Name: an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells
Uploaded: 2019-09-12T12:30:00
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Cette étude a été financée par l'Institut de recherche Terry Fox (PPG-1075), l'Institut canadien de recherche en santé (Fondation Grant #154326), l'Institut de recherche de la Société canadienne du cancer (704718), le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada, Fondation pour l'innovation et Fondation Du Cancer Princess Margaret.
Je tiens à remercier le Dr Marguerite Akens d'avoir fourni les cellules VX2 initiales pour l'établissement du modèle VX2 initial et des blocs tumoraux VX2 congelés. Je tiens à remercier Marco DiGrappa pour avoir aidé à effectuer des expériences initiales de culture cellulaire VX2 et Lili Ding pour aider à la culture cellulaire VX2.

Fermeture profonde de la paroi abdominale : Identifiez le sommet de l'incision péritonéale et saisissez le péritoine, le rectus muscle et le fascia avec des forceps de tissu. Toutes les études sur les animaux ont été menées dans des installations approuvées par le Réseau universitaire de santé du Centre de ressources animales (ARC) et conformément aux protocoles approuvés d'utilisation et de soins des animaux (AUP #3994/#4299). La lignée cellulaire VX2 a été obtenue du laboratoire du Dr Aken au Réseau uni...

Ici, nous avons rapporté une méthode chirurgicale normalisée pour l'établissement d'un modèle de cancer de l'endomètre VX2 et rapporté sur la première utilisation des cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle. Le taux de prise de tumeur de 75% est inférieur au taux de 100% pour cent précédemment rapporté dans la littérature35,37,53,56; cependant, thw 90% taux de métastases pa...

