Name: an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells
Uploaded: 2019-09-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells at JoVE.com

Denne undersøgelse blev finansieret af Terry Fox Research Institute (PPG # 1075), det canadiske Institut for sundhedsforskning (Foundation Grant #154326), den canadiske Cancer Society Research Institute (704718), Natural Sciences og Engineering Research Council of Canada, Сanada Foundation for innovation og prinsesse Margaret Cancer Foundation.
Jeg vil gerne takke Dr. Marguerite Akens for at give de indledende VX2-celler til etablering af den oprindelige VX2-model og de frosne VX2-tumorblokke. Jeg vil gerne takke Marco DiGrappa for at hjælpe med at udføre indledende VX2-cellekultur eksperimenter og Lili Ding for at hjælpe med VX2-cellekultur.

Dyb abdominal væg lukning: identificere spidsen af peritonealdialyse indsnit og forstå peritoneum, rectus femoris muskler og fascia med væv pincet. Alle dyreforsøg blev udført i dyre ressource Center (ARC) godkendte faciliteter på universitetets sundhedsnetværk og i overensstemmelse med godkendte dyre brugs-og pleje protokoller (AUP #3994/#4299). VX2-Cell line blev hentet fra Dr. Aken Lab på University Health Network.
1. oprettelse af in vitro VX2-cellelinje
<ol><li>Høst VX2-tumor f...

Heri, vi har rapporteret en standardiseret kirurgisk metode til etablering af en VX2-endometriecancer model og rapporterede om den første brug af dyrkede VX2-celler til at skabe denne model. Tumoren tager sats på 75% er lavere end 100% procentsats tidligere rapporteret i litteraturen35,37,53,56; men THW 90% af patologisk bekræftede lymfeknuder metastaser er i overensstemmelse med tidligere u...

