Name: an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells
Uploaded: 2019-09-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells at JoVE.com

Denne studien ble finansiert av Terry Fox Research Institute (PPG # 1075), Canadian Institute of Health Research (Foundation Grant #154326), Canadian Cancer Society Research Institute (704718), naturvitenskap og engineering Research Council of Canada, Сanada Foundation for innovasjon og prinsesse Margaret Cancer Foundation.
Jeg vil gjerne takke Dr. Marguerite Akens for å gi den første VX2 cellene for etablering av den innledende VX2 modellen og den frosne VX2 tumor blokker. Jeg vil gjerne takke Marco DiGrappa for å bidra til å utføre første VX2 cellekultur eksperimenter og Lili Ding for å hjelpe med VX2 cellekultur.

Dyp abdominal vegg lukking: Identifiser toppen av bukhulen snitt og ta tak i peritoneum, Rectus muskler og konsept med vev tang. Alle dyrestudier ble utført i Animal Resource Center (ARC) godkjent anlegg av University Health Network og i samsvar med godkjent dyr bruk og omsorg protokoller (AUP #3994/#4299). VX2 cellelinje ble innhentet fra Dr. Aken ' s Lab ved University Health Network.
1. opprettelse av in vitro VX2 cellelinje
<ol><li>Høste VX2 svulst fra kanin quadricep muskelen og vekst...

Heri har vi rapportert en standardisert kirurgisk metode for etablering av en VX2 livmorkreft modell og rapportert om første bruk av kultivert VX2 celler for å lage denne modellen. Svulsten tar sats på 75% er lavere enn 100% prosentsats tidligere rapportert i litteraturen35,37,53,56; men THW 90% rate på patologisk bekreftet lymfeknuter metastaser er forenlig med tidligere studier av denne m...

Livmorkreft, eller kreft i slimhinnen i livmoren, er den nest vanligste Gynecologic kreft verden og den vanligste kreft i utviklede land1. Forekomsten av livmorkreft har stadig økt, stiger med 2,3% per år mellom 2005-2013 med en tilsvarende 2,2% økning i dødelighet1,2,3. Diagnostisering av lymfeknuter metastaser er viktig som tilstedeværelsen av positive lymfeknuter er en sterk negativ indikasjon på overlevelse4,5,6,7 og kan veilede administrasjonen av adjuvant behandling8,9,10,11,12,13. Lymfeknuter metastaser er for tiden diagnostisert ved kirurgisk fjerne lymfesystemet overliggende de store blodkarene i bekkenet og magen. Denne prosedyren, kjent som en lymfadenektomi, er kontroversiell på grunn av motstridende overlevelses data fra to store forsøk14,15,16,17,18 og den kjente risiko for intra-operative15,19,20 og postoperativ sykelighet21,22,23. Som dagens ikke-invasiv Imaging modaliteter ikke har den nødvendige følsomhet og spesifisitet til å erstatte lymfeknuter disseksjon24, har det vært et push for å utvikle nye diagnostiske Imaging teknikker. For å teste disse romanen teknikker i en pre-klinisk setting, en pålitelig modell av livmorkreft med retroperitoneal lymfe node metastaser er nødvendig.
The Rabbit VX2 tumor modellen er en veletablert modell som har blitt brukt i stor utstrekning for å studere flere menneskelige solide organsvulster 25 inkludert lunge26, hode og nakke27,28, lever29, nyre30, Bone31,32, Brain33, bukspyttkjertel34 oglivmor 35,36,37. Det VX2 modell var opprinnelig bebygget inne 1940 av Kidd og Rous38 av med hell transplantere en smukken kanin papilloma virus oppdaget av Shope inne 193339. Siden det tid, det VX2 modell er blitt holdt inne Vivo, behøver føljetong passasje inne det quadriceps muskelen av hvit New Zealand kanin40. Flere nylig men flere grupper har blitt dyrket VX2 celler in vitro40,41,42 og demonstrerte beholdt tumorigenecity av kultivert cellelinje31, 42,43. VX2 svulster er histologisk definert som anaplastisk plateepitel celle kreftsvulster44 og inneholder kjertel funksjoner som ligne adenokarsinom26. Svulster kjennetegnes ved enkel implantation, rask vekst og Hyper-vascularity44,45 og pålitelig metastase, oftest til regionale og fjerne lymfeknuter45. Likheter i livmor vaskulær og lymfatisk anatomi46 samt orthotopic vekst området sikre at metastatisk mønster av kanin VX2 kreft etterligner at menneskets livmorkreft, noe som gjør VX2 modellen en pålitelig modell for å studere menneskelig metastatisk sykdom. Videre histologic funksjoner som unormal mikrovaskulær spredning47 , så vel som immunologiske48 og genetiske likheter49,50 mellom mennesker og kaniner tyder på at svulsten mikromiljøet kan gjenspeile at menneskets livmorkreft.
Flere grupper har rapportert om bruk av VX2 å lage en modell av livmorkreft med retroperitoneal metastaser med en høy rapportert rate av suksess36,51,52; Det finnes imidlertid betydelig variasjon innenfor gjeldende litteratur med hensyn til metoden for modell opprettelse. Cell suspensjon doser så lavt som 4 x10 5 celler/livmorhorn 51 og så høyt som 5 x 109 celler/livmor horn37,har53 blitt rapportert uten standard konsensus om den nødvendige VX2 Cellular dose. I tillegg har en rekke inoculation metoder er rapportert inkludert mikro-kirurgisk implantation av tumor inn i livmor myometriet36, injeksjon av VX2 celle suspensjon37,44,52 , 53 og i noen tilfeller, tilsetning av livmor horn suturing før innoculation52. Til slutt, ingen grupper har rapportert bruk av kultivert VX2 celler for å lage denne modellen. Således er hensikten med denne studien er å demonstrere en vellykket standardisert metode for VX2 modell opprettelse og å rapportere den første bruken av kultivert VX2 celler for å skape en modell av livmorkreft med retroperitoneal metastaser i en kanin.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>11-blade scalpel, Sterile, Disposible</td>
			<td>Aspen Surgical (VWR)</td>
			<td>80094-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gague ear vein catheter</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>14332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 braided absorbable suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine (Atravet)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>4363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution (Poviodone iodine 10%)</td>
			<td>UHN Stores</td>
			<td>457955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>McGill University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine solution</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>119872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354450</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354408</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354400</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/HAM F12 1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Caledon Lab Chem</td>
			<td>1/10/4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril injectable)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>11242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube</td>
			<td>Corning Centri-Star</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12483020</td>
			<td>brand/source not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isohexol contrast</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>407141210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam 0.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>104674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>House Brand (UofT Medstore)</td>
			<td>1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Multicell or Sigma</td>
			<td>331-010-CL or D8537-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>CA45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)</td>
			<td>T.C.M.F (Dr Bristow)</td>
			<td>28-Jan-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Glue (Tissue Adhesive)</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>14695B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.25%), Proteomics Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6567-5X20UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-542-EL</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells

