Name: evaluation of keratinocyte proliferation on two- and three-dimensional type i collagen substrates
Uploaded: 2019-04-22T15:00:00
Duration: 8 min 19 s
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Nous sommes reconnaissants à m. K. Sekiguchi (Institut de recherche de la protéine, Université d’Osaka), Dr. M. Yamada (Institut de recherche de la protéine, Université d’Osaka), Dr T. Ikejima (Chine-Japon recherche Institut de médecine et Sciences pharmaceutiques, Wuya College of Innovation, Université pharmaceutique de Shenyang) et T. Hayashi (China-Japan Research Institute of Medical et Sciences pharmaceutiques, Wuya College of Innovation, Université pharmaceutique de Shenyang) des commentaires utiles.

1. préparation du milieu de culture de kératinocytes
Remarque : Effectuez toutes les procédures dans des conditions aseptiques.
<ol><li>Ajouter 5 mL de pénicilline-streptomycine et 10 mL d’additif supplément K-1 à 500 mL de milieu K110 Type-II (K110) à l’aide d’une pipette.</li>
</ol>2. préparation de la forme de fibrilles de collagène de type I
Remarque : Effectuez les procédures avant l’étape 2.6 dans des conditions aseptiques.
<ol><li>Garder 10 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS (–)), eau déminéralisée, collagène, une plaque de 96 puits culture et un tube 2 mL sur la glace. Remarque : Ne pas utiliser la même plaque pour préparer les fibrilles et formes non fibreux.</li>
	<li>Ajouter 1,12 mL d’eau désionisée à un tube à vide 2 mL à l’aide d’une pipette. Ajouter 200 µL de PBS de x 10 (-) à l’eau déionisée dans le tube 2 mL à l’aide d’une pipette. Agiter doucement le tube plusieurs fois.</li>
	<li>Ajouter 0,66 mL de collagène dans le tube 2 mL à l’aide d’une pipette. Doucement et rapidement secouez le tube plusieurs fois. NOTE : Éviter la formation de bulles dans la solution autant que possible. Préparer la solution de collagène immédiatement avant leur utilisation.</li>
	<li>Verser 100 µL de la solution de collagène de l’étape 2.3 dans chaque puits de la plaque de 96 puits de culture. Secouez légèrement la plaque de culture dans un gauche à droite motion. Remarque : Elle recouvre la totalité de la surface des puits avec la solution de collagène. Si la solution ne couvre pas la totalité de la surface, étendre la solution à l’aide d’un embout de la pipette. Eviter la formation de bulles dans la solution autant que possible.</li>
	<li>Placer la plaque de culture dans un incubateur à CO2 et incuber à 37 ° C pendant 1 h. vérifier la gélification du collagène et de déplacer la plaque de culture vers un banc propre. NOTE : Confirmer la gélification par l’inclinaison de la plaque de culture.</li>
	<li>Verser doucement 150 µL de K110 sur les gels à l’aide d’une pipette le long de la paroi du puits, lieu de la culture dans un incubateur à CO2 sur plaque et incuber à 37 ° C pendant 1 h. déplacer la plaque de culture à un banc propre. Avant la culture cellulaire, doucement jeter le K110 à l’aide d’une pipette. Remarque : Afin de protéger les gels, la pointe de la pipette doit toucher la paroi du puits.</li>
</ol>3. préparation de la forme non fibreux de collagène de type I
Remarque : Effectuez toutes les procédures dans des conditions aseptiques.
<ol><li>Ajouter 4 µL de collagène à 1,2 mL de 1 mM d’acide chlorhydrique (HCl) dans un tube de 1,5 mL et mélanger délicatement à l’aide d’une pipette. NOTE : Préparez immédiatement avant l’utilisation de collagène. Gardez le collagène et HCl réfrigérés jusqu’au moment de l’emploi.</li>
	<li>Dans chaque puits d’une plaque de 96 puits de culture à l’aide d’une pipette, verser 100 µL de collagène. Secouez légèrement la plaque de culture à gauche vers la droite motion et incuber à température ambiante pendant 1 h. Remarque : Assurez-vous que la totalité de la surface des puits est recouvert de solution.</li>
	<li>Après l’incubation, jeter la solution de collagène et laver les puits avec du PBS (-) deux fois à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Verser 150 µL de 1 % bovine serum albumine/PBS (-) (1 % de BSA) dans un puits de la plaque de 96 puits culture et incuber à température ambiante pendant 1 h. avant la culture cellulaire, jeter le 1 % de BSA. Remarque : Assurez-vous que la totalité de la surface des puits est recouvert de solution.</li>
</ol>4. culture de cellules FEPE1L-8
Remarque : Effectuez toutes les procédures dans des conditions aseptiques.
