Name: an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells
Uploaded: 2019-09-12T12:30:00
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이 연구는 테리 폭스 연구소에 의해 투자되었다 (PPG # 1075), 건강 연구의 캐나다 연구소 (재단 보조금 #154326), 캐나다 암 학회 연구소 (704718), 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회, 혁신과 공주 마가렛 암 재단에 대한 Сanada 재단.
초기 VX2 모델과 냉동 VX2 종양 블록의 설립을 위한 초기 VX2 세포를 제공한 마거리트 아켄스 박사에게 감사드립니다. 초기 VX2 세포 배양 실험을 수행하고 VX2 세포 배양을 돕는 Lili Ding을 도와준 마르코 디그라파에게 감사드립니다.

깊은 복벽 폐쇄: 복막 절개의 정점을 확인하고 조직 집게로 복막, 직장 근육 및 근막을 파악합니다. 모든 동물 연구는 대학 보건 네트워크의 동물 자원 센터 (ARC) 승인 된 시설에서 및 승인 된 동물 사용 및 관리 프로토콜 (AUP #3994 / #4299)에 따라 수행되었습니다. VX2 세포주 대학 건강 네트워크에 박사 Aken의 실험실에서 얻은.
1. 체외 VX2 세포주 생성
<ol><li>토끼 사두근 근육과 마?...

본 명세서에서, 우리는 VX2 자궁내막암 모델의 확립을 위한 표준화된 수술 방법을 보고하고 이 모델을 생성하기 위해 배양된 VX2 세포의 첫 번째 사용에 대해 보고하였다. 75%의 종양 복용율은 문헌35,37,53,56에이전에 보고된 100% 비율보다 낮다; 그러나 병리학적으로 확인 된 림프절 전이의 thw 90 % 비율은?...