Livmorkreft er den vanligste Gynecologic kreft i Nord-Amerika og forekomsten er økende over hele verden. Behandling består av kirurgi med eller uten adjuvant behandling avhengig av lymfe node engasjement som bestemmes av lymfadenektomi. Lymfadenektomi er en sykelig prosedyre, som ikke har vist å ha en terapeutisk fordel hos mange pasienter, og dermed en ny metode for å diagnostisere lymfeknuter metastaser er nødvendig. For å teste romanen Imaging agenter, en pålitelig modell av livmorkreft med retroperitoneal lymfe node metastaser er nødvendig. Den VX2 livmorkreft modellen har blitt beskrevet ofte i litteraturen; Imidlertid finnes betydelig variasjon med hensyn til metoden for modellen etablering. Videre har ingen studier rapportert om bruk av kulturperler VX2 celler for å lage denne modellen som bare celler overført in vivo har vært tidligere brukt. Heri, presenterer vi en standardisert kirurgisk metode og post-operative overvåking metode for etablering av VX2 livmorkreft modell og rapport om den første bruken av kultivert VX2 celler for å lage denne modellen.

Tyve-åtte kanin var anvendt for det kreasjon av det livmor kreften modell. Kaniner hadde en gjennomsnittlig vekt på 2,83 kg (2.71-3.58 kg) på tidspunktet for eksperimentet. Livmor tumorer hell vokste i 21 kaniner for en helhetlig modell suksess rate på 75%. Før inkludering av livmor suturing i protokollen, var suksessraten 57% sammenlignet med 81% etter livmor suturing ble lagt til. Livmor suturing ble lagt til protokollen etter 7th kanin som svar på den første lave mode...

Watch this Scientific Journal Video about An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells at JoVE.com

An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Denne protokollen presenterer en standardisert metode for å vokse VX2 celler i kultur og å skape en orthotopic VX2 modell av livmorkreft med retroperitoneal lymfe node metastaser i kaniner. Orthotopic livmorkreft modeller er viktig for pre-klinisk studie av romanen Imaging modaliteter for diagnostisering av lymfeknuter metastaser.

