Name: an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells
Uploaded: 2019-09-12T12:30:00
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Questo studio è stato finanziato dal Terry Fox Research Institute (PPG-1075), dal Canadian Institute of Health Research (Foundation Grant #154326), dal Canadian Cancer Society Research Institute (704718), dal Natural Sciences and Engineering Research Council del Canada, Fondazione per l'Innovazione e Principessa Margaret Cancer Foundation.
Vorrei ringraziare il Dr. Marguerite Akens per aver fornito le cellule VX2 iniziali per la creazione del modello VX2 iniziale e i blocchi tumorali VX2 congelati. Vorrei ringraziare Marco DiGrappa per aver contribuito a eseguire esperimenti iniziali di coltura cellulare VX2 e Lili Ding per aver contribuito con la coltura cellulare VX2.

Chiusura profonda della parete addominale: Identificare l'apice dell'incisione peritoneale e afferrare il peritoneo, il muscolo retto e la forza del tessuto della fascia. Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti nelle strutture approvate dall'Animal Resource Center (ARC) dell'University Health Network e in conformità con i protocolli approvati per l'uso e la cura degli animali (AUP #3994/#4299). La linea cellulare VX2 è stata ottenuta dal Dr. Aken's Lab presso l'University Health Network.
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Qui, abbiamo segnalato un metodo chirurgico standardizzato per la creazione di un modello di cancro dell'endometrio VX2 e riportato sul primo uso di cellule VX2 coltivate per creare questo modello. Il tumore prendere tasso di 75% è inferiore al 100% percentuale tasso precedentemente riportato nella letteratura35,37,53,56; tuttavia, il tasso del 90% di metastasi di linfonodi patologicamente con...

