Name: evaluation of keratinocyte proliferation on two- and three-dimensional type i collagen substrates
Uploaded: 2019-04-22T15:00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates at JoVE.com

Мы благодарны доктор K. Секигучи (Институт исследований белков, Осакский университет), д-р м. Ямада (Институт исследований белков, Осакский университет), д-р T. Ikejima (Китай-Япония исследовательский институт медицинских и фармацевтических наук, колледж Wuya Инновации, Шэньян фармацевтический университет) и т. Хаяси (Китай-Япония исследовательский институт медицинских и фармацевтических наук, колледж Wuya инноваций, Шэньян фармацевтический университет) за полезные замечания.

1. Подготовка носителя культуры кератиноцитов
Примечание: Выполните все процедуры в асептических условиях.
<ol><li>Добавьте 5 мл пенициллина и стрептомицина и 10 мл Добавка дополнение K-1 до 500 мл среды K110 типа-II (K110) с помощью пипетки.</li>
</ol>2. Подготовка фибриллярных формы типа коллагена
Примечание: Выполните процедуры до шага 2.6 в асептических условиях.
<ol><li>Держите 10 x фосфат амортизированное saline (PBS (-)), деионизированной воды, коллаген, плиту 96-луночных культуры и пустой 2-мл на льду. Примечание: Не используйте пластину же подготовить волосики и неволокнистые форм.</li>
	<li>Добавьте 1.12 мл деионизованной воды пустой 2-мл пробирку с помощью пипетки. Добавьте 200 мкл 10 x PBS (-) для обессоленной воды в 2-мл пробирку с помощью пипетки. Осторожно встряхните трубки несколько раз.</li>
	<li>Добавьте 0,66 мл коллагена в 2-мл пробирку с помощью пипетки. Аккуратно и быстро несколько раз взболтайте трубки. Примечание: Во избежание формирования пузыря в решении как можно больше. Готовят непосредственно перед использованием коллагена раствор.</li>
	<li>Залейте 100 мкл раствора коллагена от шага 2.3 в каждой скважине пластину 96-луночных культуры. Осторожно встряхните пластину культуры в левом правом движения. Примечание: Покрывают всю поверхность скважин с коллагена раствор. Если решение не покрывает всю поверхность, распространение решения с помощью кончика пипетки. Избегайте образования пузыря в решении как можно больше.</li>
	<li>Место культуры пластины в инкубатор CO2 и Инкубируйте на 37 ° C в течение 1 ч. проверить гелеобразования коллагена и двигаться пластину культуры к чистой скамейке. Примечание: Подтвердите гелеобразования, отогнув пластину культуры.</li>
	<li>Осторожно наливайте 150 мкл K110 на гелях, с помощью пипетки вдоль стены колодца, место культуры пластины в инкубатор CO2 и Инкубируйте на 37 ° C в течение 1 ч. двигаться пластину культуры к чистой скамейке. До клеточной культуры, аккуратно удалить K110 с помощью пипетки. Примечание: Чтобы защитить гели, кончиком пипетки должны касаться стены колодца.</li>
</ol>3. Подготовка неволокнистые формы типа коллагена
Примечание: Выполните все процедуры в асептических условиях.
<ol><li>4 мкл коллагена до 1,2 мл 1 мм соляной кислоты (HCl) в 1,5 мл тюбик и осторожно перемешать с помощью пипетки. Примечание: Готовят непосредственно перед использованием коллагена. Держите коллагена и HCl, охлажденной до момента использования.</li>
	<li>Залейте 100 мкл коллагена в каждой скважине 96-луночных культуры пластины с помощью пипетки. Осторожно встряхните пластину культуры в слева направо движения и инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч. Примечание: Убедитесь, что вся поверхность лунки покрыта решения.</li>
	<li>После инкубации отменить решение коллаген и Промыть лунки с PBS (-) дважды с помощью пипетки.</li>
	<li>Залить 150 мкл 1% бычьего сывороточного альбумина/PBS (-) (1% BSA) хорошо пластины 96-луночных культуры и инкубации при комнатной температуре за 1 ч до культуры клеток, выбросьте BSA 1%. Примечание: Убедитесь, что вся поверхность лунки покрыта решения.</li>
</ol>4. Культура клеток FEPE1L-8
Примечание: Выполните все процедуры в асептических условиях.
<ol><li>Сохранить FEPE1L-8 клеток в K110 в 100 мм культуры блюдо в инкубатор CO2 и инкубировали при 37 ° C и 5% CO2, на полу confluency.</li>
	<li>Подготовить K110, трипсина и ингибитор трипсина в водяной бане при температуре 37 ° C.</li>
	<li>Тщательно удалить носитель из культуры блюдо, добавить 3 мл 0,05% трипсина, с помощью пипетки, поместите блюдо в инкубатор CO2 и инкубировать при 37 ° C за 5 мин. После инкубации Проверьте ячейки отряда от поверхности культуры блюдо с помощью фазово контрастной микроскопии при 10-кратном. Примечание: Морфология отдельностоящий клеток становится раунда. Если клетки, Инкубируйте на дополнительный период, 5 мин.</li>
	<li>Добавить 3 мл ингибитора трипсина и собирать отдельные ячейки в 15 мл пластиковых пробирок с помощью пипетки. Центрифуга для ячеек в 15 мл пластиковых пробирок на 200 x g за 5 мин.</li>