<ol><li>Maintenir les FEPE1L-8 cellules K110 dans un 100 mm plat dans un incubateur à CO2 de la culture et incubés à 37 ° C et 5 % CO2, de semi-confluency.</li>
	<li>Préparer le K110, la trypsine et inhibiteur de la trypsine dans un bain-marie à 37 ° C.</li>
	<li>Soigneusement retirer le support de la boîte de Petri, ajouter 3 mL de trypsine de 0,05 % à l’aide d’une pipette, placer le plat dans un incubateur à CO2 et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Après incubation, vérifier le détachement des cellules de la surface de la boîte de pétri à l’aide de la microscopie à contraste de phase à un grossissement de 10 x. Remarque : La morphologie des cellules individuelles devient ronde. Si les cellules se propagent, incuber pendant une période supplémentaire de 5 min.</li>
	<li>Ajouter 3 mL d’inhibiteur de la trypsine et de recueillir les cellules individuelles dans un tube à centrifuger 15 mL à l’aide d’une pipette. Centrifuger les cellules dans un tube à centrifuger 15 mL à 200 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 10 mL de K110 à l’aide d’une pipette. Compter les cellules à l’aide de la microscopie à contraste de phase à un grossissement de 10 x et préparer la concentration cellulaire à 5,0 x 104 cellules/mL de dilution appropriée avec K110.</li>
	<li>Les semences délicatement 0,1 mL de K110 avec cellules dans chaque puits de la plaque de culture à l’aide d’une pipette le long de la paroi du puits. Placer la plaque de culture dans un incubateur à CO2 et incuber à 37 ° C pendant le temps indiqué (2 h, 1 jour, 3 jours). Remarque : Afin de protéger les gels, la pointe de la pipette doit toucher la paroi du puits.</li>
</ol>5. estimation du nombre de cellules viables
<ol><li>Incuber K110 dans un bain-marie à 37 ° C. Mix 130 µL de tétrazolium sel, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tétrazolium, sel monosodique (WST-8) et 1,3 mL de K110 dans un tube de 2 mL à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Déplacer la plaque de culture vers un banc propre et écarter doucement le K110 à l’aide d’une pipette. Laver délicatement les cellules non adhérentes avec K110 en utilisant une pipette</li>
	<li>Ajouter 110 µL de K110 mélangé à WST-8 dans chaque bien en utilisant une pipette, déposer la plaque de culture dans un incubateur à CO2 et incuber à 37 ° C pendant 2 h.</li>
	<li>Déplacer la plaque de culture vers un banc propre, collecter 100 µL de milieu conditionné de chaque puits et déplacez-le dans un puits d’une autre plaque de 96 puits de culture. Mesurer l’absorbance à une longueur d’onde de 450 nm (do450) en utilisant un lecteur de microplaques et une estimation du nombre de cellules viables.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kanta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+as+a+tool+in+studying+fibroblastic+cell+behavior.">Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 9 (4), 308-316 (2015).</li><li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+adhesion+to+collagen+substrates.">Fibroblast adhesion to collagen substrates.</a> Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).</li><li>Kleinman, H. K., Haralsonand, M. A., Hassell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+extracellular+matrix+and+its+components+in+culture.">Use of extracellular matrix and its components in culture.</a> Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. , 289-301 (1995).</li><li>Yamato, M., Hayashi, T., Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+distribution+of+collagen+binding+sites+on+fibroblasts+cultured+within+collagen+gels.">Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels.</a> Extracellular Matrix-Cell Interaction. , 123-140 (1998).</li><li>Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+collagen+molecules+from+the+aspect+of+fibril+formation:+Acid-soluble,+alkali-treated+and+MMP1-digested+fragments+of+type+I+collagen.">Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen.</a> Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).</li><li>Fujisaki, H., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+apoptosis+on+type+I+collagen+gel+caused+by+lack+of+laminin+5/10/11+deposition+and+Akt+signaling.">Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling.</a> Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).</li><li>Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delay+of+cell+cycle+progression+and+induction+of+death+of+cancer+cells+on+type+I+collagen+fibrils.">Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils.</a> Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).</li><li>Wang, Z., Li, R., Zhong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+promotes+proliferation,+migration+and+airway+smooth+muscle+cells+in+a+rat+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+via+upregulation+of+the+PI3K/AKT+signaling+pathway.">Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).