Il cancro dell'endometrio, o cancro del rivestimento dell'utero, è la seconda malignità ginecologica più comune al mondo e la malignità più comune nelle nazioni sviluppate1. L'incidenza del cancro endometriale è aumentata costantemente, aumentando del 2,3% all'anno tra il 2005 e il 2013 con un corrispondente aumento del 2,2% della mortalità1,2,3. La diagnosi delle metastasi dei linfonodi è fondamentale in quanto la presenza di linfonodi positivi è un forte predittore negativo di sopravvivenza4,5,6,7 e può guidare la somministrazione di terapia adiuvante8,9,10,11,12,13. Le metastasi dei linfonodi sono attualmente diagnosticate rimuovendo chirurgicamente il tessuto linfatico sovrastante i principali vasi sanguigni del bacino e dell'addome. Questa procedura, nota come linfodenectomia, è controversa a causa di dati di sopravvivenza contrastanti da due grandi prove14,15,16,17,18 e il noto rischio di15,19,20 e morbilità post-operatoria21,22,23. Poiché le attuali modalità di imaging non invasivo non hanno la sensibilità e la specificità necessarie per sostituire la dissezionen. 24dei linfonodi, c'è stata una spinta a sviluppare nuove tecniche di imaging diagnostico. Per testare queste nuove tecniche in un ambiente preclinico, è necessario un modello affidabile di cancro endometriale con metastasi di linfonodi retroperitoneali.
Il coniglio VX2 modello tumorale è un modello ben consolidato che è stato ampiamente utilizzato per studiare più tumori dell'organo solido umano25 tra cui polmone26, testa e collo27,28, fegato29, rene30, osso31,32, cervello33, pancreas34 e utero35,36,37. Il modello VX2 è stato originariamente sviluppato nel 1940 da Kidd e Rous38 trapiantando con successo un papilloma di coniglio di cotone scoperto da Shope nel 193339. Da quel momento, il modello VX2 è stato mantenuto in vivo, richiedendo il passaggio seriale nel muscolo quadricipite dei conigli bianchi della Nuova èelanda40. Più recentemente, tuttavia, più gruppi sono cresciuti con successo cellule VX2 in vitro40,41,42 e dimostrato la tumorigeneità mantenuta della linea cellulare coltivata31, 42,43. I tumori VX2 sono istologicamente definiti come carcinomi a cellule squamose anaplastiche44 e contengono caratteristiche ghiandolari che assomigliano adenocarcinoma26. I tumori sono caratterizzati da facilità di impianto, rapida crescita e ipervascolarizzazione44,45 e metastatizza in modo affidabile, più comunemente ai linfonodi regionali e distanti45. Le somiglianze nell'anatomia vascolare e linfatica uterina46 così come il sito di crescita ortotopica assicurano che il modello metastatico del coniglio VX2 carcinoma mimi quello del cancro endometriale umano, rendendo il modello VX2 un modello affidabile per lo studio umano malattia metastatica. Inoltre, caratteristiche istologiche come la proliferazione microvascolare anormale47 , così come immunologiche48 e somiglianze genetiche49,50 tra gli esseri umani e i conigli suggeriscono che il tumore microambiente può riflettere quello del cancro dell'endometrio umano.
Più gruppi hanno riferito sull'uso di VX2 per creare un modello di cancro endometriale con metastasi retroperitoneali con un alto tasso riportato di successo36,51,52; tuttavia, esiste una variazione significativa all'interno della letteratura attuale rispetto al metodo di creazione del modello. Dosi di sospensione cellulare a partire da 4 x 105 cellule / corno uterino51 e fino a 5 x 109 cellule / corno uterino37,53 sono stati segnalati con nessun consenso standard sulla dose cellulare VX2 richiesta. Inoltre, una varietà di metodi di inoculazione sono stati segnalati tra cui l'impianto micro-chirurgico del tumore nel miometrio uterino36, iniezione di sospensione cellulare VX237,44,52 , 53 e in alcuni casi, l'aggiunta di corno uterino sutura prima dell'innoculazione52. Infine, nessun gruppo ha segnalato l'uso di cellule VX2 coltivate per creare questo modello. Pertanto, lo scopo di questo studio è quello di dimostrare un metodo standardizzato di successo di creazione del modello VX2 e di segnalare il primo utilizzo di cellule VX2 coltivate per creare un modello di cancro endometriale con metastasi retroperitoneali in un coniglio.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>11-blade scalpel, Sterile, Disposible</td>
			<td>Aspen Surgical (VWR)</td>
			<td>80094-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gague ear vein catheter</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>14332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 braided absorbable suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine (Atravet)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>4363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution (Poviodone iodine 10%)</td>
			<td>UHN Stores</td>
			<td>457955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>McGill University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine solution</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>119872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354450</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354408</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354400</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/HAM F12 1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Caledon Lab Chem</td>
			<td>1/10/4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril injectable)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>11242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube</td>
			<td>Corning Centri-Star</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12483020</td>
			<td>brand/source not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isohexol contrast</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>407141210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam 0.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>104674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>House Brand (UofT Medstore)</td>
			<td>1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Multicell or Sigma</td>
			<td>331-010-CL or D8537-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>CA45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)</td>
			<td>T.C.M.F (Dr Bristow)</td>
			<td>28-Jan-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Glue (Tissue Adhesive)</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>14695B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.25%), Proteomics Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6567-5X20UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-542-EL</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells

Il cancro dell'endometrio è la malignità ginecologica più comune in Nord America e l'incidenza è in aumento in tutto il mondo. Il trattamento consiste in un intervento chirurgico con o senza terapia adiuvante a seconda del coinvolgimento del linfonodo determinato dalla linfadenectomia. La linfodenectomia è una procedura morbosa, che non è stata dimostrata avere un beneficio terapeutico in molti pazienti, e quindi è necessario un nuovo metodo per diagnosticare le metastasi dei linfonodi. Per testare nuovi agenti di imaging, è necessario un modello affidabile di cancro endometriale con metastasi di linfonodi retroperitoneali. Il modello di cancro endometriale VX2 è stato descritto frequentemente nella letteratura; tuttavia, esiste una variazione significativa rispetto al metodo di stabilimento del modello. Inoltre, non sono stati riportati studi sull'uso di cellule VX2 coltivate per creare questo modello in quanto solo le cellule propagate in vivo sono state utilizzate in precedenza. Qui, vi presentiamo un metodo chirurgico standardizzato e un metodo di monitoraggio post-operatorio per la creazione del modello di cancro endometriale VX2 e riferiamo sul primo utilizzo di cellule VX2 coltivate per creare questo modello.