	<li>Отменить супернатант и вновь приостановить гранулы в 10 мл K110 с помощью пипетки. Подсчитать ячейки, используя фазово контрастной микроскопии при 10-кратном и подготовить концентрации клеток на 5,0 x 10-4 клеток/мл соответствующих разрежения с K110.</li>
	<li>Аккуратно семян 0,1 мл K110 с ячейками в каждой скважине культуры пластины с помощью пипетки вдоль стены колодца. Место пластину культуры в CO2 инкубатора и инкубации при 37 ° C для указанного времени (2 часа, 1 день, 3 дня). Примечание: Чтобы защитить гели, кончиком пипетки должны касаться стены колодца.</li>
</ol>5. Оценка количество жизнеспособных клеток
<ol><li>Инкубировать K110 в водяной бане при температуре 37 ° C. Mix 130 мкл tetrazolium соли, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H tetrazolium, мононатрия соли (WST-8) и 1,3 мл K110 в 2-мл пробирку с помощью пипетки.</li>
	<li>Двигаться пластину культуры на лавочке чистой и аккуратно Выбросьте K110 с помощью пипетки. Аккуратно смыть non сторонник клетки с K110 с помощью пипетки</li>
	<li>Добавить что 110 мкл K110 смешанного с WST-8 в каждой хорошо с помощью пипетки, место пластину культуры в CO2 инкубатора и инкубировать при 37 ° C на 2 ч.</li>
	<li>Переместить пластину культуры к чистой скамейке, собирать 100 мкл кондиционером среды от каждой скважины и переместить его в скважину другой культуры 96-луночных пластины. Измерять поглощение на длине волны 450 Нм (450OD) с помощью Считыватель микропланшетов и оценкам количество жизнеспособных клеток.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kanta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+as+a+tool+in+studying+fibroblastic+cell+behavior.">Collagen as a tool in studying fibroblastic cell behavior.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 9 (4), 308-316 (2015).</li><li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+adhesion+to+collagen+substrates.">Fibroblast adhesion to collagen substrates.</a> Methods of Enzymology. 82, 503-508 (1982).</li><li>Kleinman, H. K., Haralsonand, M. A., Hassell, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+extracellular+matrix+and+its+components+in+culture.">Use of extracellular matrix and its components in culture.</a> Extracellular Matrix: A Practical Approach, 1st ed. , 289-301 (1995).</li><li>Yamato, M., Hayashi, T., Ninomiya, Y., Olsen, B. R., Ooyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+distribution+of+collagen+binding+sites+on+fibroblasts+cultured+within+collagen+gels.">Topological distribution of collagen binding sites on fibroblasts cultured within collagen gels.</a> Extracellular Matrix-Cell Interaction. , 123-140 (1998).</li><li>Suzuki, Y., Someki, I., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+collagen+molecules+from+the+aspect+of+fibril+formation:+Acid-soluble,+alkali-treated+and+MMP1-digested+fragments+of+type+I+collagen.">Interaction of collagen molecules from the aspect of fibril formation: Acid-soluble, alkali-treated and MMP1-digested fragments of type I collagen.</a> Journal of Biochemistry. 126, 54-67 (1999).</li><li>Fujisaki, H., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+apoptosis+on+type+I+collagen+gel+caused+by+lack+of+laminin+5/10/11+deposition+and+Akt+signaling.">Keratinocyte apoptosis on type I collagen gel caused by lack of laminin 5/10/11 deposition and Akt signaling.</a> Experimental Cell Research. 280, 255-269 (2002).</li><li>Sasaki, J., Fujisaki, H., Adachi, E., Irie, S., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delay+of+cell+cycle+progression+and+induction+of+death+of+cancer+cells+on+type+I+collagen+fibrils.">Delay of cell cycle progression and induction of death of cancer cells on type I collagen fibrils.</a> Connective Tissue Research. 52 (3), 167-177 (2011).</li><li>Wang, Z., Li, R., Zhong, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+promotes+proliferation,+migration+and+airway+smooth+muscle+cells+in+a+rat+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+via+upregulation+of+the+PI3K/AKT+signaling+pathway.">Extracellular matrix promotes proliferation, migration and airway smooth muscle cells in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease via upregulation of the PI3K/AKT signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 18, 3143-3152 (2018).</li><li>Shih, Y. -. R., Tseng, K. F., Lai, H. -. Y., Lin, C. -. H., Lee, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+stiffness+regulation+of+integrin&#8208;mediated+mechanotransduction+during+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Matrix stiffness regulation of integrin&#8208;mediated mechanotransduction during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26, 730-738 (2011).