</li><li>Shih, Y. -. R., Tseng, K. F., Lai, H. -. Y., Lin, C. -. H., Lee, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+stiffness+regulation+of+integrin&#8208;mediated+mechanotransduction+during+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Matrix stiffness regulation of integrin&#8208;mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).</li><li>Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+basement+membrane:+The+foundation+of+epidermal+integrity-+BM+functions+and+diverse+roles+of+binding+molecules+nidogen+and+perlecan.">Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan.</a> BioMed Resesrch International. , 179784 (2013).</li><li>Fujisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respective+optimal+calcium+concentrations+for+proliferation+on+type+I+collagen+fibrils+in+two+keratinocyte+line+cells,+HaCaT+and+FEPE1L-8.">Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8.</a> Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).</li><li>Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+primary+human+epithelial+cells+by+cloned+cervical+carcinoma+DNA+containing+human+papillomavirus+type+16+E6/E7+open+reading+frames.">Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames.</a> Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).</li><li>Kaur, P., Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+expression+and+differentiation+in+transformed+human+epidermal+cells+is+regulated+by+fibroblasts.">Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).</li><li>Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+differentiation+and+proliferation+are+regulated+by+adhesion+to+the+three-dimensional+meshwork+structure+of+type+IV+collagen.">Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen.</a> Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).</li><li>Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+to+a+quiescent+and+contractile+phenotype+from+a+proliferative+phenotype+of+myofibroblast-like+human+aortic+smooth+muscle+cells+by+culture+on+type+IV+collagen+gels.">Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels.</a> Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).</li><li>Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Sensitivity+of+Epithelial+Cells+to+Extracellular+Matrix+in+Polarity+Establishment.">Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment.</a> Plos One. 9, 112922 (2014).</li><li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Involvement+of+Aminotelopeptide+in+Self-assembly+and+Thermal+Stability+of+Collagen+I+as+Revealed+by+Its+Removal+with+Proteases.">Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).</li><li>Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelation+of+lens+capsule+type+IV+collagen+solution+at+a+neutral+pH.">Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH.</a> Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).</li><li>Hattori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+-Type+IV+collagen+hybrid+gel.">Type I -Type IV collagen hybrid gel.</a> European patent. , (2015).</li><li>Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+with+fibrillar+collagen+inhibits+melanoma+cell+proliferation+by+up-regulating+p27KIP1.">Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+levels+of+reactive+oxygen+species+in+murine+preadipocyte+3T3-L1+cells+cultured+on+type+I+collagen+molecule-coated+and+gel-covered+dishes+exert+opposite+effects+on+NF-&#954;B-mediated+proliferation+and+migration.">Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-&#954;B-mediated proliferation and migration.</a> Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Certains composants de l’ECM, y compris collagène de type I, forme tridimensionnelle structures in vivo1. Culture sur ces trois dimensions, gel de substrat fournit des conditions physiologiques plus vitro que sur une surface à deux dimensions, en plastique,1,2,3,4. Nombreux protocoles concernant la méthode de culture de gel ont été signalés, comme l’utilisation de collagène1,2,3,4,6,7, de type I 11, collagène de type IV14,15et16de la Matrigel. J’ai taper le collagène est un matériau bien défini et largement utilisé en raison de son abondance et de la facilité de manipulation. Les caractéristiques de type purifié je collagène dépendent de l’animal espèces, l’âge et purification méthodes5,17. J’ai tapez collagène peut être purifiée à l’aide d’acide acétique ou protéases, telles que la pepsine, papaïne et proctase5,17. Collagène soluble dans l’acide soutient amino-télopeptides et collagène soluble-protéase sont clivés amino-télopeptides5,17. La longueur réservée des amino-télopeptides dépend du type de protéases, et la présence des télopeptides affecte la morphologie des fibrilles et gel force5,17. La viscosité des fibrilles de collagène acido-soluble est supérieure à celle des collagènes imprégnées de protéase17. Dans cette étude, nous avons utilisé acido-soluble bovine collagène de type I. Pepsine solubilisée collagène peut également être utilisé dans le présent protocole de culture de gel ; Cependant, la force de gel est plus faible17. Ces différences de matériaux peuvent entraîner des différences de comportement cellulaire, mais ils ne sont actuellement pas bien compris.
