Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Een verbeterde werkwijze voor de bereiding van type I collageen van de huid

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse van cel-migratie binnen Driedimensionale Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Driedimensionale Biomimetic Technologie: Novel Biorubber Creëert Defined micro- en macro-schaal Architectures in Collageen Hydrogels

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...