Ventotto conigli sono stati utilizzati per la creazione del modello di cancro dell'endometriale. I conigli avevano un peso medio di 2,83 kg (2,71-3,58 kg) al momento dell'esperimento. I tumori uterini sono cresciuti con successo in 21 conigli per un tasso di successo generale del modello del 75%. Prima dell'inclusione della sutura uterina nel protocollo, il tasso di successo era del 57% rispetto all'81% dopo l'aggiunta della sutura uterina. La sutura uterina è stata aggiunta al protocoll...

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An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Questo protocollo presenta un metodo standardizzato per far crescere le cellule VX2 in coltura e per creare un modello ortotopico VX2 di cancro endometriale con metastasi di linfonodi retroperitoneali nei conigli. I modelli di cancro endometriali ortotopici sono importanti per lo studio preclinico di nuove modalità di imaging per la diagnosi delle metastasi dei linfonodi.

Un modello di cancro endometriale ortotopico con retroperitoneale Lmphadenopatia fatta da cellule VX2 in vivo propagate e coltivate

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Questo modello di cancro endometriale VX2 con metastasi del linfonodo retroperitoneale può essere utilizzato per studiare la tecnologia per la chirurgia guidata dall'immagine. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è affidabile, semplice e che crea una diffusione metastatica coerente, che imita il modello del cancro endometriale umano. Nel complesso, questa è una tecnica semplice.Tuttavia, praticare la sutura prima di tentare di creare il modello aiuterà a semplificare il processo. La dimostrazione visiva di questa tecnica è importante, in quanto aiuta a dimostrare le fasi chirurgiche coinvolte nello stabilimento del modello. A dimostrare la procedura con Harley Chan e io saremo Lili Ding, un tecnico del nostro laboratorio.Per preparare le cellule VX2 propagate in vitro per l'iniezione, iniziare riscaldando fiale congelate di cellule VX2 in un tallone o bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per un minuto. Quando le cellule si sono scongelate, tirare le sospensioni cellulari in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo di coltura. Sedimentare le cellule mediante centrifugazione.Resuspend il pellet in nove millilitri di mezzo. Trasferire le cellule in un grande pallone da coltura per l'incubazione a 37 gradi Celsius senza tremare, controllando quotidianamente le cellule per la confluenza mediante microscopia leggera. Quando le celle hanno raggiunto l'80% di confluenza, aggiungere tre millilitri dello 0,2% di tripina al pallone e riportare le celle nell'incubatore di coltura cellulare per cinque minuti.Quando le cellule si sono staccate, trasferire la sospensione cellulare su un tubo conico per raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Lavare il pellet cellulare tre volte con nove millilitri di PBS fresco per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, resospendare le cellule in PBS fresco per il conteggio prima di diluire a quattro volte 10 alle sette cellule VX2 per millilitro di concentrazione di PBS in un nuovo tubo conico sul ghiaccio.Per preparare le cellule VX2 propagate in vivo per l'iniezione, scongelare i blocchi tumorali VX2 congelati uno per un centimetro e utilizzare un bisturi per tritare i campioni di tessuto in una piastra di coltura. Trasferire i frammenti di tessuto in un filtro da 70 micrometri e aggiungere piccole aliquote fino a un millilitro della soluzione salina bilanciata di Hank, o HBSS, per garantire che tutte le cellule vengano passate attraverso il colino. Quindi contare le cellule prima di diluire la sospensione cellulare a una per 10 alle sette cellule VX2 per millilitro di concentrazione di HBSS in un tubo sterile sul ghiaccio.Dopo aver confermato una mancanza di risposta allo stimolo, posizionare il coniglio bianco della Nuova Zelanda anestetizzato nella posizione dorsale sulla tavola operatoria. Ritagliare i capelli sul bacino e sull'addome e utilizzare una preparazione chirurgica della pelle in tre gradini per pulire la pelle esposta. Indossando un berretto chirurgico e una maschera per il viso, strofinare le mani con disinfettante prima di indossare un abito sterile e guanti chirurgici sterili.Punto di riferimento la parte superiore dell'osso pubico e drappeggiare il campo chirurgico con tende di