Le protocole de culture gel décrit dans cette étude est très simple. Beaucoup de modifications de cette méthode ont été signalés. Une seule modification possible pour la culture de kératinocytes consiste à mimer la membrane basale. Gels de collagène de type IV peuvent être préférable de garder une structure de la membrane basale comme substrat in vitro15,18. Cependant, une longue période d’incubation est nécessaire pour la préparation de type IV collagène gels14,15,18. Au lieu de cela, mélange de collagène de type IV avec j’ai tapez gels collagène peut produire des substrats de culture roman (de type I / type IV collagène hybride gels)19. Ces gels hybrides sont faciles à manipuler, nécessitent un peu de temps pour la gélification et le rendement plus conditions de membrane basale des kératinocytes. Suite de type I / type IV collagène hybride gels, kératinocytes survivent, forment des colonies et induisent la différenciation terminale19. Cette méthode hybride a de multiples applications.
À l’aide de la culture sur-gel de type I collagène affecte les cellules cancéreuses. Sur la forme de fibrilles de collagène de type I, l’activation d’Akt et la croissance des cellules Caco-2 (une lignée de cellules cancéreuses du colon) sont supprimés7. En outre, la croissance des cellules de mélanome humain (M24met) sur la forme de fibrilles est arrêtée au point de contrôle G1/S20. En outre, des niveaux nettement accrues d’espèces oxygénées réactives sont observées chez murine 3 t 3-L1 adipocytes cultivées sur la forme de fibrilles. En outre, migration et prolifération des cellules sont stimulées dans des directions opposées par le non fibreux et formes de fibrilles de collagène21de type I.

Les tissus conjonctif interstitiels comprend trois dimensions réseau de protéines de composition hétérogène, principalement composés de type I de fibrilles de collagène1. Fibrilles de collagène jouent un rôle clé comme un échafaudage pour cellules1,2,3 et d’interagissent avec les autres protéines de la matrice extracellulaire (ECM)3. In vitro, différentes formes de type j’ai collagène peut servir de substrats pour la culture cellulaire selon la manipulation méthode1,2,3,4. Dans des conditions acides, de type I collagène maintient la forme non fibreux5. Revêtement de la surface des récipients de culture avec la forme non fibreux favorise cell adhesion et la prolifération de6,7. Au pH physiologique et de la température, les molécules de collagène de type I remonter en fibrilles qui forment des gels possédant une structure tridimensionnelle1,2,3,4, 5,6,7,8. Il y a plusieurs importantes différences entre les fibrilles et formes non fibreux de type j’ai collagène, y compris la matrice rigidité et l’efficacité de la reconstruction des composantes d’ECM par les cellules au cours de la culture1. Matrice raideur est un des facteurs réglementaires plus étudiées de cell culture1, 9. Cependant, les interactions complexes entre les substrats et les cellules restent à préciser. Pour examiner les interactions complexes entre les cellules et les facteurs environnementaux, un système simple est utile. Comparaison du comportement cellulaire sur les deux formes différentes de collagène peut aider à simplifier l’effet des facteurs environnementaux. Selon le but de leur utilisation, les différentes formes de type j’ai collagène peut être sélectivement utilisé. Normalement, les kératinocytes sont en contact avec la membrane basale, mais pas avec du collagène type I. Cependant, au cours de la cicatrisation, les kératinocytes se déplacent vers le tissu conjonctif dermique, prolifèrent et guérir la plaie10.
