Name: an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells
Uploaded: 2019-09-12T12:30:00
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この研究は、テリー・フォックス研究所(PPG#1075)、カナダ健康研究所(財団助成金#154326)、カナダ癌学会研究所(704718)、カナダ自然科学工学研究評議会、カナダ自然科学工学研究評議会によって資金提供されました。ガナダイノベーション財団とプリンセスマーガレット癌財団。
初期VX2モデルと凍結VX2腫瘍ブロックの確立のための初期VX2細胞を提供してくれたマルゲライト・アケンズ博士に感謝します。最初のVX2細胞培養実験を行い、VX2細胞培養を支援してくれたリリ・ディンに感謝します。

深い腹壁閉鎖:腹膜切開の頂点を特定し、組織鉗子で腹膜、直腸筋および筋膜をつかむ。すべての動物研究は、大学保健ネットワークの動物資源センター(ARC)承認施設で行われ、承認された動物の使用とケアプロトコル(AUP#3994/#4299)に従って行われました。VX2細胞株は、大学ヘルスネットワークのアケン博士の研究室から得られた。
1. インビトロVX2セルラインの作成
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本明細損では、VX2子宮内膜癌モデルの確立のための標準化された外科的方法を報告し、このモデルを作成するために培養されたVX2細胞の最初の使用について報告した。75%の腫瘍摂取率は、以前に文献35、37、53、56で報告された100%の率よりも低い。しかしながら、病理学的に確認されたリンパ節転?...

子宮内膜癌、または子宮の内層の癌は、世界で2番目に一般的な婦人科悪性腫瘍であり、先進国で最も一般的な悪性腫瘍1である。子宮内膜癌の発生率は着実に増加しており、2005年から2013年の間に年間2.3%増加し、死亡率1、2、3の死亡率は2.2%増加した。リンパ節転移の診断は、陽性リンパ節の存在が生存4、5、6、7の強い陰性予測変数であり、投与を導くことができるので最も重要であるアジュバント療法8,9,10,11,12,13.リンパ節転移は現在、骨盤および腹部の主要な血管を覆うリンパ組織を外科的に除去することによって診断される。リンパ節切除術として知られるこの手順は、2つの大きな試験14、15、16、17、18および既知の生存データの競合のために論争を呼んでいる。術中15、19、20および術後の罹患率21、22、23のリスク。現在の非侵襲的なイメージングモダリティは、リンパ節解剖24を置き換えるために必要な感度および特異性を有していないため、新しい画像診断技術を開発するプッシュがあった。これらの新しい技術を前臨床設定で試験するには、後食後リンパ節転移を伴う子宮内膜癌の信頼性の高いモデルが必要である。
ウサギVX2腫瘍モデルは、肺26、頭頸部27、28、肝臓29、腎臓30を含む複数のヒト固形臓器腫瘍25を研究するために広く使用されている確立されたモデルです。骨31、32、脳33、膵臓34および子宮35、36、37。VX2モデルはもともと1933 39でShopeによって発見された綿のウサギのパピローマウイルスを移植することに成功したキッドとルース38によって1940年に開発されました。それ以来、VX2モデルは生体内で維持されており、ホワイトニュージーランドウサギ40の四頭筋の連続通路を必要としています。しかし、より最近では、複数の群がインビトロ40、41、42でVX2細胞を正常に増殖させ、培養した細胞株31の保持腫瘍性を実証した。42、43。VX2腫瘍は、組織学的に異形成性扁平上皮癌44として定義され、腺癌26に似た腺特徴を含有する。腫瘍は、移植の容易さ、急速な成長および高血管性44、45および確実に転移し、最も一般的に局所および遠隔リンパ節45に特徴付ける。子宮血管およびリンパ切除術46および直腸成長部位の類似性は、ウサギVX2癌の転移パターンがヒト子宮内膜癌の転移パターンを模倣することを保証し、VX2モデルはヒトを研究するための信頼できるモデルを作る転移性疾患。さらに、異常な微小血管増殖47、ならびに免疫学的類似性49、ヒトとウサギの間の50などの組織学的特徴は、腫瘍を示唆する微小環境はヒト子宮内膜癌のそれを反映する可能性がある。
複数のグループは、成功率が高い後膜転移を伴う子宮内膜癌のモデルを作成するためにVX2の使用について報告しています36,51,52;しかし、モデル作成の方法に関しては、現在の文献内に大きなばらつきが存在する。細胞懸濁量は4 x 105細胞/子宮角51と高く5 x 109細胞/子宮角37、53は、必要なVX2細胞用量に関する標準的なコンセンサスなしで報告されている。また、子宮筋膜36への腫瘍の微小外科的移植、VX2細胞懸濁液の注射37、44、52を含む様々な接種方法が報告されている。,53および場合によっては、接種前の子宮角縫合の添加52.最後に、培養された VX2 セルを使用してこのモデルを作成したグループは報告されていません。したがって、本研究の目的は、VX2モデル作成の標準化された方法を実証し、培養されたVX2細胞の最初の使用を報告し、ウサギの後腹部転移を伴う子宮内膜癌のモデルを作成することである。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>11-blade scalpel, Sterile, Disposible</td>
			<td>Aspen Surgical (VWR)</td>
			<td>80094-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gague ear vein catheter</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>14332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 braided absorbable suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine (Atravet)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>4363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution (Poviodone iodine 10%)</td>
			<td>UHN Stores</td>
			<td>457955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>McGill University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine solution</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>119872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354450</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354408</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354400</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/HAM F12 1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Caledon Lab Chem</td>
			<td>1/10/4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril injectable)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>11242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube</td>
			<td>Corning Centri-Star</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12483020</td>
			<td>brand/source not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isohexol contrast</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>407141210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam 0.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>104674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>House Brand (UofT Medstore)</td>
			<td>1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Multicell or Sigma</td>
			<td>331-010-CL or D8537-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>CA45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)</td>
			<td>T.C.M.F (Dr Bristow)</td>
			<td>28-Jan-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Glue (Tissue Adhesive)</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>14695B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.25%), Proteomics Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6567-5X20UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-542-EL</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells

子宮内膜癌は、北米で最も一般的な婦人科悪性腫瘍であり、発生率は世界的に上昇しています。治療は、リンパ節摘出術によって決定されるリンパ節関与に応じてアジュバント療法の有無にかかわらず外科手術からなる。リンパ節切診は、多くの患者で治療上の利益を有することが示されていない罹患性の処置であり、したがって、リンパ節転移を診断する新しい方法が必要である。新しいイメージング剤を試験するには、後米泌性リンパ節転移を伴う子宮内膜癌の信頼性の高いモデルが必要である。VX2子宮内膜癌モデルは、文献に頻繁に記載されています。しかし、モデル確立の方法に関しては大きなばらつきが存在する。さらに、生体内で伝播した細胞のみが以前に使用されていたため、このモデルを作成するために培養されたVX2細胞の使用に関する研究は報告されていません。本明細行では、VX2子宮内膜癌モデルの確立のための標準化された外科的方法および術後モニタリング方法を提示し、このモデルを作成するための培養VX2細胞の最初の使用について報告する。

子宮内膜癌モデルの作成には28匹のウサギが使用された。ウサギの平均体重は2.83kg(2.71~3.58kg)でした。子宮腫瘍は21匹のウサギで正常に成長し、全体的なモデル成功率は75%であった。プロトコルに子宮縫合を含める前に、成功率は子宮縫合が加えられた後の81%と比較して57%であった。子宮縫合は、最初の低モデル成功率に応答して7番目のウサギの後にプロトコ?...

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An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

このプロトコルは、培養中のVX2細胞を増殖させ、ウサギの後精膜リンパ節転移を伴う子宮内膜癌の直腸VX2モデルを作成する標準化された方法を提示する。オルトトピック子宮内膜癌モデルは、リンパ節転移の診断のための新規イメージングモダリティの前臨床研究にとって重要である。

