Name: an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells
Uploaded: 2019-09-12T12:30:00
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Diese Studie wurde vom Terry Fox Research Institute (PPG-1075), dem Canadian Institute of Health Research (Foundation Grant #154326), dem Canadian Cancer Society Research Institute (704718), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Stiftung für Innovation und Prinzessin Margaret Cancer Foundation.
Ich möchte Dr. Marguerite Akens für die Bereitstellung der ersten VX2-Zellen für die Etablierung des ursprünglichen VX2-Modells und der gefrorenen VX2-Tumorblöcke danken. Ich möchte Marco DiGrappa für die Unterstützung bei der Durchführung erster VX2-Zellkulturexperimente und Lili Ding für die Unterstützung bei der VX2-Zellkultur danken.

Tiefer Bauchwandverschluss: Identifizieren Sie die Spitze des Peritonealschnitts und greifen Sie das Peritoneum, den Rectusmuskel und die Faszien mit Gewebezangen. Alle Tierstudien wurden in den vom Animal Resource Center (ARC) zugelassenen Einrichtungen des University Health Network und in Übereinstimmung mit zugelassenen Tiernutzungs- und Pflegeprotokollen (AUP #3994/#4299) durchgeführt. Die VX2-Zelllinie wurde aus Dr. Akens Labor am University Health Network gewonnen.
1. Erstellung von In-v...

Hierin haben wir über eine standardisierte chirurgische Methode zur Etablierung eines VX2-Endometriumkrebsmodells berichtet und über die erste Verwendung kultivierter VX2-Zellen berichtet, um dieses Modell zu erstellen. Die Tumoraufnahmerate von 75% ist niedriger als die 100% Prozent Rate zuvor in der Literatur berichtet35,37,53,56; jedoch ist die Rate der pathologisch bestätigten Lymphknote...