Récemment, nous avons démontré que la concentration de calcium extracellulaire est importante pour la prolifération des kératinocytes de cellules en utilisant le système de culture sur la forme de fibrilles de collagène imitant le tissu conjonctif cutané11de type I. Lorsque la lignée de cellules kératinocytes FEPE1L-8 a été cultivée sur la forme de fibrilles de collagène de type I, la forme des cellules est ronde et leurs proliférations ont été arrêtées à une concentration de calcium extracellulaire de 30 μM11. Lorsque la concentration de calcium a été augmentée à 1,8 mM, croissance cellulaire a été récupéré11. Les cellules a grandi sous les deux concentrations de calcium (30 μM et 1,8 mM) lorsqu’il est cultivé sur le formulaire non fibreux11, alors qu’elles étaient plus sensibles à la concentration de calcium exogènes lorsqu’il est cultivé sur la forme de fibrilles. FEPE1L-8 a été généré par le biais de transfection avec les papillomavirus type 16 transformation gènes E6 et E7 de carcinome cervical humain, non-tumorigènes, inhiber la prolifération illimitée avec différenciation limitée potentielle comme les kératinocytes normaux 12,,13. FEPE1L-8 cellules peuvent être maintenues à l’aide de certains types de support des kératinocytes, y compris K110 Type II avec additif supplément K-1 (K110)6. Ici, les auteurs décrivent le protocole de culture d’une lignée cellulaire des kératinocytes humains sur la non fibreux et formes de fibrilles de collagène de type I.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1096px;" width="1094">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">Albumin, from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">A4503</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">1 % BSA&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">A4503</td>
			<td>Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo Molecular Technologies, Inc.</td>
			<td>347-07621</td>
			<td>tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H&#160;tetrazolium, monosodium salt (WST-8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen type I (Acid soluble collgen)</td>
			<td>Nippi Inc.</td>
			<td>ASC-1-100-20</td>
			<td>from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate</td>
			<td>ADVANTEC Co., LTD.</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human keratinocyte line cell&#160; FEPE1L-8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA)&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">K-1</td>
			<td style="width:253px;">Kyokuto Seiyaku Inc.</td>
			<td style="width:127px;">28204</td>
			<td>additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 &#181;g of h-EGF and 5 mg of heparin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K110 Type-II medium</td>
			<td>Kyokuto Seiyaku Inc.</td>
			<td>28204</td>
			<td>keratinocyte basal culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:401px;">K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110)</td>
			<td style="width:253px;">Kyokuto Seiyaku Inc.</td>
			<td style="width:127px;">28204</td>
			<td>Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">PBS (-)&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">P-5368</td>
			<td>Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">10x PBS (-)</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">P-5368</td>
			<td>Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>1670049</td>
			<td>10000 units/mL of penisillin G and 10,000&#956;g/mL of streptmycin sulfate in physiological saline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:401px;">Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">P-5368-10 pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">0.05 % trypsin&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">T4799</td>
			<td>Dissolve 0.25 g of&#160; trypsin and&#160; 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-)&#160; and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation</td>
			<td>202-20123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation</td>
			<td>202-20123</td>
			<td>Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of keratinocyte proliferation on two- and three-dimensional type i collagen substrates

J’ai du collagène type, utile comme un substrat pour la culture cellulaire, existe sous deux formes : la forme à deux dimensions, non fibreux et en trois dimensions, forme de fibrilles. Les deux formes peuvent être préparés avec le même collagène de type I. En général, la forme non fibreux favorise la prolifération et l’adhérence cellulaire. La forme de fibrilles (gels) fournit des conditions physiologiques plus dans de nombreux types de cellules ; gel de culture est donc utile pour l’examen des comportements physiologiques des cellules, telles que l’efficacité du médicament.
Les chercheurs peuvent sélectionner le formulaire approprié en fonction de l’objectif de son utilisation. Par exemple, dans le cas des kératinocytes, culture sur gel a servi comme un modèle de cicatrisation. FEPE1L-8, une lignée de cellules kératinocytes cultivés sur la forme non fibreux de type j’ai collagène, favoriser l’adhérence de la cellule. Notamment, la prolifération des kératinocytes est plus lente sur la forme de fibrilles que la forme non fibreux. Protocoles pour la préparation du collagène de type I pour culture cellulaire sont simples et ont de vastes applications selon les besoins expérimentaux.