Endometriecancer, eller kræft i slimhinden i livmoderen, er den næstmest almindelige gynækolog malignitet på verdensplan og den mest almindelige malignitet i udviklede nationer1. Forekomsten af endometriecancer er steget støt og stiger med 2,3% pr. år mellem 2005-2013 med en tilsvarende stigning i dødelighed på 2,2%1,2,3. Diagnosen lymfeknude metastaser er altafgørende, da tilstedeværelsen af positive lymfeknuder er en stærk negativ indikator for overlevelse4,5,6,7 og kan vejlede administrationen af adjuverende behandling8,9,10,11,12,13. Lymfeknude metastaser diagnosticeres i øjeblikket ved kirurgisk fjernelse af lymfevævet, der ligger over de store blodkar i bækkenet og maven. Denne procedure, kendt som en lymfadektomi, er kontroversiel på grund af modstridende overlevelse data fra to store forsøg14,15,16,17,18 og den kendte risiko for intra-operative15,19,20 og post-operative sygelighed21,22,23. Da nuværende ikke-invasive billedbehandlings metoder ikke har den nødvendige følsomhed og specificitet til at erstatte lymfeknude dissektion24, har der været et skub til at udvikle nye diagnostiske Imaging teknikker. For at afprøve disse nye teknikker i en præklinisk indstilling er en pålidelig model af endometriecancer med retroperitoneal lymfeknude metastaser påkrævet.
Kanin VX2-tumor model er en veletableret model, som har været anvendt i udstrakt grad at studere flere menneskelige solide organ tumorer25 herunder lunge26, hoved og nakke27,28, leveren29, nyre30, knogle31,32, hjernen33, bugspytkirtlen34 oguterus 35,36,37. Den VX2-model blev oprindeligt udviklet i 1940 af Kidd og Rous38 ved succesfuld Trans plantering af en cottontail kanin papilloma virus opdaget af shope i 193339. Siden den tid, VX2-model er blevet opretholdt in vivo, kræver seriel passage i quadriceps muskel af hvide New Zealand kaniner40. Mere for nylig dog, flere grupper har med succes vokset VX2-celler in vitro40,41,42 og påvist den bevarede tumorigenecity af den dyrkede cellelinje31, 42af43. VX2-tumorer er histologisk defineret som Anaplastisk planocellulært karcinomer44 og indeholder glandulære funktioner, der ligner adenokarcinom26. Tumorer er karakteriseret ved nem implantation, hurtig vækst og hyper-vaskularisering44,45 og pålideligt metastasize, mest almindeligt til regionale og fjerne lymfeknuder45. Ligheder i uterin vaskulær og lymfe anatomi46 samt den ortotopiske vækst site sikre, at det metastatiske mønster af kanin VX2-karcinom efterligner den humane endometriecancer, hvilket gør VX2-model en pålidelig model for at studere Human metastatisk sygdom. Desuden tyder histologiske egenskaber såsom unormal mikrovaskulær spredning47 , samt immunologisk48 og genetiske ligheder49,50 mellem mennesker og kaniner på, at tumoren mikromiljø kan afspejle den humane endometriecancer.
Flere grupper har rapporteret om brugen af VX2-til at skabe en model af endometriecancer med retroperitoneale metastaser med en høj rapporterede hastighed af succes36,51,52; der findes dog betydelige variationer i den nuværende litteratur med hensyn til model skabelens metode. Cellesuspension doser så lavt som 4 x 105 celler/uterine horn51 og så højt som 5 x 109 celler/uterine horn37,53 er blevet rapporteret uden standard konsensus om den krævede VX2-cellulære dosis. Samt, en række inokulering metoder er blevet rapporteret herunder mikro-kirurgisk implantation af tumor i uterin myometrium36, injektion af VX2-cellesuspension37,44,52 , 53 og i nogle tilfælde tilsætning af uterin horn suturering før innoculation52. Endelig har ingen grupper rapporteret brugen af dyrkede VX2-celler til at skabe denne model. Således formålet med denne undersøgelse er at demonstrere en vellykket standardiseret metode til VX2-model skabelse og til at rapportere den første anvendelse af dyrkede VX2-celler til at skabe en model af endometriecancer med retroperitoneale metastaser i en kanin.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>11-blade scalpel, Sterile, Disposible</td>
			<td>Aspen Surgical (VWR)</td>
			<td>80094-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gague ear vein catheter</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>14332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 braided absorbable suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine (Atravet)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>4363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution (Poviodone iodine 10%)</td>
			<td>UHN Stores</td>
			<td>457955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>McGill University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine solution</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>119872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354450</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354408</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354400</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/HAM F12 1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Caledon Lab Chem</td>
			<td>1/10/4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril injectable)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>11242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube</td>
			<td>Corning Centri-Star</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12483020</td>
			<td>brand/source not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isohexol contrast</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>407141210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam 0.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>104674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>House Brand (UofT Medstore)</td>
			<td>1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Multicell or Sigma</td>
			<td>331-010-CL or D8537-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>CA45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)</td>
			<td>T.C.M.F (Dr Bristow)</td>
			<td>28-Jan-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Glue (Tissue Adhesive)</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>14695B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.25%), Proteomics Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6567-5X20UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-542-EL</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells

Endometriecancer er den mest almindelige gynækolog malignitet i Nordamerika og forekomsten er stigende på verdensplan. Behandling består af kirurgi med eller uden adjuverende behandling afhængigt af lymfeknude involvering som bestemt af lymfadadenektomi. Lymfadadenektomi er en morbid procedure, som ikke har vist sig at have en terapeutisk fordel hos mange patienter, og dermed en ny metode til at diagnosticere lymfeknude metastaser er påkrævet. For at teste nye billedbehandlings midler er der behov for en pålidelig model af endometriecancer med retroperitoneal lymfeknude metastaser. Den VX2-endometriale Cancer model er blevet beskrevet hyppigt i litteraturen; der er dog betydelige forskelle med hensyn til metoden for etablering af modeller. Endvidere har ingen undersøgelser rapporteret om brugen af dyrkede VX2-celler til at skabe denne model, da kun celler, der er formeret in vivo, tidligere er blevet anvendt. Heri, præsenterer vi en standardiseret kirurgisk metode og postoperativ overvågning metode til etablering af VX2-endometriecancer model og rapport om den første anvendelse af dyrkede VX2-celler til at skabe denne model.

Tyve-otte kaniner blev anvendt til oprettelse af endometriecancer model. Kaniner havde en gennemsnitsvægt på 2,83 kg (2.71-3.58 kg) på tidspunktet for forsøget. Uterine tumorer med succes voksede i 21 kaniner for en samlet model succesrate på 75%. Forud for optagelsen af uterin suturering i protokollen, succesraten var 57% sammenlignet med 81% efter uterin suturering blev tilføjet. Uterine suturering blev føjet til protokollen efter den 7th kanin som reaktion på den opr...