</li><li>Breitkreutz, D., Koxholt, I., Thiemann, K., Nischt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+basement+membrane:+The+foundation+of+epidermal+integrity-+BM+functions+and+diverse+roles+of+binding+molecules+nidogen+and+perlecan.">Skin basement membrane: The foundation of epidermal integrity- BM functions and diverse roles of binding molecules nidogen and perlecan.</a> BioMed Resesrch International. , 179784 (2013).</li><li>Fujisaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respective+optimal+calcium+concentrations+for+proliferation+on+type+I+collagen+fibrils+in+two+keratinocyte+line+cells,+HaCaT+and+FEPE1L-8.">Respective optimal calcium concentrations for proliferation on type I collagen fibrils in two keratinocyte line cells, HaCaT and FEPE1L-8.</a> Regenerative Therapy. 8, 73-79 (2018).</li><li>Kaur, P., McDougall, J. K., Cone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+primary+human+epithelial+cells+by+cloned+cervical+carcinoma+DNA+containing+human+papillomavirus+type+16+E6/E7+open+reading+frames.">Immortalization of primary human epithelial cells by cloned cervical carcinoma DNA containing human papillomavirus type 16 E6/E7 open reading frames.</a> Journal of General Virology. 70, 1261-1266 (1989).</li><li>Kaur, P., Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+expression+and+differentiation+in+transformed+human+epidermal+cells+is+regulated+by+fibroblasts.">Integrin expression and differentiation in transformed human epidermal cells is regulated by fibroblasts.</a> Journal of Cell Science. 103, 755-763 (1992).</li><li>Fujisaki, H., Adachi, E., Hattori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocyte+differentiation+and+proliferation+are+regulated+by+adhesion+to+the+three-dimensional+meshwork+structure+of+type+IV+collagen.">Keratinocyte differentiation and proliferation are regulated by adhesion to the three-dimensional meshwork structure of type IV collagen.</a> Connective Tissue Research. 49 (6), 426-436 (2008).</li><li>Hirose, M., Kosugi, H., Nakazato, K., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+to+a+quiescent+and+contractile+phenotype+from+a+proliferative+phenotype+of+myofibroblast-like+human+aortic+smooth+muscle+cells+by+culture+on+type+IV+collagen+gels.">Restoration to a quiescent and contractile phenotype from a proliferative phenotype of myofibroblast-like human aortic smooth muscle cells by culture on type IV collagen gels.</a> Journal of Biochemistry. 125, 991-1000 (1999).</li><li>Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Sensitivity+of+Epithelial+Cells+to+Extracellular+Matrix+in+Polarity+Establishment.">Differential Sensitivity of Epithelial Cells to Extracellular Matrix in Polarity Establishment.</a> Plos One. 9, 112922 (2014).</li><li>Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+Involvement+of+Aminotelopeptide+in+Self-assembly+and+Thermal+Stability+of+Collagen+I+as+Revealed+by+Its+Removal+with+Proteases.">Possible Involvement of Aminotelopeptide in Self-assembly and Thermal Stability of Collagen I as Revealed by Its Removal with Proteases.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25870-25875 (2000).</li><li>Nakazato, K., Muraoka, M., Adachi, E., Hayashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelation+of+lens+capsule+type+IV+collagen+solution+at+a+neutral+pH.">Gelation of lens capsule type IV collagen solution at a neutral pH.</a> Journal of Biochemistry. 120, 889-894 (1996).</li><li>Hattori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+-Type+IV+collagen+hybrid+gel.">Type I -Type IV collagen hybrid gel.</a> European patent. , (2015).</li><li>Henriet, P., Zhong, Z. D., Brooks, P. C., Weinberg, K. I., DeClerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+with+fibrillar+collagen+inhibits+melanoma+cell+proliferation+by+up-regulating+p27KIP1.">Contact with fibrillar collagen inhibits melanoma cell proliferation by up-regulating p27KIP1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (18), 10026-10031 (2000).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+levels+of+reactive+oxygen+species+in+murine+preadipocyte+3T3-L1+cells+cultured+on+type+I+collagen+molecule-coated+and+gel-covered+dishes+exert+opposite+effects+on+NF-&#954;B-mediated+proliferation+and+migration.">Differential levels of reactive oxygen species in murine preadipocyte 3T3-L1 cells cultured on type I collagen molecule-coated and gel-covered dishes exert opposite effects on NF-&#954;B-mediated proliferation and migration.</a> Free Radical Research. 28, 1-16 (2018).</li></ol>