자궁내막암, 즉 자궁내막암은 전 세계적으로 두 번째로 흔한 부인과 악성종양이며 선진국에서 가장 흔한악성종양입니다 1. 자궁내막암발생률은 2005년부터 2013년까지 매년 2.3% 증가하여 사망률1,2,3의사망률이 2.2% 증가하는 등 꾸준히 증가하고 있다. 림프절 전이의 진단은 양성 림프절의 존재가 생존4,5,6,7의 강한 부정적인 예측변수이기 때문에 가장 중요하며, 보조 요법8,9,10,11,12,13. 림프절 전이는 현재 골반과 복부에 있는 주요 혈관을 덮는 림프 조직을 외과적으로 제거해서 진단됩니다. 림프절 절제술로 알려진이 절차는 두 개의 큰 시험 에서 생존 데이터 충돌로 인해 논란이14,15,16,17, 18 및 알려진 수술 중15,19,20 및 수술 후 이환율21,22,23의위험. 현재 비침습적 영상형형은림프절해부(24)를대체하는 데 필요한 민감도 및 특이성을 갖지 않기 때문에, 새로운 진단 영상 기술을 개발하기 위한 추진이 있었다. 전 임상 환경에서 이러한 새로운 기술을 테스트하려면 복막 림프절 전이를 가진 자궁 내막암의 신뢰할 수있는 모델이 필요합니다.
토끼 VX2 종양 모델은 폐26,두경부27,간29,신장30,등 다중 인간 고형 기관종양(25)을 연구하기 위해 광범위하게 사용되어 온 잘 확립된 모델이다. 뼈31,32,뇌33,췌장34, 자궁35,36,37. VX2 모델은 1940년 키드와 루스38이 1933년39년Shope가 발견한 코튼테일 토끼 유두종 바이러스를 성공적으로 이식하여 개발되었습니다. 그 이후로, VX2 모델은 화이트 뉴질랜드 토끼40의사두근 근육에 직렬 통로를 필요로, 생체 내에서 유지되고있다. 그러나 최근에는, 여러 그룹이 시험관 내 VX2 세포를 성공적으로 성장시켰으며,41,42 및 배양된세포주(31)의유지종양성을입증하였다. 42,43. VX2 종양은 조직학적으로 anaplastic 편평 상피 세포 암종(44)으로 정의되고 선암(26)과유사한 선 특징을 포함합니다. 종양은 이식의 용이성, 급속한 성장 및 하이퍼 혈관(44,45) 및 안정적으로 전이되며, 가장 일반적으로 국부 및 먼 림프절45를특징으로한다. 자궁 혈관 및 림프 해부학46뿐만 아니라 정형 외 성장 부위의 유사성은 토끼 VX2 암종의 전이성 패턴이 인간 자궁 내막암을 모방하여 VX2 모델을 인간 연구에 대한 신뢰할 수있는 모델로 만듭니다. 전이성 질환. 더욱이, 비정상적인 미세혈관증식(47)과 같은 조직학적 특징은 면역학적48 및 유전적 유사성49,인간과 토끼 사이의50이 종양을 시사한다고 제안한다. 미세 환경은 인간의 자궁 내막암을 반영 할 수있다.
여러 그룹은 VX2의 사용에 대한 보고가 성공률이 높은 후복막 전이를 가진 자궁내막암 의 모델을 생성하여36,51,52; 그러나 모델 생성 방법과 관련하여 현재 문헌 내에 상당한 차이가 있습니다. 세포 현탁액 투여량은 4 x 10 5 세포/자궁경적(51)과 5 x 10 9 세포/자궁호른(37) 만큼높으며,53회는 필요한 VX2 세포 투여량에 대한 표준 합의없이 보고되었다. 또한, 자궁 근막내로 종양의 미세 외과이식(36)및 VX2 세포 현탁액37,44,52의 주사를 포함한 다양한 접종 방법이 보고되었다. , 도 53 및 경우에 따라, 접종 전 자궁경적 봉기(52)를 첨가한다. 마지막으로 배양된 VX2 셀을 사용하여 이 모델을 만드는 그룹은 보고되지 않았습니다. 따라서, 본 연구의 목적은 VX2 모델 생성의 성공적인 표준화 방법을 입증하고 배양된 VX2 세포의 첫 번째 사용을 보고하여 토끼에서 복막전이를 이용한 자궁내막암 모델을 생성하는 것이다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>11-blade scalpel, Sterile, Disposible</td>
			<td>Aspen Surgical (VWR)</td>
			<td>80094-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gague ear vein catheter</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>14332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 braided absorbable suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine (Atravet)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>4363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution (Poviodone iodine 10%)</td>
			<td>UHN Stores</td>
			<td>457955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>McGill University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine solution</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>119872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354450</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354408</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354400</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/HAM F12 1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Caledon Lab Chem</td>
			<td>1/10/4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril injectable)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>11242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube</td>
			<td>Corning Centri-Star</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12483020</td>
			<td>brand/source not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isohexol contrast</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>407141210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam 0.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>104674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>House Brand (UofT Medstore)</td>
			<td>1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Multicell or Sigma</td>
			<td>331-010-CL or D8537-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>CA45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)</td>
			<td>T.C.M.F (Dr Bristow)</td>
			<td>28-Jan-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Glue (Tissue Adhesive)</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>14695B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.25%), Proteomics Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6567-5X20UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-542-EL</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells

자궁내막암은 북미에서 가장 흔한 부인과 악성 종양이며 발병률은 전 세계적으로 증가하고 있습니다. 치료는 림프절 절제술에 의해 결정된 림프절 침범에 따라 보조 요법의 유무에 관계없이 수술로 구성됩니다. 림프절 절제술은 많은 환자에서 치료 적 이점을 가지고 있는 것으로 나타나지 않은 병적 절차이므로 림프절 전이를 진단하는 새로운 방법이 필요합니다. 새로운 화상 진찰 에이전트를 시험하기 위하여는, retroperitoneal 림프절 전이를 가진 자궁내막암의 믿을 수 있는 모형이 필요합니다. VX2 자궁내막암 모델은 문헌에 자주 기술되어 왔다; 그러나 모델 수립 방법에 대해서는 상당한 차이가 있습니다. 더욱이, 생체 내에서 전파된 세포만이 이전에 사용되었기 때문에 배양된 VX2 세포의 사용에 대한 연구는 보고되지 않았다. 본 명세서에서, VX2 자궁내막암 모델의 확립을 위한 표준화된 수술 방법 및 수술 후 모니터링 방법을 제시하고 이 모델을 생성하기 위해 배양된 VX2 세포의 첫 번째 사용에 대해 보고한다.