Endometriumkrebs, oder Krebs der Gebärmutterschleimhaut, ist die zweithäufigste gynäkologische Malignität weltweit und die häufigste Malignität in entwickelten Ländern1. Die Inzidenz von Endometriumkrebs hat stetig zugenommen und ist zwischen 2005 und 2013 um 2,3 % pro Jahr gestiegen, wobei die Sterblichkeit entsprechend um 2,2 % gestiegen ist1,2,3. Die Diagnose von Lymphknotenmetastasen ist von größter Bedeutung, da das Vorhandensein positiver Lymphknoten ein starker negativer Vorhersagegeber für das Überleben4,5,6,7 ist und die adjuvante Therapie8,9,10,11,12,13. Lymphknotenmetastasen werden derzeit diagnostiziert, indem das Lymphgewebe, das über die wichtigsten Blutgefäße im Becken und Bauch liegt, operativ entfernt wird. Dieses Verfahren, bekannt als Lymphadenektomie, ist aufgrund widersprüchlicher Überlebensdaten aus zwei großen Studien14,15,16,17,18 und der bekannten Risiko einer intraoperativen15,19,20 und postoperativen Morbidität21,22,23. Da die aktuellen nicht-invasiven bildgebenden Modalitäten nicht über die erforderliche Empfindlichkeit und Spezifität verfügen, um lymphknotendissektion24zu ersetzen, wurde versucht, neue diagnostische Bildgebungstechniken zu entwickeln. Um diese neuartigen Techniken in einem präklinischen Umfeld zu testen, ist ein zuverlässiges Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Lymphknotenmetastasen erforderlich.
Das Kaninchen VX2 Tumormodell ist ein etabliertes Modell, das ausgiebig verwendet wurde, um mehrere menschliche solide Organtumoren25 einschließlich Lunge26, Kopf und Hals27,28, Leber29, Niere30, Knochen31,32, Gehirn33, Bauchspeicheldrüse34 und Gebärmutter35,36,37. Das VX2-Modell wurde ursprünglich 1940 von Kidd und Rous38 durch die erfolgreiche Transplantation eines Baumwollschwanz-Kaninchen-Papilloma-Virus von Shope im Jahr 1933entdeckt 39entwickelt. Seit dieser Zeit wurde das VX2-Modell in vivo beibehalten, was eine serielle Passage im Quadrizeps-Muskel von White New Zealand Kaninchen40erfordert. In jüngerer Zeit jedoch haben mehrere Gruppen erfolgreich VX2-Zellen in vitro40,41,42 angebaut und die zurückgehaltene Tumorigenität der kultivierten Zelllinie31 , 42,43. VX2-Tumoren sind histologisch als anaplastische Plattenepithelkarzinome44 definiert und enthalten Drüsenmerkmale, die dem Adenokarzinom26ähneln. Tumore zeichnen sich durch einfache Implantation, schnelles Wachstum und Hypervaskularität44,45 und zuverlässig metastasieren, am häufigsten auf regionale und entfernte Lymphknoten45. Ähnlichkeiten in der Gefäß- und Lymphanatomie46 sowie der orthotopischen Wachstumsstelle stellen sicher, dass das metastasierende Muster des Kaninchens VX2-Karzinom dem des menschlichen Endometriumkrebses nachahmt, was das VX2-Modell zu einem zuverlässigen Modell für die Untersuchung menschlicher metastasierende Erkrankung. Darüber hinaus deuten histologische Merkmale wie abnorme mikrovaskuläre Proliferation47 sowie immunologische48 und genetische Ähnlichkeiten49,50 zwischen Mensch und Kaninchen darauf hin, dass der Tumor Mikroumgebung kann die des menschlichen Endometriumkrebses widerspiegeln.
Mehrere Gruppen haben über die Verwendung von VX2 berichtet, um ein Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Metastasen mit einer hohen gemeldeten Erfolgsrate36,51,52zu erstellen; In der aktuellen Literatur bestehen jedoch erhebliche Unterschiede hinsichtlich der Methode der Modellerstellung. Zellsuspensionsdosen so niedrig wie 4 x 105 Zellen/Gebärmutterhorn51 und so hoch wie 5 x 109 Zellen/Uterushorn37,53 wurden ohne Standardkonsens über die erforderliche VX2 Zelldosis berichtet. Außerdem wurden eine Vielzahl von Impfmethoden berichtet, einschließlich mikrochirurgischer Implantation von Tumoren in das Uterusmyometrium36, Injektion von VX2-Zellsuspension37,44,52 , 53 und in einigen Fällen die Zugabe von Uterushorn-Nähte vor der Innokulation52. Schließlich haben keine Gruppen die Verwendung von kultivierten VX2-Zellen gemeldet, um dieses Modell zu erstellen. Der Zweck dieser Studie besteht also darin, eine erfolgreiche standardisierte Methode der VX2-Modellerstellung zu demonstrieren und die erste Verwendung kultivierter VX2-Zellen zu melden, um ein Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Metastasen bei einem Kaninchen zu erstellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>11-blade scalpel, Sterile, Disposible</td>
			<td>Aspen Surgical (VWR)</td>
			<td>80094-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gague ear vein catheter</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>14332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 braided absorbable suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine (Atravet)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>4363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution (Poviodone iodine 10%)</td>
			<td>UHN Stores</td>
			<td>457955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>McGill University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine solution</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>119872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354450</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354408</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354400</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/HAM F12 1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Caledon Lab Chem</td>
			<td>1/10/4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril injectable)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>11242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube</td>
			<td>Corning Centri-Star</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12483020</td>
			<td>brand/source not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isohexol contrast</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>407141210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam 0.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>104674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>House Brand (UofT Medstore)</td>
			<td>1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Multicell or Sigma</td>
			<td>331-010-CL or D8537-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>CA45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)</td>
			<td>T.C.M.F (Dr Bristow)</td>
			<td>28-Jan-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Glue (Tissue Adhesive)</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>14695B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.25%), Proteomics Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6567-5X20UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-542-EL</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells

Endometriumkrebs ist die häufigste gynäkologische Malignität in Nordamerika und die Inzidenz steigt weltweit. Die Behandlung besteht aus einer Operation mit oder ohne adjuvante Therapie in Abhängigkeit von lymphen Knoten Beteiligung, wie durch Lymphadenektomie bestimmt. Lymphadenektomie ist ein morbides Verfahren, das bei vielen Patienten keinen therapeutischen Nutzen hat, und daher ist eine neue Methode zur Diagnose von Lymphknotenmetastasen erforderlich. Um neuartige Bildgebungsmittel zu testen, ist ein zuverlässiges Modell von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Lymphknotenmetastasen erforderlich. Das Modell des VX2-Endometriumkarzinoms wurde häufig in der Literatur beschrieben; Hinsichtlich der Methode der Modelleinrichtung bestehen jedoch erhebliche Unterschiede. Darüber hinaus wurden keine Studien über die Verwendung kultivierter VX2-Zellen zur Erstellung dieses Modells berichtet, da bisher nur in vivo propagierte Zellen verwendet wurden. Hierbei stellen wir eine standardisierte chirurgische Methode und postoperative Überwachungsmethode zur Etablierung des VX2-Endometriumkrebsmodells vor und berichten über die erste Verwendung kultivierter VX2-Zellen zur Erstellung dieses Modells.

28 Kaninchen wurden für die Erstellung des Endometriumkrebsmodells verwendet. Kaninchen hatten zum Zeitpunkt des Experiments ein Durchschnittsgewicht von 2,83 kg (2,71-3,58 kg). Uterustumoren wuchsen erfolgreich bei 21 Kaninchen für eine Gesamterfolgsrate von 75%. Vor der Aufnahme von Gebärmutternaht in das Protokoll betrug die Erfolgsrate 57% im Vergleich zu 81% nach der Gebärmutternaht. Uterine Nähte wurde dem Protokoll nach dem7. Kaninchen als Reaktion auf die anfängli...