Une représentation schématique du traitement des surfaces des récipients de culture à l’aide de type I collagène est représenté dans la Figure 1. Morphologies cellulaires observées sur les formes non fibreux et fibrilles sont présentés dans les panneaux de côtés gauche et droit de la Figure 2, respectivement. FEPE1L-8 cellules ont été cultivées pendant 2 h (panneaux supérieurs) et 3 jours (panneaux inférieurs). Dans les 2 h initiale de mise en culture, les cellules ont adhéré et réparties sur les deux formes de collagène (Figure 2, panneaux supérieurs). Trois jours après l’ensemencement, cellules sur le formulaire non fibreux a continué à se propager et cellule nombre a augmenté (Figure 2, panneau gauche inférieur). En revanche, les cellules sur la forme de fibrilles montrent limitée diffusion (Figure 2, panneau de droite plus bas). FEPE1L-8 cellules ont continué à proliférer sur le formulaire non fibreux de type j’ai collagène (Figure 3, la ligne noire continue, privée de cercles noirs) et sur le plat non traité des surfaces (Figure 3, ligne grise, des cercles gris fermés en pointillé). En revanche, les cellules ne pas prolifèrent sur la forme de fibrilles (Figure 3, pointillé, cercles vides). Figure 2 et Figure 3 ont été modifiées de Fujisaki et al.11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig1v2.jpg"> Figure 1 : Des représentations schématiques des surfaces de culture plat traités avec type collagène. Dans des conditions acides, collagène de type I molécules sont adsorbés à la surface d’un plat sous forme non fibreux (panneau de gauche). Dans des conditions neutres à 37 ° C, collagène de type I molécules sont réassemblés en fibrilles et adsorbés sur la surface des plats sous la forme de gel (panneau de droite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig2.jpg"> Figure 2 : Morphologie des cellules FEPE1L-8. FEPE1L-8 cellules K110 ont été cultivés en utilisant le formulaire non fibreux (10 µg/mL ; panneaux de gauche) ou forme de fibrilles (1 mg/mL ; panneaux droite) de type I collagène pendant 2 h (panneaux supérieurs) ou 3 jours (panneaux inférieurs). Les barres blanches indiquent 100 µm. Figure 2 a été modifiée de Fujisaki et coll. en Figure 1E-H11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig3v3.jpg"> Figure 3 : Prolifération de cellules FEPE1L-8. Le nombre de cellules viables ont été estimé sur la forme non fibreux (ligne noire épaisse, noirs cercles pleins) ou sur la fibrille forme (ligne pointillée, cercle ouvert) de type I collagène ou des surfaces non traitées plat (ligne pointillée grise, gris cercles pleins) pour 2 h, 1 jour et 3 jours. Expériences ont été effectuées dans la géométrie et les valeurs sont indiquées comme moyens + SD Ce chiffre a été modifié de Fujisaki et coll. en Figure 1J11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Nous présentons ici un protocole pour la préparation de deux formes différentes de substrats de culture utilisant la collagène de type I. Selon comment le collagène est géré, les molécules de collagène maintiennent forme à deux dimensions, non fibreux ou remonter en trois dimensions, forme de fibrilles. Sur la prolifération des cellules de type I collagène est considérablement affectée par la formation de fibrilles.

Évaluation de la prolifération des kératinocytes sur deux et trois dimensions des substrats de collagène de Type I

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Cette vidéo montre comment préparer deux types différents de substrats de culture cellulaire en utilisant le collagène de type I et la méthode de culture bidimensionnelle et tridimensionnelle. La méthode de culture tridimensionnelle est considérée à l’environnement biologique, démontrant comment préparer facilement un substrat de culture tridimensionnel est utile pour des études. Dans de nombreux types de cellules, malgré l’utilisation du même collagène, le comportement cellulaire varie considérablement entre les substrats bidimensionnels et tridimensionnels.En utilisant le substrat de culture tridimensionnel, le comportement cellulaire qui est plus semblable à ceux des organismes vivants pourrait être facilement examiné. Cette méthode est très simple et nécessite un minimum de reagent spécial. La démonstration visuelle est critique, car alors que nous voulons démontrer que cette méthode est facilement tentée, le gel tridimensionnel est fragile, et sa manipulation correctement est très importante.Pour commencer, préparez le milieu culturel approprié. Pour commencer à préparer le collagène, placez 10 x PBS, de l’eau déionisée, du collagène, une plaque de culture de 96 puits et un tube vide de deux millilitres sur la glace. À l’aide d’une pipette, ajouter 1,12 millilitres d’eau déionisée au tube vide de deux millilitres.Ajouter 200 microlitres de 10x PBS à l’eau déionisée, et secouer doucement le tube plusieurs fois. Immédiatement avant l’utilisation, ajouter 0,66 millilitres de collagène au tube de deux millilitres. Secouez doucement et rapidement le tube plusieurs fois.Verser 100 microlitres de cette solution de collagène dans chaque puits de la plaque de culture de 96 