28 마리의 토끼가 자궁내막암 모델의 생성에 사용되었다. 토끼는 실험 당시 평균 체중이 2.83 kg (2.71-3.58 kg)이었다. 자궁 종양은 75%의 전반적인 모형 성공률을 위해 21개의 토끼에서 성공적으로 성장했습니다. 프로토콜에 자궁 봉합을 포함하기 전에, 성공률은 자궁 봉합 후 81 %에 비해 57 %였다. 자궁 봉합은 초기 낮은 모델 성공률에 응하여7th 토끼 후 프로토콜에 첨가?...

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An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

이 프로토콜은 배양에서 VX2 세포를 성장시키고 토끼에서 후복막 림프절 전이를 가진 자궁내막암의 정형외 VX2 모델을 생성하는 표준화된 방법을 제시한다. 정형외 자궁내막암 모델은 림프절 전이의 진단을 위한 새로운 이미징 양식의 전임상 연구에 중요하다.

생체 내 전파 및 배양 VX2 세포에서 만든 후각 성 림프절증을 가진 정형 외 자궁 내막 암 모델

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

레트로 페리톤 림프절 전이와 이 VX2 자궁내막암 모델은 이미지 유도 수술을 위한 기술을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간 자궁 내막암의 패턴을 모방 일관된 전이성 확산을 생성한다는 것입니다. 전반적으로 이것은 간단한 기술입니다.그러나 모델을 만들기 전에 봉합을 연습하면 프로세스를 더 쉽게 만드는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 시각적 데모는 모델 설립에 관련된 수술 단계를 입증하는 데 도움이되기 때문에 중요합니다. 할리 찬과 나는 릴리 딩, 우리의 실험실에서 기술자가 될 것입니다 와 절차를 시연.주입을 위해 시험관외 전파 VX2 세포에서 준비하려면 VX2 세포의 냉동 바이알을 섭씨 37도 또는 수조로 1분 동안 따뜻하게 데우는 것으로 시작합니다. 세포가 해동되면 배양 배지의 10 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브에서 세포 현탁액을 당깁니다. 원심분리에 의한 세포 침전.중간 크기의 9 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 세포를 큰 배양소로 옮기면 37°C에서 잠양을 위해 몸을 흔들어 서 매일 세포를 확인하여 가벼운 현미경 검사법에 의한 합류를 확인합니다. 세포가 80%의 합류에 도달하면 플라스크에 0.2%의 트립신 3밀리리터를 추가하고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 5분 동안 되돌려 보세요.세포가 분리되면, 원심분리에 의해 세포를 수집하기 위해 원적 튜브로 세포 현탁액을 전달한다. 세척당 9밀리리터의 신선한 PBS로 셀 펠릿을 세 번 씻으십시오. 마지막 세척 후, 얼음에 새로운 원문 튜브에서 PBS 농도의 밀리리터 당 7 개의 VX2 세포에 4 회 10으로 희석하기 전에 계산에 대한 신선한 PBS에서 세포를 다시 중단합니다.생체 전파 VX2 세포주입을 위해 준비하기 위해 1센티미터 VX2 종양 블록으로 냉동된 해동을 하고 메스를 사용하여 배양판에서 조직 샘플을 다진다. 조직 조각을 70 마이크로미터 필터로 옮기고 행크의 균형 잡힌 염용액(HBSS)의 최대 1밀리리터의 작은 알리쿼트를 추가하여 모든 세포가 여과기를 통과하도록 합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 얼음에 멸균 튜브에 있는 HBSS 농도의 밀리리터 당 7개의 VX2 세포로 10번 으로 희석하기 전에 세포를 계산한다.자극에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 수술대에 등색 위치에 마취 여성 흰색 뉴질랜드 토끼를 배치합니다. 