Watch this Scientific Journal Video about An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells at JoVE.com

An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Denne protokol præsenterer en standardiseret metode til at dyrke VX2-celler i kulturen og til at skabe en ortotopisk VX2-model af endometriecancer med retroperitoneal lymfeknude metastaser hos kaniner. Ortotopiske endometriale Cancer modeller er vigtige for den prækliniske undersøgelse af nye billedbehandlings metoder til diagnosticering af lymfeknudemetastaser.

En Ortotopisk endometriecancer model med retroperitoneal lymfadenopati fremstillet af in vivo opformeret og kulturperler VX2-celler

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Denne VX2 endometriecancer model med retroperitoneal lymfeknude metastase kan bruges til at studere teknologi til billed-guidet kirurgi. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at det er pålidelig, enkel, og at det skaber konsekvent metastatisk spredning, som efterligner mønsteret af human endometriecancer. Samlet set er dette en simpel teknik.Men, praktisere suturing før du forsøger at skabe modellen vil bidrage til at gøre processen lettere. Visuel demonstration af denne teknik er vigtig, da det hjælper med at demonstrere de kirurgiske trin, der er involveret i model etablering. Demonstrere proceduren med Harley Chan og jeg vil være Lili Ding, en tekniker fra vores laboratorium.For at forberede in vitro-formeret VX2 celler til injektion, begynde med opvarmning frosne hætteglas af VX2 celler i en 37 grader Celsius perle eller vandbad i et minut. Når cellerne er optøet, trækkes cellesuspensionerne i et 15-milliliterrør indeholdende 10 milliliter kulturmedium. Sediment cellerne ved centrifugering.Opsplit pellet i ni milliliter medium. Overfør cellerne til en stor kulturkolbe til inkubation ved 37 grader Celsius uden at ryste, og cellerne kontrolleres dagligt for sammenløb med lysmikroskopi. Når cellerne har nået 80%sammenløb, tilsættes tre milliliter 0,2% trypsin til kolben og returnere cellerne til cellekultur inkubatoren i fem minutter.Når cellerne er taget af, overføres cellesuspensionen til et konisk rør for at indsamle cellerne ved centrifugering. Cellepellet vaskes tre gange med ni milliliter frisk PBS pr. vask. Efter den sidste vask skal cellerne opslænges i frisk PBS til optælling, inden de fortyndes til fire gange 10 til de syv VX2-celler pr. milliliter PBS-koncentration i et nyt konisk rør på is.For at forberede in vivo-formeret VX2 celler til injektion, tø frosset en af en centimeter VX2 tumorblokke og bruge en skalpel til at hakke vævsprøver i en kultur plade. Vævsfragmenterne overføres til et 70-mikrometerfilter, og der tilsættes små prøver på op til en milliliter hanks afbalancerede saltopløsning eller HBSS for at sikre, at alle cellerne passerer gennem sern. Derefter tælles cellerne, før cellesuspensionen fortyndes til en gange 10 til de syv VX2-celler pr. milliliter HBSS-koncentration i et sterilt rør på is.Efter at have bekræftet en manglende reaktion på stimulus, placere bedøvet kvindelige hvide New Zealand kanin i dorsal position på operationsbordet. Klip håret over bækkenet og maven, og bruge en tre trin kirurgisk hud prep at rense den eksponerede hud. Iført en kirurgisk hætte og ansigtsmaske, krat hænderne med desinfektionsmiddel, før du lægger på en steril kjole og sterile kirurgiske handsker.Landmark toppen af skambenet og drapere det kirurgiske område med laparotomi gardiner, forlader en fem af fem-centimeter område af underlivet udsat. Dernæst skal du bruge en række 11 skalpel klinge til at gøre en 2,5-centimeter snit en centimeter kranie til symphysis pubis gennem huden og subkutane væv. Incise rectus fascia og dissekere rectus musklerne side om side for at afsløre den underliggende bughinde.Bekræft, at undergrunden er fri for tarm eller andre abdominale organer. Træd skarpt ind i bughinden for at identificere urinblæren og feje en behandsket finger overlegent, posteriort, og sidesomt over toppen af blæren for at finde livmoderhorn. Uddrag livmoderen horn gennem abdominal snit til at hvile på bugvæggen.Brug en 3-0 flettet absorberbar sutur til at udføre en enkelt sutur ligation af hver livmoder horn, ca 1,5 til to centimeter distale til cervices og bare mediale til livmoderarterier. Derefter binde suturer stramt til at omfatte de distale livmoder horn. For at vaccinere myometriet med den tidligere forberedte VX2 