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Некоторые компоненты ECM, включая тип I коллаген, формы трехмерных структур в естественных условиях1. Культивирование на такой трехмерный, субстрат гель обеспечивает более физиологических условиях в vitro чем на двухмерный, пластиковые поверхности1,2,3,4. Поступили многочисленные протоколы относительно метода культуры гель, например с помощью типа коллагена1,2,3,4,6,7, 11, тип IV коллаген14,15и16Matrigel. Тип I Коллаген является четко определенной и широко используется материал из-за его изобилия и простотой в обращении. Особенности очищенный типа я коллагена зависит от животных видов, возраст и очистки методы5,17. Тип I коллагена могут быть очищены с помощью уксусной кислоты или протеаз, например пепсин, папаин и proctase5,17. Кислотно растворимых коллагена утверждает, что амино telopeptides и протеаз растворимый коллаген, рассеченного амино telopeptides5,17. Защищены длина амино telopeptides зависит от типа протеаз, и присутствие telopeptides влияет на морфологию волосики и гель прочности5,17. Вязкость фибрилл коллагена кислотно растворимых больше, чем лечить протеазы коллагены17. В этом исследовании, мы использовали кислотно растворимых бычьего типа коллагена. Коллаген, пепсин солюбилизирован может также использоваться в настоящем Протоколе гель культуры; Однако прочность геля-слабее17. Эти различия в материалах может вызвать поведенческие различия клетки, но они в настоящее время не вполне понятны.
Протокол культуры гель, описанный в настоящем исследовании является очень простой. Было зарегистрировано много модификаций этого метода. Один из возможных изменений для культуры кератиноцитов заключается в том, чтобы имитировать базальной мембраны. Тип IV коллагеновые гели могут быть лучше сохранить структуру базальной мембраны как субстрат в vitro15,18. Однако длительный инкубационный период необходим для подготовки типа IV коллагеновые гели14,15,18. Вместо этого, смешивания коллаген типа IV, с I типа коллагеновые гели могут производить Роман культуры субстратов (тип I / тип IV коллагена гибридные гели)19. Эти гибридные гели легко обрабатывать, требуется некоторое время для гелеобразования и принести больше базальной мембраны как условия для кератиноцитов. На тип I / тип IV коллагена гибридные гели, кератиноциты выжить, формируют колонии и побудить терминала дифференциация19. Этот метод гибрид имеет универсальность применения.
Культура-гель с использованием типа коллаген влияет на раковые клетки. На форме фибриллярных типа коллаген, Akt активации и рост клеток Caco-2 (линия клетки рака толстой кишки), подавленные7. Кроме того рост человека меланомы клеток (M24met) в форме фибриллярных арестован на G1/S контрольно-пропускного пункта20. Кроме того заметно повысить уровень реактивнооксигенных видов наблюдаются в мышиных 3T3-L1 preadipocytes культивировали в форме волосики. Кроме того пролиферации и миграции стимулируются в противоположных направлениях неволокнистые и фибриллярных форм типа коллаген21.