골반과 복부에 머리를 잘라, 노출 된 피부를 청소하는 세 단계 수술 피부 준비를 사용합니다. 수술용 모자와 얼굴 마스크를 착용하고 소독제로 손을 문지르며 멸균 가운과 멸균 수술 용 장갑을 착용하십시오.음모 뼈의 상단을 랜드 마크와 하복부 커튼으로 수술 필드를 드레이프, 노출 하 복부의 5 5 센티미터 영역을 떠나. 다음으로, 11번 메스 블레이드를 사용하여 피부와 피하 조직을 통해 심근증 에 대한 2.5센티미터 절개 1센티미터 두개골을 만듭니다. 정류 근막을 절개하고 정류 근육을 측면으로 해부하여 기본 복막이 노출됩니다.밑면이 창자 또는 다른 복부 장기가 명확하지 않다는 것을 확인하십시오. 음낭을 확인하기 위해 회리동맥에 급격히 들어가 장갑을 낀 손가락을 우월하게, 후방, 그리고 측면으로 방광의 정점을 쓸어 자궁 뿔을 찾습니다. 복부 절개를 통해 자궁 뿔을 추출하여 복벽에 놓습니다.3-0 편조 흡수 봉합사를 사용하여 각 자궁 뿔의 단일 봉합사 결합을 수행하고, 약 1.5 ~ 2 센티미터의 자궁 부신을 수행하고 자궁 동맥에 내다식하십시오. 그런 다음 봉합사를 아늑하게 묶어 서 경적을 포함합니다. 이전에 준비된 VX2 세포 현탁액으로 심근을 접종하기 위해 1 밀리리터 의 셀이 장착된 1밀리리터 주사기를 적재합니다.봉합사와 자궁 경부 사이의 봉합사 부위에 각 자궁 경전 근면에 1분 이상 세포 현탁액의 0.5 밀리리터를 천천히 주입한다. 그런 다음 세포 누출을 최소화하기 위해 심근 주사 부위에 30초 동안 압력을 가합니다. 자궁 뿔을 복부에 다시 넣기 전에 주사제 및 봉합사 부위를 검사합니다.깊은 복벽 폐쇄의 경우 복막 절개 의 정점을 식별하고 외과 용 클램프를 사용하여 복막 직사각형 근육과 근막을 잡습니다. 3-0 흡수성 폴리필라멘트 봉합사를 배치하여 봉합사를 고정하고, 절개 한 정점에 피상적이며, 다른 쪽은 피상적 깊숙한 위치에 놓습니다. 부착된 봉합사를 사용하여, 복벽의 층을 통해 절개에 수직으로 달리는 바늘을 만들고, 봉합사를 묶고 느슨한 끝을 자르기 전에 좌우로 절개를 따라 단계적으로 작동합니다.피상적 복부 벽 폐쇄의 경우, 묻혀 있는 3-0 흡수성 폴리필라멘트 봉합사를 사용하여 절개 한쪽에 깊은 피상화와 피상적 인 봉합사를 다른 쪽 깊숙이 대접하십시오. 봉합사를 매듭낸 후, 고정된 봉합사를 사용하여 진피 층에서 실행 바늘을 절개에 평행하게 만들고, 좌우절을 따라 단계적으로 작업한다. 봉합사를 묶고 느슨한 끝을 제거합니다.닫힌 절개에 수술 접착제를 적용하여 피부 가장자리를 제거합니다. 그런 다음 동물이 경계하고 독립적으로 앉을 수 있을 때까지 산소와 모니터링이 있는 따뜻한 담요에 동물을 놓습니다. 이 모델을 확립할 때, 자궁 경전당 7개의 세포에 2회 10의 투여량은 4마리토끼에서 성공했고, 평균 45일 동안 접종부터 실험까지, 따라서 배양된 VX2 모델에 대한 최적의 주사 용량으로 결정되었다.생체 내 전파 VX2 모델의 경우, 접종부터 29일의 실험까지평균 시간으로 16마리토끼에서 성공적으로 만들어졌으며, 5회 10~6개의 세포가 최적의 주사 용량으로 결정되었다. 모든 모델은 레트로 페리톤 림프절의 성공적인 전이성 변환을 초래했습니다. 또한, 배양된 VX2 세포로부터의 종양 및 전이성 림프절은 조직분석에 의한 생체 전파 VX2 세포로부터종양과 유사한 것으로 나타났으며, 뎅시향토생린 염색 세포는 침입된 근육에서 관찰되고 많은 병리학적 신비학적 수치를 가진 구조와 같은 선 형성을 가졌다.혈관 천자에서 출혈을 피하기 위해 자궁 동맥에 봉합봉을 놓고 자궁 내막 구멍이 아닌 근막 구멍에 세포를 침투하는 데 주의를 기울이십시오. 수술 후 감염을 방지하고 수술 중 바륨 재료로 자신을 보호하기 위해 모델 생성 중에 적절한 멸균 기술을 사용하십시오.

Research

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연구

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