Le cancer de l'endomètre, ou cancer de la muqueuse de l'utérus, est la deuxième malignité gynécologique la plus commune dans le monde et la malignité la plus commune dans les nations développées1. L'incidence du cancer de l'endomètre n'a cessé d'augmenter, augmentant de 2,3 % par an entre 2005 et 2013, avec une augmentation correspondante de 2,2 % de la mortalité1,2,3. Le diagnostic des métastases de ganglion lymphatique est primordial car la présence des ganglions lymphatiques positifs est un prédicteur négatif fort de la survie4,5,6,7et peut guider l'administration de thérapie adjuvante8,9,10,11,12,13. Les métastases des ganglions lymphatiques sont actuellement diagnostiquées en enlevant chirurgicalement le tissu lymphatique qui recense les principaux vaisseaux sanguins du bassin et de l'abdomen. Cette procédure, connue sous le nom de lymphadenectomy, est controversée en raison des données contradictoires de survie de deux grands essais14,15,16,17,18 et le connu risque de15,19,20 et morbidité postopératoire21,22,23. Comme les modalités actuelles d'imagerie non invasive n'ont pas la sensibilité et la spécificité requises pour remplacer la dissection24des ganglions lymphatiques, il y a eu une poussée pour développer de nouvelles techniques d'imagerie diagnostique. Pour tester ces nouvelles techniques dans un cadre préclinique, un modèle fiable de cancer de l'endomètre avec métastases rétropéritones des ganglions lymphatiques est nécessaire.
Le modèle de tumeur de lapin VX2 est un modèle bien établi qui a été employé intensivement pour étudier les tumeurs pleines humaines multiples d'organe25 comprenant le poumon26,la tête et le cou27,28, foie29,rein30, os31,32, cerveau33, pancréas34 et utérus35,36,37. Le modèle VX2 a été initialement développé en 1940 par Kidd et Rous38 en transplantant avec succès un virus du papillome de lapin à queue de coton découvert par Shope en 193339. Depuis lors, le modèle VX2 a été maintenu in vivo, nécessitant un passage en série dans le muscle quadriceps de lapins blancs de Nouvelle-Zélande40. Plus récemment cependant, plusieurs groupes ont réussi à cultiver des cellules VX2 in vitro40,41,42 et a démontré la tumorigénéité retenue de la lignée cellulaire cultivée31, 42,43. Les tumeurs vX2 sont histologiquement définies comme carcinomes squamous anapicieux de cellules44 et contiennent des dispositifs glandulaires qui ressemblent à l'adénocarcinome26. Les tumeurs sont caractérisées par la facilité d'implantation, la croissance rapide et l'hypervascularité44,45 et métastasé de façon fiable, le plus souvent aux ganglions lymphatiques régionaux et éloignés45. Les similitudes dans l'anatomie vasculaire et lymphatique utérine46 aussi bien que le site de croissance orthotopic assurent que le modèle métastatique du carcinome de Lapin VX2 imite celui du cancer humain d'endomètre, faisant le modèle de VX2 un modèle fiable pour étudier l'humain métastatique. En outre, les dispositifs histologiques tels que la prolifération microvasculaire anormale47, aussi bien que les similitudes immunologiques48 et génétiques49,50 entre les humains et les lapins suggèrent que la tumeur microenvironnement peut refléter celui du cancer de l'endomètre humain.
Plusieurs groupes ont fait rapport sur l'utilisation de VX2 pour créer un modèle de cancer de l'endomètre avec métastases rétropéritoéneavecles avec un taux élevé de réussite signalé36,51,52; cependant, il existe des variations significatives dans la littérature actuelle en ce qui concerne la méthode de création de modèles. Des doses de suspension cellulaire aussi bas que 4 x 105 cellules/corne utérine51 et aussi haut que 5 x 109 cellules/corne utérine37,53 ont été rapportées sans consensus standard sur la dose cellulaire VX2 requise. En outre, une série de méthodes d'inoculation ont été rapportées comprenant l'implantation micro-chirurgicale de la tumeur dans le myometrium utérin36,injection de suspension de cellules de VX237,44,52 , 53 et dans certains cas, l'ajout de la suture de corne utérine avant l'innoculation52. Enfin, aucun groupe n'a signalé l'utilisation de cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle. Ainsi, le but de cette étude est de démontrer une méthode normalisée réussie de création de modèle de VX2 et de rapporter la première utilisation des cellules cultivées de VX2 pour créer un modèle du cancer d'endomètre avec des métastases rétropéritoéines dans un lapin.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>11-blade scalpel, Sterile, Disposible</td>
			<td>Aspen Surgical (VWR)</td>
			<td>80094-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gague ear vein catheter</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>14332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 braided absorbable suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine (Atravet)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>4363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution (Poviodone iodine 10%)</td>
			<td>UHN Stores</td>
			<td>457955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>McGill University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine solution</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>119872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354450</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354408</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354400</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/HAM F12 1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Caledon Lab Chem</td>
			<td>1/10/4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril injectable)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>11242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube</td>
			<td>Corning Centri-Star</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12483020</td>
			<td>brand/source not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isohexol contrast</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>407141210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam 0.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>104674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>House Brand (UofT Medstore)</td>
			<td>1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Multicell or Sigma</td>
			<td>331-010-CL or D8537-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>CA45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)</td>
			<td>T.C.M.F (Dr Bristow)</td>
			<td>28-Jan-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Glue (Tissue Adhesive)</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>14695B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.25%), Proteomics Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6567-5X20UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-542-EL</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells

Le cancer de l'endomètre est la malignité gynécologique la plus courante en Amérique du Nord et l'incidence augmente dans le monde entier. Le traitement consiste en une chirurgie avec ou sans traitement adjuvant en fonction de la participation des ganglions lymphatiques telle que déterminée par lymphadenectomy. Lymphadenectomy est une procédure morbide, qui n'a pas été montrée pour avoir un avantage thérapeutique dans beaucoup de patients, et ainsi une nouvelle méthode pour diagnostiquer des métastases de ganglion lymphatique est exigée. Pour tester de nouveaux agents d'imagerie, un modèle fiable de cancer de l'endomètre avec métastases rétropéritones des ganglions lymphatiques est nécessaire. Le modèle de cancer endomètre vX2 a été décrit fréquemment dans la littérature ; toutefois, il existe des variations importantes en ce qui concerne la méthode d'établissement du modèle. En outre, aucune étude n'a rapporté sur l'utilisation de cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle que seules les cellules propagées in vivo ont été précédemment utilisés. Ici, nous présentons une méthode chirurgicale normalisée et une méthode de surveillance postopératoire pour l'établissement du modèle de cancer de l'endomètre VX2 et rapportons sur la première utilisation des cellules VX2 cultivées pour créer ce modèle.