Интерстициальный соединительной ткани составляют трехмерной белка сеть разнородных композиции, в основном состоят из типа я фибрилл коллагена1. Фибрилл коллагена играют ключевую роль в качестве лески для клетки1,2,3 и взаимодействовать с другими белков внеклеточного матрикса (ECM)3. В пробирке, различные формы типа коллаген может использоваться как субстраты для культуры клеток в зависимости от обработки метода1,2,3,4. В кислых условиях, тип I коллаген поддерживает неволокнистые форма5. Покрытие поверхности культуры блюд с неволокнистые форма способствует ячейки адгезии и распространения6,7. В физиологических рН и температуры, типа молекул коллагена собрать в фибрилл, которые формируют гели, обладая трехмерной структуры1,2,3,4, 56,,,78. Существует несколько важных различий между волосики и неволокнистые форм типа я коллагена, включая матрицы жесткости и эффективность восстановления компонентов ECM клеток во время культуры1. Матрицы жесткости является одним из наиболее изученных регулирования факторов культуры клеток в1, 9. Однако сложных взаимодействий между субстратов и клетки еще предстоит уточнить. Для изучения сложного взаимодействия между клетками и экологические факторы, простая система является полезным. Сравнение клеточного поведения на двух различных форм коллагена может помочь упростить влияние экологических факторов. В зависимости от цели их использования, различные формы типа я коллагена может использоваться выборочно. Как правило кератиноциты находятся в контакте с базальной мембраны, но не с типа я коллагена. Однако во время заживления ран, кератиноциты переместить в кожных соединительной ткани, размножаться и залечить раны10.
Недавно, мы показали, что концентрации внеклеточного кальция имеет важное значение для распространения кератиноцитов линии клетки с помощью системы культуры на форме фибриллярных типа коллагена, имитируя кожный соединительной ткани11. Когда линии клеток кератиноцитов, FEPE1L-8 был культивированный на форме фибриллярных типа я коллагена, форма клеток была круглой и их разрастания были остановлены на концентрации внеклеточного кальция 30 мкм11. Когда концентрация кальция было увеличено до 1,8 мм, клеточный рост был восстановленные11. Клетки рос под обе концентрации кальция (30 мкм и 1,8 мм) при культивированный неволокнистые форму11, в то время как они были более чувствительны к концентрации экзогенных кальция при культивировали в форме волосики. FEPE1L-8 был создан через трансфекции с вирусом папилломы тип 16 преобразование генов E6 и E7 от человека рак шейки матки, опухолеобразования, подавляют неограниченное распространение с ограниченным дифференциация потенциал как нормальные кератиноцитов 12,13. FEPE1L-8 клеток может поддерживаться с помощью некоторых видов конкретных средний кератиноцитов, включая K110 тип-II с добавкой дополнение K-1 (K110)6. Здесь мы описываем протокол культуры человека кератиноцитов клеточной линии на неволокнистые и фибриллярных форм типа коллагена.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1096px;" width="1094">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">Albumin, from bovine serum (BSA)</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">A4503</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">1 % BSA&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">A4503</td>
			<td>Dissolve 1 g of BSA powder in 100 mL of PBS (-) and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Dojindo Molecular Technologies, Inc.</td>
			<td>347-07621</td>
			<td>tetrazolium salt, 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H&#160;tetrazolium, monosodium salt (WST-8)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen type I (Acid soluble collgen)</td>
			<td>Nippi Inc.</td>
			<td>ASC-1-100-20</td>
			<td>from bovine (any other species available, concentration is 3.0 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">disposable membrane filter unit DISMIC cellulose acetate</td>
			<td>ADVANTEC Co., LTD.</td>
			<td>25CS020AS</td>
			<td>0.2 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human keratinocyte line cell&#160; FEPE1L-8</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>&#160;Donated Dr.W.G. Carter (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA)&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">K-1</td>
			<td style="width:253px;">Kyokuto Seiyaku Inc.</td>
			<td style="width:127px;">28204</td>
			<td>additive supplement with 500 mg of BSA, 500 mg of bovine pituitarybody extracts, 2.5 mg of insulin, 0.05 &#181;g of h-EGF and 5 mg of heparin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K110 Type-II medium</td>
			<td>Kyokuto Seiyaku Inc.</td>
			<td>28204</td>
			<td>keratinocyte basal culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:401px;">K110 Type-II medium with K-1 and Penicillin-Streptomycin (K110)</td>
			<td style="width:253px;">Kyokuto Seiyaku Inc.</td>
			<td style="width:127px;">28204</td>
			<td>Add 5 mL of Penicillin-Streptomycin and 10 mL of additive supplement (K-1) in 500 mL of K110 type-II keratinocyte basal culture medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">PBS (-)&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">P-5368</td>
			<td>Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 1000 mL of deionized water and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">10x PBS (-)</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">P-5368</td>
			<td>Dissolve 1 pouch of PBS (-) powder in 100 mL of deionized water and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>1670049</td>
			<td>10000 units/mL of penisillin G and 10,000&#956;g/mL of streptmycin sulfate in physiological saline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:401px;">Phosphate bufferred saline BioPerformance CertiCertified, pH 7.4</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">P-5368-10 pack</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>T4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:401px;">0.05 % trypsin&#160;</td>
			<td style="width:253px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:127px;">T4799</td>
			<td>Dissolve 0.25 g of&#160; trypsin and&#160; 0.186 g of EDTA.2Na in 500 mL of PBS (-)&#160; and filtrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor from soybean</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation</td>
			<td>202-20123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor&#160;</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical corporation</td>
			<td>202-20123</td>
			<td>Dissolve 50 mg of trypsin inhibitor and 500 mg of BSA in 500 mL of PBS (-) and filtrate&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of keratinocyte proliferation on two- and three-dimensional type i collagen substrates