laparotomia, lasciando esposta un'area di cinque per cinque centimetri dell'addome inferiore. Successivamente, utilizzare una lama bisturi numero 11 per fare un'incisione di 2,5 centimetri di un centimetro cranica alla sinfisi pubica attraverso la pelle e il tessuto sottocutaneo. Incidere la fascia del retto e sezionare lateralmente i muscoli del retto per esporre il peritoneo sottostante.Verificare che il sottosuolo sia libero dall'intestino o da altri organi addominali. Entra bruscamente nel peritoneo per identificare la vescica urinaria e spazzare un dito guantato in modo superiore, posteriore e laterale sopra l'apice della vescica per localizzare le corna uterine. Estrarre le corna uterine attraverso l'incisione addominale per riposare sulla parete addominale.Utilizzare una sutura assorbibile intrecciata 3-0 per eseguire una singola legatura sutura di ogni corno uterino, approssimativamente da 1,5 a due centimetri distale alle cervice e solo mediale alle arterie uterine. Quindi legare le suture comodamente per includere le corna uterine distali. Per inoculare il miometrio con la sospensione cellulare VX2 precedentemente preparata, caricare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 27 con un millilitro di cellule.Iniettare lentamente 0,5 millilitri della sospensione cellulare per oltre un minuto in ogni corno uterino prossimale al sito di sutura tra la sutura e la cervice. Quindi applicare pressione sul sito di iniezione miometriale per 30 secondi per ridurre al minimo la perdita di cellule. Ispezionare i siti di iniezione e sutura per l'emostasi prima di riposizionare le corna uterine nell'addome.Per la chiusura profonda della parete addominale, identificare l'apice dell'incisione peritoneale e utilizzare un morsetto chirurgico per afferrare il muscolo retto del peritoneo e la fascia. Ancorare la sutura posizionando una sutura di polifilamento assorbibile 3-0, superficiale a profonda su un apice dell'incisione e da profonda a superficiale dall'altra. Usando la sutura attaccata, rendere i punti di corsa perpendicolari all'incisione attraverso gli strati della parete addominale, lavorando passo dopo passo lungo l'incisione da un lato all'altro prima di legare la sutura e tagliare le estremità sciolte.Per la chiusura superficiale della parete addominale, utilizzare una sutura di polifilamento assorbibile sottocuticolare 3-0 sepolta per suturare da profonda a superficiale da un lato dell'incisione e superficiale a profondo dall'altro. Dopo aver annodato le suture, utilizzare le suture ancorate per rendere i punti di corsa nello strato dermico paralleli all'incisione, lavorando passo dopo passo lungo l'incisione da un lato all'altro. Legare le suture e rimuovere le estremità sciolte.Applicare la colla chirurgica sull'incisione chiusa per appostare i bordi della pelle. Quindi, posiziona l'animale su una coperta calda con ossigeno e monitoraggio, fino a quando l'animale non è vigile e in grado di sedersi in modo indipendente. Quando si stabilisce questo modello, una dose di due volte 10 alle sette cellule per corno uterino ha avuto successo in quattro conigli, in un tempo medio di 45 giorni dall'inoculazione all'esperimento ed è stata quindi determinata come la dose di iniezione ottimale per il modello VX2 coltivato.Per il modello VX2 propagato in vivo, che è stato creato con successo in 16 conigli con un tempo medio dall'inoculazione all'esperimento di 29 giorni, cinque volte 10 alle sei cellule per corno uterino è stato determinato come la dose di iniezione ottimale. Tutti i modelli hanno portato ad una trasformazione metastatica di successo dei linfonodi retroperitoneali. Inoltre, tumori e linfonodi metastatici provenienti da cellule VX2 coltivate sono apparsi simili ai tumori delle cellule VX2 propagate in vivo mediante analisi istologica, con cellule macchiate di densimetoxolina osservate nel muscolo invasore e formando strutture ghiandolari come strutture con molte figure miotiche patologiche.Posizionare la sutura mediale nell'arteria uterina per evitare sanguinamento da una puntura del vaso e fare attenzione a infiltrarsi nelle cellule nel miometrio e non nella cavità endometriale. Fare attenzione a utilizzare una corretta tecnica sterile durante la creazione del modello per prevenire l'infezione post-operatoria e proteggersi con il materiale bario durante l'intervento chirurgico.

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