Vingt-huit lapins ont été utilisés pour la création du modèle du cancer de l'endomètre. Les lapins avaient un poids moyen de 2,83 kg (2,71-3,58 kg) au moment de l'expérience. Les tumeurs utérines ont avec succès grandi dans 21 lapins pour un taux global de succès de modèle de 75%. Avant l'inclusion de la suture utérine dans le protocole, le taux de réussite était de 57% comparé à 81% après que la suture utérine ait été ajoutée. La suture utérine a été ajoutée au p...

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An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Ce protocole présente une méthode normalisée pour cultiver des cellules VX2 dans la culture et pour créer un modèle orthotopic VX2 du cancer de l'endomètre avec des métastases rétropéritonéales de ganglion lymphatique chez les lapins. Les modèles orthotopiques de cancer de l'endomètre sont importants pour l'étude préclinique des modalités d'imagerie nouvelles pour le diagnostic des métastases de ganglion lymphatique.

Un modèle orthotopic de cancer de l'endomètre avec lymphadénopathie rétropéritonel fabriqué à partir de cellules VX2 propagées et cultivées

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Ce modèle de cancer de l’endomètre VX2 avec métastase rétroperitoneal de ganglion lymphatique peut être employé pour étudier la technologie pour la chirurgie image-guidée. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est fiable, simple, et qu’elle crée une propagation métastatique cohérente, qui imite le modèle du cancer de l’endomètre humain. Dans l’ensemble, il s’agit d’une technique simple.Toutefois, la pratique de la suture avant de tenter de créer le modèle aidera à rendre le processus plus facile. La démonstration visuelle de cette technique est importante, car elle aide à démontrer les étapes chirurgicales impliquées dans l’établissement de modèle. Démontrant la procédure avec Harley Chan et moi serons Lili Ding, une technicienne de notre laboratoire.Pour préparer les cellules VX2 propagées in vitro à l’injection, commencez par réchauffer les flacons congelés des cellules VX2 dans une perle ou un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant une minute. Lorsque les cellules ont décongelé, tirez les suspensions cellulaires dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de milieu de culture. Sédimenter les cellules par centrifugation.Resuspendez la pastille en neuf millilitres de milieu. Transférer les cellules dans un grand flacon de culture pour incubation à 37 degrés Celsius sans trembler, en vérifiant les cellules quotidiennement pour la confluence par microscopie légère. Lorsque les cellules ont atteint 80% de confluence, ajouter trois millilitres de 0,2% trypsine à la fiole et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq minutes.Lorsque les cellules se sont détachées, transférer la suspension cellulaire dans un tube conique pour recueillir les cellules par centrifugation. Lavez la pastille de cellules trois fois avec neuf millilitres de PBS frais par lavage. Après le dernier lavage, resuspendre les cellules dans pbs frais pour compter avant de diluer à quatre fois 10 aux sept cellules VX2 par millilitre de concentration de PBS dans un nouveau tube conique sur la glace.Pour préparer les cellules VX2 in vivo-propagées pour l’injection, décongeler congelé un par un centimètre VX2 blocs tumoraux et utiliser un scalpel pour hacher les échantillons de tissus dans une plaque de culture. Transférer les fragments de tissu dans un filtre de 70 micromètres et ajouter de petits aliquots jusqu’à un millilitre de la solution de sel équilibrée de Hank, ou HBSS, pour s’assurer que toutes les cellules sont passées à travers la passoire. Comptez ensuite les cellules avant de diluer la suspension cellulaire à une fois 10 aux sept cellules VX2 par millilitre de concentration de HBSS dans un tube stérile sur la glace.Après avoir confirmé un manque de réponse au stimulus, placez le lapin néo-zélandais blanc anesthésié en position dorsale sur la table d’opération. Couper les cheveux sur le bassin et l’abdomen, et utiliser une préparation chirurgicale de la peau en trois étapes pour nettoyer la peau exposée. Portant un capuchon chirurgical et un masque facial, frottez les mains avec un désinfectant avant de mettre une robe stérile et des gants chirurgicaux stériles.Repèrez le dessus de l’os pubien et drapez le champ chirurgical avec des rideaux de laparotomie, laissant une zone de cinq par