Тип I коллаген, полезные как субстрат для клеточной культуры, существует в двух формах: двухмерный, неволокнистые формы и объемно, волосики. Обе формы может быть подготовлен с той же типа коллагена. В общем неволокнистые форма способствует клеточной адгезии и распространения. Волосики форма (гели) обеспечивает более физиологических условиях во многих типах клеток; Таким образом культура гель является полезным для изучения физиологических поведение клеток, таких как эффективность препарата.
Исследователи могут выбрать подходящую форму согласно цели его использования. Например в случае кератиноцитов, использовалась на гель культуры как ранозаживляющее модель. FEPE1L-8, линии клеток кератиноцитов культивированный неволокнистые форму типа я коллагена, способствуют клеточной адгезии. В частности кератиноцитов распространение в форме фибриллярных медленнее неволокнистые формы. Протоколы для подготовки я коллагена для тип культуры клеток просты и имеют широкое применение в зависимости от потребностей в экспериментальной.

Схематическое представление обработки поверхностей культуры блюд с использованием типа коллаген изображен на рисунке 1. Морфологии клеток наблюдается на неволокнистые и фибриллярных формы представлены в левой и правой стороне панели Рисунок 2, соответственно. FEPE1L-8 клеток были культивированный 2 h (верхняя панели) и 3 дня (нижняя панели). В первоначальных 2 ч культивирования клетки придерживался и выкладывают на обеих форм коллагена (рис. 2, верхней панели). Через три дня после посева, клетки неволокнистые форме продолжали распространять и клеточной число возросло (рис. 2, нижней левой панели). В отличие от клеток в форме фибриллярных показал, ограниченного распространения (рис. 2, нижней правой панели). FEPE1L-8 клетки продолжают размножаться неволокнистые форму типа коллагена (рис. 3, сплошная черная линия, закрытые черные круги) и на блюдо необработанной поверхности (рис. 3, пунктирной серой линии, закрытые серые круги). В отличие от клеток не увеличивается число фибриллярных формы (рис. 3, пунктирная линия, кружков). Фудзисаки et al11были изменены Рисунок 2 и на рисунке 3 .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig1v2.jpg"> Рисунок 1 : Схематические представления культуры блюдо поверхностей обращаться с типом коллаген. В кислых условиях тип I коллагена, который адсорбированных молекул на поверхности блюдо в форме неволокнистые (левая панель). В нейтральных условиях при 37 ° C тип I коллагена молекулы собрал в фибриллами и адсорбироваться на поверхности блюд в форме геля (правая панель). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig2.jpg"> Рисунок 2 : Морфология клеток FEPE1L-8. FEPE1L-8 клеток в K110 были культивируемых с помощью неволокнистые формы (10 мкг/мл; левой панели) или фибриллярных форме (1 мг/мл; правой панели) тип I коллагена для 2 h (верхняя панели) или 3 дней (нижняя панели). Белые бары показывают 100 µm. Рисунок 2 был изменен из Фудзисаки et al. в Рисунок 1E – H11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59339/59339fig3v3.jpg"> Рисунок 3 : Распространение клеток FEPE1L-8. Количество жизнеспособных клеток оценивались на неволокнистые форме (черная сплошная линия, черные круги, заполненные) или на волосики формы (пунктирная линия, открытые круг) тип I коллагена, или необработанной блюдо поверхности (серый пунктирная линия, серые круги заполнены) за 2 ч, 1 день и 3 дня. Эксперименты были проведены в triplicates и значения отображаются как средства + ур. Эта цифра была изменена от Фудзисаки et al. в Рисунок 1J11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59339/59339fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates at JoVE.com