celleaffjedring, skal en en millilitersprøjte med en 27-gauge nål med en milliliter celler.Injicer langsomt 0,5 milliliter af cellesuspensionen over et minut i hvert uterinhorn proksimale til suturstedet mellem suturen og livmoderhalsen. Tryk derefter på det myometrieinjektionssted i 30 sekunder for at minimere cellelækage. Undersøg injektions- og suturstederne for hæmostase, før uterushornene anbringes tilbage i maven.For dyb bugvæggen lukning, identificere toppen af bughindeindsnit og bruge en kirurgisk klemme til at forstå bughinden rectus muskel og fascia. Forankr suturen ved at placere en 3-0 absorberbar polyfilament sutur, overfladisk til dybt på den ene spids af snittet, og dyb til overfladisk på den anden. Ved hjælp af den vedlagte sutur, gør kører sting vinkelret på snittet gennem lagene af bugvæggen, arbejder trin-wise langs snittet fra side til side, før binde suturen og skære de løse ender.For overfladisk bugvæggen lukning, bruge en begravet kører subkuticular 3-0 absorberbare polyfilament sutur til sutur dyb til overfladisk på den ene side af snittet og overfladisk til dybt på den anden. Efter knuder suturerne, skal du bruge de forankrede suturer til at lave løbesømme i det dermale lag parallelt med snittet, der arbejder trinmæssigt langs snittet fra side til side. Bind suturerne og fjern de løse ender.Påfør kirurgisk lim til det lukkede snit for at appose hudkanterne. Derefter placere dyret på et varmt tæppe med ilt og overvågning, indtil dyret er opmærksom og i stand til at sidde uafhængigt. Ved fastlæggelsen af denne model lykkedes det en dosis på to gange 10 til de syv celler pr. livmoderhorn hos fire kaniner i en gennemsnitlig tid på 45 dage fra vaccination til forsøg og blev derfor bestemt som den optimale injektionsdosis for den dyrkede VX2-model.For in vivo-formeret VX2-modellen, som med succes blev skabt hos 16 kaniner med en gennemsnitlig tid fra vaccination til forsøg på 29 dage, blev fem gange 10 til de seks celler pr. livmoderhorn bestemt som den optimale injektionsdosis. Alle modellerne resulterede i en vellykket metastatisk transformation af retroperitoneal lymfeknuder. Yderligere, tumorer og metastatiske lymfeknuder fra dyrkede VX2 celler syntes ligner tumorer fra in vivo-formeret VX2 celler ved histologisk analyse, med densymetoxolin-farvede celler observeret i den invaderende muskel og danner kirtellignende lignende strukturer med mange patologiske mytotiske figurer.Placer din sutur mediale til livmoderarterien for at undgå blødning fra et fartøj punktering og passe på at infiltrere cellerne i myometrium og ikke endometrie hulrum. Pas på at bruge korrekt steril teknik under modeloprettelsen for at forhindre postoperativ infektion og for at beskytte dig selv med bariummaterialet under operationen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescent ortotopisk Mouse Model af kræft i bugspytkirtlen

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Eksperimentel Model af oprindelige tumor udvikling og Peritoneal Metastase<em&gt; via</em&gt; Orthotopisk Podning med ovariekarcinomceller

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolering af cirkulerende tumorceller i en ortotopisk musemodel af kolorektal cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Udvikling af en menneskelig prækliniske Model af Osteoclastogenesis fra perifert blod monocytter Co kulturperler med bryst kræft cellelinjer

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

En In Vivo Murine iskiasnerven Model af Perineural Invasion

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunofænotypning af Orthotopic Homograft (Syngeneic) af Murine primære KPC pancreas duktalt adenokarcinom ved flowcytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Development and Angiographic Use of the Rabbit VX2 Model for Liver Cancer

Udvikling og Angiografisk brug af kanin VX2 Model for leverkræft

The rabbit VX2 tumor is an animal model commonly utilized for translational research regarding hepatocellular carcinoma (HCC) in the field of ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Rumlig og tidsmæssig kontrol af murine melanom initiering fra mutant melanocyte stamceller

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studere Triple Negative Breast Cancer Brug Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

En orthotopic Resectional Mouse Model af kræft i bugspytkirtlen

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...