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An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Dieses Protokoll stellt eine standardisierte Methode zum Wachstum von VX2-Zellen in Kultur dar und zur Erstellung eines orthotopischen VX2-Modells von Endometriumkrebs mit retroperitonealen Lymphknotenmetastasen bei Kaninchen. Orthotopische Endometriumkrebsmodelle sind wichtig für die präklinische Untersuchung neuartiger bildgebender Modalitäten für die Diagnose von Lymphknotenmetastasen.

Ein orthotopisches Endometriumkrebs-Modell mit retroperitonealer Lymphadenopathie made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Dieses VX2-Endometriumkrebsmodell mit retroperitonealer Lymphknotenmetastasierung kann zur Untersuchung von Technologie für bildgeführte Chirurgie verwendet werden. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie zuverlässig, einfach ist und eine konsistente metastasierende Ausbreitung erzeugt, die das Muster des menschlichen Endometriumkrebses imitiert. Insgesamt ist dies eine einfache Technik.Das Üben des Nahts vor dem Versuch, das Modell zu erstellen, wird jedoch dazu beitragen, den Prozess zu vereinfachen. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist wichtig, da sie hilft, die chirurgischen Schritte bei der Modelleinrichtung zu demonstrieren. Demonstrieren das Verfahren mit Harley Chan und ich wird Lili Ding, eine Technikerin aus unserem Labor.Um in vitro vermehrte VX2-Zellen für die Injektion vorzubereiten, beginnen Sie mit der Erwärmung gefrorener Durchstechflaschen von VX2-Zellen in einer 37 Grad Celsius Perlen oder einem Wasserbad für eine Minute. Wenn die Zellen aufgetaut sind, ziehen Sie die Zellsuspensionen in einem 15-Milliliter-Rohr mit 10 Milliliter Kulturmedium. Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.Das Pellet in neun Millilitern Medium wieder aufhängen. Übertragen Sie die Zellen in einen großen Kulturkolben für die Inkubation bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln, und überprüfen Sie die Zellen täglich auf Zusammenfluss durch Lichtmikroskopie. Wenn die Zellen 80 % Konfluenz erreicht haben, fügen Sie dem Kolben drei Milliliter 0,2% Trypsin hinzu und geben Sie die Zellen für fünf Minuten an den Zellkultur-Inkubator zurück.Wenn sich die Zellen gelöst haben, übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches Rohr, um die Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. Waschen Sie das Zellpellet dreimal mit neun Millilitern frischer PBS pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche die Zellen in frischem PBS zur Zählung wieder aussetzen, bevor Sie in einer neuen konischen Röhre auf Eis auf viermal 10 auf die sieben VX2-Zellen pro Milliliter PBS-Konzentration verdünnen.Um in vivo-vermehrte VX2-Zellen für die Injektion vorzubereiten, tauen Sie eins um einen Zentimeter VX2-Tumorblöcke auf und verwenden Sie ein Skalpell, um die Gewebeproben in einer Kulturplatte zu zerkleinern. Übertragen Sie die Gewebefragmente in einen 70-Mikrometer-Filter und fügen Sie kleine Aliquots von bis zu einem Milliliter von Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) hinzu, um sicherzustellen, dass alle Zellen durch das Sieb geleitet werden. Dann zählen Sie die Zellen, bevor Sie die Zellsuspension auf ein mal 10 bis zu den sieben VX2-Zellen pro Milliliter HBSS-Konzentration in einer sterilen Röhre auf Eis verdünnen.Nachdem Sie einen Mangel an Reaktion auf Stimulus bestätigt haben, legen Sie das anästhesierte weibliche weiße neuseeländische Kaninchen in die dorsale Position auf den Operationstisch. Schneiden Sie das Haar über das Becken und den Bauch, und verwenden Sie eine dreistufige chirurgische Hautvorbereitung, um die exponierte Haut zu reinigen. Mit einer chirurgischen Mütze und Gesichtsmaske, schrubben Sie die Hände mit Desinfektionsmittel, bevor Sie ein steriles Kleid und sterile chirurgische Handschuhe anziehen.Landmark die Spitze des Schambeins und drapieren das operationsopische Feld mit Laparotomie-Vorhänge, so dass eine fünf mal fünf Zentimeter Bereich des Unterbauchs ausgesetzt. Als nächstes verwenden Sie eine Nummer 11 Skalpellklinge, um einen 2,5-Zentimeter-Schnitt einen Zentimeter Schädel zur Symphyse pubis durch Haut und Subkutangewebe zu machen. Incise die rectus fascia und