cinq centimètres du bas-ventre exposée. Ensuite, utilisez une lame de scalpel numéro 11 pour faire une incision de 2,5 centimètres d’un centimètre crânien à la symphyse pubis à travers la peau et les tissus sous-cutanés. Incise le rectus fascia et dissèque les muscles rectus latéralement pour exposer le péritoine sous-jacent.Confirmez que le sous-sol est dégagé de l’intestin ou d’autres organes abdominaux. Entrez brusquement dans le péritoine pour identifier la vessie urinaire et balayer un doigt ganté de façon supérieure, postérieure, et latéralement sur l’apex de la vessie pour localiser les cornes utérine. Extraire les cornes utérine par l’incision abdominale pour se reposer sur la paroi abdominale.Utilisez une suture absorbable tressée 3-0 pour effectuer une ligature de suture unique de chaque corne utérine, environ 1,5 à deux centimètres distal aux cols de l’utérus et juste médial aux artères utérine. Attachez ensuite les sutures confortablement pour inclure les cornes utérins distales. Pour inoculer le myometrium avec la suspension cellulaire VX2 précédemment préparée, chargez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 27 avec un millilitre de cellules.Injectez lentement 0,5 millilitres de suspension cellulaire pendant plus d’une minute dans chaque corne utérine proximale au site de suture entre la suture et le col de l’utérus. Ensuite, appliquez une pression sur le site d’injection myométrial pendant 30 secondes pour minimiser les fuites cellulaires. Inspecter les sites d’injection et de suture pour l’hémostase avant de placer les cornes utérine dans l’abdomen.Pour la fermeture profonde de mur abdominal, identifiez l’apex de l’incision péritonéale et utilisez une pince chirurgicale pour saisir le muscle et le fascia de rectus de péritoine. Ancrer la suture en plaçant une suture de polyfilament absorbable 3-0, superficielle à profonde sur un sommet de l’incision, et profonde à superficielle de l’autre. À l’aide de la suture ci-jointe, faire des points de course perpendiculaires à l’incision à travers les couches de la paroi abdominale, en travaillant étape-sage le long de l’incision d’un côté à l’autre avant d’attacher la suture et couper les extrémités lâches.Pour la fermeture superficielle de mur abdominal, utilisez une suture subcuticulaire subcuticulaire enterrée de polyfilament 3-0 pour suturer profondément à superficielle d’un côté de l’incision et superficielle à profonde de l’autre. Après avoir noué les sutures, utilisez les sutures ancrées pour faire des points de course dans la couche cutanée parallèle à l’incision, en travaillant étape-sage le long de l’incision d’un côté à l’autre. Attacher les sutures et retirer les extrémités lâches.Appliquer de la colle chirurgicale sur l’incision fermée pour apposer les bords de la peau. Ensuite, placez l’animal sur une couverture chaude avec de l’oxygène et de la surveillance, jusqu’à ce que l’animal soit alerte et capable de s’asseoir indépendamment. Lors de l’établissement de ce modèle, une dose de deux fois 10 aux sept cellules par corne utérine a été couronnée de succès chez quatre lapins, dans un délai moyen de 45 jours de l’inoculation à l’expérience et a donc été déterminée comme la dose d’injection optimale pour le modèle VX2 cultivé.Pour le modèle VX2 in vivo-propagé, qui a été créé avec succès dans 16 lapins avec un temps moyen de l’inoculation à l’expérience de 29 jours, cinq fois 10 aux six cellules par corne utérine a été déterminée comme dose optimale d’injection. Tous les modèles ont eu comme conséquence une transformation métastatique réussie des ganglions lymphatiques rétroperitoneal. En outre, les tumeurs et les ganglions lymphatiques métastatiques des cellules VX2 cultivés sont apparus semblables aux tumeurs des cellules VX2 in vivo-propagées par l’analyse histologique, avec des cellules densymetoxolin-souillées observées dans le muscle envahissant et formant des structures glandulaires comme avec beaucoup de figures mytotiques pathologiques.Placez votre perle de suture à l’artère utérine pour éviter le saignement d’une ponction de navire et prenez soin d’infiltrer les cellules dans le myometrium et non la cavité endométriale. Prenez soin d’utiliser une technique stérile appropriée pendant la création du modèle pour prévenir l’infection postopératoire et pour vous protéger avec le matériel de baryum pendant la chirurgie.

Research

JoVE Journal

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