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Здесь мы представляем протокол для подготовки двух различных форм культуры субстратов использования типа коллагена. В зависимости от того, как обрабатывается коллагена молекул коллагена поддерживать двухмерный, неволокнистые формы или соберите в трехмерном, волосики форму. Пролиферация клеток на типа коллаген резко пострадавших от формирования волосики.

Оценки распространения кератиноцитов на двух - и трехмерных типа коллаген субстратов

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Это видео показывает, как подготовить два различных типа субстратов клеточной культуры с помощью коллагена типа I и двухмерного и трехмерного метода культуры. Трехмерный метод культуры рассматривается в биологической среде, демонстрируя, как легко подготовить трехмерный субстрат культуры полезен для исследований. Во многих типах клеток, несмотря на использование одного и того же коллагена, поведение клеток значительно варьируется между двумерными и трехмерными субстратами.Используя трехмерный субстрат культуры, поведение клеток, которое больше похоже на поведение живых организмов, может быть легко исследовано. Этот метод очень прост и требует минимального специального реагента. Визуальная демонстрация имеет решающее значение, потому что, хотя мы хотим продемонстрировать, что этот метод легко пытается, трехмерный гель является хрупким, и обработка его должным образом очень важно.Для начала подготовьте соответствующую культурную среду. Чтобы начать подготовку коллагена, поместите 10x PBS, деионизированную воду, коллаген, 96-колодец культуры пластины, и пустой двухми миллилитровой трубки на льду. Используя пипетку, добавьте 1,12 миллилитров деионизированной воды в пустую двухми миллилитровую трубку.Добавьте 200 микролитров 10x PBS в деионизированную воду и аккуратно встряхните трубку несколько раз. Непосредственно перед использованием добавьте 0,66 миллилитров коллагена в двухми миллилитровую трубку. Аккуратно и быстро встряхните трубку несколько раз.Налейте 100 микролитров этого коллагенового раствора в каждую скважину из 96-колодец культуры пластины, убедившись, чтобы покрыть всю поверхность скважин. Аккуратно встряхните пластину, используя движение слева направо. Инкубировать культурную пластину в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа.Затем наклоните пластину, чтобы подтвердить гелеобразование коллагена, и переместить культурную пластину на чистую скамейку. Аккуратно налейте 150 микролитров K110 на гели, пролитые трубами вдоль стенки колодеца. Инкубировать в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа.После этого переместите культурную тарелку на чистую скамейку. Непосредственно перед клеточной культурой используйте пипетки, чтобы аккуратно сбросить K110. Сначала используйте пипетку, чтобы добавить четыре микролитров коллагена в 1,2 миллилитров одной миллимолярной соляной кислоты в 1,5-миллилитровую трубку и аккуратно перемешать.Налейте 100 микролитров этой коллагеновой смеси в каждый колодец новой пластины культуры 96-колодец. Аккуратно встряхните тарелку в движении слева направо и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа. После этого отбросьте раствор коллагена.Используя пипетку, мыть каждый хорошо с PBS. Добавьте 150 микролитров 1%BSA и PBS к каждому колодец культурной пластины, и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа. Перед культурой клеток отбросьте решение 1%BSA.Для начала подготовьте клетки FEPE1L-8 и ингибитор K110, трипсин и трипсин, как указано в текстовом протоколе. Тщательно удалите среду из культуры блюдо, и использовать пипетки, чтобы добавить три миллилитров 0,05%трипсина. Поместите блюдо обратно в инкубатор двуокиси углерода, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение пяти минут.Затем используйте фазовую контрастную микроскопию при увеличении в 10 раз, чтобы проверить отслоение клеток от поверхности культуры блюда. Добавьте три миллилитров ингибитора трипсина и используйте пипетку для сбора отдельных клеток в 15-миллилитровой центрифуге. Центрифуга по 200 раз г в течение пяти минут.