sezieren Sie die Rectus-Muskeln seitlich, um das zugrunde liegende Peritoneum zu entlarven.Bestätigen Sie, dass die Unterfläche frei von Darm oder anderen Bauchorganen ist. Sgenau in das Peritoneum, um die Harnblase zu identifizieren und einen gehandicapten Finger überlegen, nachträvoll und seitlich über die Spitze der Blase zu fegen, um die Gebärmutterhörner zu lokalisieren. Extrahieren Sie die Uterushörner durch den Bauchschnitt, um auf der Bauchwand zu ruhen.Verwenden Sie eine 3-0 geflochtene resorbierbare Naht, um eine einzige Nahtligation jedes Gebärmutterhorns durchzuführen, etwa 1,5 bis zwei Zentimeter distal zu den Cervices und nur medial zu den Gebärmutterarterien. Dann binden Sie die Nähte eng, um die distalen Uterushörner einzuschließen. Um das Myometrium mit der zuvor vorbereiteten VX2-Zellsuspension zu impfen, laden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 27-Spur-Nadel mit einem Milliliter Zellen.Injizieren Sie langsam 0,5 Milliliter der Zellsuspension über eine Minute in jedes Gebärmutterhorn proximal in die Nahtstelle zwischen der Naht und dem Gebärmutterhals. Dann drücken Sie 30 Sekunden lang druck auf die myometriale Injektionsstelle, um zelllose Leckagen zu minimieren. Inspizieren Sie die Injektions- und Nahtstellen auf Hämostase, bevor Sie die Uterushörner wieder in den Bauch legen.Für tiefe Bauchwandverschluss, identifizieren Sie die Spitze des peritonealen Schnittund und verwenden Sie eine chirurgische Klemme, um das Peritoneum rectus Muskel und Faszien zu erfassen. Verankern Sie die Naht, indem Sie eine 3-0 resorbierbare Polyfilament-Naht, oberflächlich bis tief auf einem Scheitelpunkt des Einschnitts, und tief bis oberflächlich auf der anderen. Mit der beigefügten Naht, machen Laufstiche senkrecht zum Schnitt durch die Schichten der Bauchwand, arbeiten schrittweise entlang des Schnittes von Seite zu Seite, bevor Sie die Naht binden und schneiden Die losen Enden.Für oberflächliche Bauchwandverschluss, verwenden Sie eine vergrabene laufende untergeschnittene subcuticular 3-0 resorbierbare Polyfilament-Naht, um tief bis oberflächlich auf der einen Seite des Einschnitts und oberflächlich bis tief auf der anderen zu verschließen. Nach dem Verknoten der Nähte verwenden Sie die verankerten Nähte, um Laufstiche in der dermalen Schicht parallel zum Schnitt zu machen, und arbeiten sie schrittweise entlang des Schnitts von Seite zu Seite. Binden Sie die Nähte und entfernen Sie die losen Enden.Tragen Sie chirurgischen Kleber auf den geschlossenen Schnitt auf, um die Hautränder zu appose. Dann legen Sie das Tier auf eine warme Decke mit Sauerstoff und Überwachung, bis das Tier wachsam ist und in der Lage ist, unabhängig zu sitzen. Bei der Etablierung dieses Modells war eine Dosis von zwei mal 10 auf die sieben Zellen pro Gebärmutterhorn bei vier Kaninchen erfolgreich, in einer durchschnittlichen Zeit von 45 Tagen von der Impfung bis zum Experiment und wurde somit als optimale Injektionsdosis für das kultivierte VX2-Modell bestimmt.Für das in vivo-vermehrte VX2-Modell, das erfolgreich bei 16 Kaninchen mit einer durchschnittlichen Zeit von der Impfung bis zum Experiment von 29 Tagen erstellt wurde, wurde fünfmal 10 bis zu den sechs Zellen pro Gebärmutterhorn als optimale Injektionsdosis bestimmt. Alle Modelle führten zu einer erfolgreichen metastasierenden Transformation der retroperitonealen Lymphknoten. Darüber hinaus erschienen Tumore und metastasierende Lymphknoten aus kultivierten VX2-Zellen tumoren aus in vivo-vermehrten VX2-Zellen durch histologische Analyse ähnlich, wobei Densymetoxolin-gefärbte Zellen im eindringenden Muskel beobachtet wurden und drüsenähnliche Strukturen mit vielen pathologischen mytotischen Figuren bildeten.Legen Sie Ihre Naht medial auf die Gebärmutterarterie, um Blutungen aus einer Gefäßpunktion zu vermeiden und achten Sie darauf, die Zellen in das Myometrium und nicht in die Endometriumhöhle zu infiltrieren. Achten Sie darauf, während der Modellerstellung die richtige sterile Technik zu verwenden, um eine postoperative Infektion zu verhindern und sich während der Operation mit dem Bariummaterial zu schützen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Forschung

Krebsforschung

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