puits, en s’assurant de couvrir toute la surface des puits. Secouez doucement la plaque à l’aide d’un mouvement de gauche à droite. Incuber la plaque de culture dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure.Inclinez ensuite la plaque pour confirmer la gelation du collagène et déplacez la plaque de culture sur un banc propre. Verser délicatement 150 microlitres de K110 sur les gels en pipetting le long du mur du puits. Incuber dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant une heure.Après cela, déplacez la plaque de culture à un banc propre. Immédiatement avant la culture cellulaire, utilisez une pipette pour jeter doucement le K110. Utilisez d’abord une pipette pour ajouter quatre microlitres de collagène à 1,2 millilitres d’acide chlorhydrique millimolaire dans un tube de 1,5 millilitre, et mélangez doucement.Verser 100 microlitres de ce mélange de collagène dans chaque puits d’une nouvelle plaque de culture de 96 puits. Secouez doucement la plaque en mouvement de gauche à droite et incubez à température ambiante pendant une heure. Après cela, jeter la solution de collagène.À l’aide d’une pipette, bien laver chaque puits avec du PBS. Ajouter 150 microlitres de 1%BSA et PBS à chaque puits de la plaque de culture, et incuber à température ambiante pendant une heure. Avant la culture cellulaire, jetez la solution 1%BSA.Pour commencer, préparez les cellules FEPE1L-8 et l’inhibiteur K110, trypsine et trypsine tel que décrit dans le protocole de texte. Retirez soigneusement le milieu du plat de culture et utilisez une pipette pour ajouter trois millilitres de trypsine de 0,05 %. Remettre le plat dans l’incubateur de dioxyde de carbone et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.Ensuite, utilisez la microscopie de contraste de phase au grossissement 10x pour vérifier le détachement cellulaire de la surface du plat de culture. Ajouter trois millilitres d’inhibiteur de la trypsine et utiliser une pipette pour recueillir les cellules détachées dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq minutes.Après cela, jeter le supernatant, et resuspendre la pastille en 10 millilitres de K110. Utilisez la microscopie de contraste de phase à 10x grossissement pour compter les cellules, et diluer les cellules avec K110 à une densité cellulaire de 50.000 cellules par millilitre. Ensemencer délicatement 0,1 millilitre de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque de culture en pipetting le long de la paroi du puits.Incuber dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant la durée appropriée. Mélanger d’abord 130 microlitres de sel de tétrazolium et de WST-8 avec 1,3 millilitres de K110 préchauffé dans un tube de deux millilitres. Déplacez la plaque de culture sur un banc propre, et utilisez une pipette pour jeter doucement le K110 des puits.Lavez doucement et nonherent les cellules avec K110. Ajouter ensuite 110 microlitres de K110 mélangés avec WST-8 à chaque puits. Incuber dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant deux heures.Après cela, déplacez la plaque de culture à un banc propre. Recueillir 100 microlitres du milieu conditionné de chaque puits et le déplacer dans les puits d’une nouvelle plaque de culture de 96 puits. À l’aide d’un lecteur de microplaque, mesurez l’absorption à 450 nanomètres et estimez le nombre de cellules viables.La morphologie cellulaire est observée sur les formes non fibreux et fibrilles sont montrés ici. Dans les deux premières heures de la culture, les cellules adhèrent et se propagent sur les deux formes de collagène. Trois jours après l’ensemencement, les cellules sous forme non fibreuse continuent de se propager, et le nombre de cellules augmente, tandis que les cellules sous forme fibril montrent une propagation limitée.Les cellules FEPE1L-8 continuent de proliférer sous la forme non fibreuse de collagène de type I et sur les surfaces de vaisselle non traitées. En revanche, les cellules ne prolifèrent pas sur la forme fibril. Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler que le gel tridimensionnel est très fragile.Il faut faire attention à ce que la solution ou les conseils n’entrent pas en contact direct avec les gels. Cette méthode peut être modifiée de nombreuses façons. Par exemple, pour mélanger les composants membranaires de l’échantillon, on peut faire un substrat de culture cellulaire qui imite une membrane du sous-sol.Dans de nombreux cas, les fonctions de la matrice extracellulaire dans les corps vivants sont inconnues. Pour la culture des cellules sur la culture tridimensionnelle, on peut examiner la fonction de la composante matricielle extracellulaire qui est plus similaire au corps vivant. En appliquant des techniques tridimensionnelles de culture du gel, on peut tester efficacement la concentration de médicaments dans les cellules.Ce protocole, basé sur son but, pourrait être utilisé pour développer des substrats complexes de culture tridimensionnelle en mélangeant d’autres composants EGM ou des facteurs de croissance pendant les gelations.

Research

JoVE Journal

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