После этого, отбросить супернатант, и повторно гранулы в 10 миллилитров K110. Используйте фазовую контрастную микроскопию при увеличении в 10 раз, чтобы подсчитать клетки и разбавить клетки K110 плотностью клеток 50 000 клеток на миллилитр. Аккуратно семя 0,1 миллилитров клеточной подвески в каждый колодец культуры пластины путем трубопроводов вдоль стены хорошо.Инкубация в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах по Цельсию в течение соответствующего периода времени. Первая смесь 130 микролитров тетразолиевой соли и WST-8 с 1,3 миллилитров разогретого K110 в двухми миллилитровой трубке. Переместите культурную пластину на чистую скамейку и используйте пипетки, чтобы аккуратно выбросить K110 из колодцев.Аккуратно смойте и неадхерентные клетки С K110. Затем добавьте 110 микролитров K110, смешанных с WST-8 к каждому хорошо. Инкубировать в инкубаторе двуокиси углерода при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов.После этого переместите культурную тарелку на чистую скамейку. Соберите 100 микролитров кондиционированной среды из каждой скважины, и переместить его в колодцы новой пластины культуры 96 скважин. Используя считыватель микроплатформ, измерьте абсорбанс на 450 нанометров и оцените количество жизнеспособных ячеек.Морфология клеток наблюдается на не-фиброзных и фибрилляции формы показаны здесь. В первые два часа культивирования клетки придерживаются и распространяются на обе формы коллагена. Через три дня после посева, клетки на не-фиброзной форме продолжают распространяться, и количество клеток увеличивается, в то время как клетки на форме фибриллы показывают ограниченное распространение.Клетки FEPE1L-8 продолжают размножаться на нефиброзной форме коллагена типа I и на необработанных поверхностях посуды. В отличие от этого, клетки не размножаются на фибрилляции форме. При попытке этой процедуры, важно помнить, что трехмерный гель очень хрупкий.Нужно быть осторожным, чтобы убедиться, что решение или советы не вступают в прямой контакт с гелями. Этот метод может быть изменен по-разному. Например, для смешивания мембранных компонентов образца можно сделать субстрат клеточной культуры, имитирующие мембрану подвала.Во многих случаях функции внеклеточной матрицы в живых телах неизвестны. Для культуры клеток на трехмерной культуры, можно изучить функцию внеклеточного компонента матрицы, которая больше похожа на живое тело. Применяя трехмерные методы культуры геля, можно эффективно проверить концентрацию наркотиков в клетках.Этот протокол, основанный на своей цели, может быть использован для разработки сложных трехмерных субстратов культуры путем смешивания других компонентов EGM или факторов роста во время гелеобразований.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Трехмерная оптическая разрешением Фотоакустическая микроскопии

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Альгинат гидрогелей для трехмерных органной культуры яичников и Яйцеводы

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Создание двумерных рисунком Подложки для конфайнмента белков и клеточных

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Плоские и трехмерной печати проводящей краски

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

Трехмерные модели культуры клеток для измерения действию тканевой жидкости потока на опухолевой инвазии сотовых

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Сотовый Patterning на фотолитографически установленными Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Подложки

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Улучшенный способ по подготовке I типа коллагена из кожи

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Анализ миграции клеток в трехмерном коллагеновой матрице

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Трехмерная Биомиметический Технология: Роман Biorubber Создает Определено микро- и макроуровне архитектур в коллагене гидрогелей

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...