生体内伝播および培養VX2細胞から作られた後腹部リンパ管リンパデノパシーを有するオルトトピック子宮内膜癌モデル

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

このVX2子宮内膜癌モデルは、後腹膜リンパ節転移を有する画像誘導手術の技術を研究するために使用することができる。この技術の主な利点は、信頼性が高く、単純であり、ヒト子宮内膜癌のパターンを模倣する一貫した転移性広がりを生み出す点である。全体的に、これは簡単なテクニックです。ただし、モデルを作成する前に縫合を練習することは、プロセスを容易にするのに役立ちます。この技術の視覚的なデモンストレーションは、モデルの確立に関与する外科的ステップを実証するのに役立つため、重要である。ハーレーチャンと私との手順を実証し、私はリリディン、私たちの研究室からの技術者になります。インビトロ伝播されたVX2細胞を注射用に調製するには、37°CのビーズまたはウォーターバスでVX2細胞の凍結バイアルを1分間温めることから始めます。細胞が解凍されたら、10ミリリットルの培養培地を含む15ミリリットルのチューブに細胞懸濁液を引き込む。遠心分離により細胞を沈下する。ペレットを9ミリリットルの培地で再懸濁します。細胞を大きな培養フラスコに移して揺れることなく摂氏37度でインキュベーションを行い、光顕微鏡による合流を毎日チェックします。細胞が80%の合流度に達したら、フラスコに0.2%トリプシンの3ミリリットルを加え、細胞を5分間培養インキュベーターに戻します。細胞が剥離したら、細胞懸濁液を円錐管に移し、遠心分離によって細胞を採取する。細胞ペレットを洗浄ごとに9ミリリットルの新鮮なPBSで3回洗浄します。最後の洗浄の後、氷上の新しい円錐管内のPBS濃度の1ミリリットル当たり4倍の10〜7個のVX2細胞に希釈する前に、数えるために新鮮なPBSの細胞を再中断します。インビボ伝播VX2細胞で注射を準備するために、凍結した1センチメートルのVX2腫瘍ブロックを解凍し、メスを使用して培養プレート内の組織サンプルをミンチする。組織断片を70マイクロメートルのフィルターに移し、ハンクのバランスのとれた塩溶液(HBSS)の1ミリリットルまでの小さなアリコートを加えて、すべての細胞がストレーナーを通過するようにします。次に、細胞懸濁液を氷上の無菌チューブ内のHBSS濃度の1ミリリットル当たり10倍に10倍に希釈する前に細胞を数える。刺激に対する応答の欠如を確認した後、麻酔をした雌の白いニュージーランドのウサギを手術台の後ろ位置に置きます。骨盤と腹部の上に髪をクリップし、露出した皮膚をきれいにするために3段階の外科的皮膚の準備を使用する。外科用キャップとフェイスマスクを着用し、滅菌ガウンと無菌外科用手袋を着用する前に消毒剤で手をこすります。恥骨の上部をランドマークし、下腹部の5センチメートルの領域を露出残して、腹腔切除ドレープで外科フィールドをドレープ。次に、数11のメスブレードを使用して、皮膚および皮下組織を介して、恥骨に2.5センチメートルの切開1センチメートルの頭蓋を作る。直腸筋膜を切開し、直腸筋を横に解剖して、基礎となる腹膜を露出させる。下面が腸または他の腹部器官から離れであることを確認します。腹腔に入って膀胱を識別し、手袋をした指を優れた、後に、そして膀胱の頂点の上に横に掃いて子宮の角を見つける。腹部の切開を通して子宮の角を抽出し、腹壁に置きます。3-0の編み込み吸収性縫合糸を使用して、各子宮ホーンの単一の縫合線結紮を行い、子宮頸部に約1.5〜2センチメートル遠位、子宮動脈を単に内側に入れる。その後、遠位子宮の角を含むように縫合糸をぴったりと結びます。以前に調製したVX2細胞懸濁液でミオメトリウムを接種するには、1ミリリットルの細胞を有する27ゲージ針を装備した1ミリリットルの注射器をロードする。縫合糸と子宮頸部の間の縫合部位に、各子宮ホーン近位に1分間にわたって0.5ミリリットルの細胞懸濁液をゆっくりと注入する。その後、細胞漏れを最小限に抑えるために30秒間、心筋注射部位に圧力をかける。子宮の角を腹部に戻す前に、注射部位と縫合部位の止まり地を検査します。深い腹壁閉鎖のために、腹膜切開の頂点を特定し、腹膜直筋および筋膜をつかむための外科クランプを使用する。3-0吸収性ポリフィラメント縫合糸を配置して縫合糸を固定し、切開部の一方の頂点を深く深くする表面的に、他方では表面的に深く配置する。付属の縫合糸を使用して、腹壁の層を通して切開に垂直なランニングステッチを作り、縫合糸を結び落として緩い端を切断する前に、左右の切開に沿って段階的に働きます。表面的な腹壁閉鎖の場合、埋もれた下切除下3-0吸収性ポリフィラメント縫合糸を使用して、切開の片側を表面的に深く縫合し、表面的に他方の深部に縫合する。縫合糸を結んだ後、アンカーされた縫合糸を使用して、切開に平行な真皮層のランニングステッチを作り、切開に沿って段階的に作業します。縫合糸を結び、緩い端を取り除きます。皮膚の縁をアポスするために閉じた切開に外科用接着剤を適用します。その後、動物が警戒し、独立して座ることができるまで、酸素と監視と暖かい毛布の上に動物を置きます。このモデルを確立する際、子宮角当たり7個の細胞に対して2回10回の投与量が4匹のウサギで成功し、接種から実験までの平均45日間で、培養されたVX2モデルに最適な注射用量として決定された。インビボ伝播VX2モデルについては、接種から29日の実験までの平均時間で16匹のウサギで正常に作成され、子宮角当たり6個の細胞に対して5回10回、最適な注射用量として決定した。すべてのモデルは、後腹膜リンパ節の転移変換に成功した。さらに、培養されたVX2細胞からの腫瘍および転移性リンパ節は、組織学的解析によって生体内伝播VX2細胞の腫瘍に似ているように見え、デンシメトキソリン染色細胞は、侵入筋肉で観察され、多くの病理学的マイトの数字を有する腺のような構造を形成した。縫合心を子宮動脈に置いて、血管穿刺からの出血を避け、子宮内膜腔ではなく細胞を子宮内膜に浸透するように注意してください。術後の感染を防ぎ、手術中にバリウム材料で身を守るために、モデル作成中に適切な滅菌技術を使用するように注意してください。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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