En Orthotopic livmor Cancer modell med retroperitoneal lymfadenopati laget fra in vivo spredte og kultivert VX2 Cells

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Denne VX2 endometriekreftmodellen med retroperitoneal lymfeknutemetastase kan brukes til å studere teknologi for bildestyrt kirurgi. De viktigste fordelene med denne teknikken er at den er pålitelig, enkel, og at den skaper konsekvent metastatisk spredning, som etterligner mønsteret av menneskelig endometriekreft. Samlet sett er dette en enkel teknikk.Men å praktisere suturing før du prøver å lage modellen vil bidra til å gjøre prosessen enklere. Visuell demonstrasjon av denne teknikken er viktig, da det bidrar til å demonstrere de kirurgiske trinnene som er involvert i modelletablering. Demonstrerte prosedyren med Harley Chan og jeg vil være Lili Ding, en tekniker fra laboratoriet vårt.For å forberede in vitro-overførte VX2-celler til injeksjon, begynn med å varme opp frosne hetteglass med VX2-celler i en 37 grader Celsius perle eller vannbad i ett minutt. Når cellene har tint, trekk cellesuspensjonene i et 15-milliliter rør som inneholder 10 milliliter kulturmedium. Sediment cellene ved sentrifugering.Resuspend pellet i ni milliliter av medium. Overfør cellene til en stor kulturkolbe for inkubasjon ved 37 grader Celsius uten å riste, og kontroller cellene daglig for samløpet av lett mikroskopi. Når cellene har nådd 80% samløpet, legg til tre milliliter på 0,2% trypsin til kolben og returner cellene til cellekulturinkubatoren i fem minutter.Når cellene har løsnet, overføre celle suspensjon til et konisk rør for å samle cellene ved sentrifugering. Vask cellepellet tre ganger med ni milliliter frisk PBS per vask. Etter siste vask, resuspend cellene i fersk PBS for telling før fortynne til en fire ganger 10 til de syv VX2 celler per milliliter PBS konsentrasjon i et nytt konisk rør på is.For å forberede i vivo-spredte VX2-celler til injeksjon, tin frosset en av en centimeter VX2 tumorblokker og bruk en skalpell til å hakke vevsprøvene i en kulturplate. Overfør vevsfragmentene til et 70-mikrometerfilter og tilsett små aliquots på opptil en milliliter Av Hanks balanserte saltoppløsning, eller HBSS, for å sikre at alle cellene passeres gjennom silen. Tell deretter cellene før du fortynner cellesuspensjonen til en gang 10 til de syv VX2-cellene per milliliter HBSS-konsentrasjon i et sterilt rør på is.Etter å ha bekreftet mangel på respons på stimulans, plasser den bedøvede kvinnelige hvite New Zealand-kaninen i dorsalposisjonen på operasjonsbordet. Klip håret over bekkenet og magen, og bruk en tretrinns kirurgisk hudforberedelse for å rense den eksponerte huden. Iført en kirurgisk hette og ansiktsmaske, skrubb hendene med desinfeksjonsmiddel før du tar på en steril kjole og sterile kirurgiske hansker.Landemerke toppen av kjønnsbenet og drapere det kirurgiske feltet med laparotomi gardiner, forlater en fem med fem centimeter område av underlivet utsatt. Deretter bruker du et nummer 11 skalpellblad for å lage et 2,5-centimeter snitt en centimeter kranial til symfysepubis gjennom hud og subkutan vev. Incise rectus fascia og dissekere rectus musklene lateralt for å avsløre den underliggende bukhinnen.Bekreft at undergrunnen er klar av tarm eller andre bukorganer. Skarpt inn i bukhinnen for å identifisere urinblæren og feie en hanskefinger overlegent, bakre og lateralt over blærens apeks for å finne livmorhornene. Trekk ut livmorhornene gjennom magesnittet for å hvile på bukveggen.Bruk en 3-0 flettet absorberbar sutur for å utføre en enkelt sutur ligation av hvert livmorhorn, ca 1,5 til to centimeter distal til livmorhalsene og bare medial til livmorarteriene. Deretter knytter suturene godt for å inkludere de distale livmorhornene. For å inokulere myometriumet med den tidligere forberedte VX2-cellesuspensjonen, legg i en en milliliter sprøyte utstyrt med en 27-gauge nål med en milliliter celler.Injiser sakte 0,5 milliliter av cellesuspensjonen over ett minutt inn i hvert livmorhorn proksimalt til suturstedet mellom suturen og livmorhalsen. Deretter legger du press på myometrieinjeksjonsstedet i 30 sekunder for å minimere cellelekkasje. Inspiser injeksjons- og suturstedene for hemostase før du plasserer livmorhornene tilbake i magen.For dyp abdominal vegglukking, identifisere toppen av peritoneal snitt og bruk en kirurgisk klemme for å forstå bukhinnen rectus muskel og fascia. Forankre suturen ved å plassere en 3-0 absorberbar polyfilamentsug, overfladisk til dyp på den ene toppen av snittet, og dypt til overfladisk på den andre. Ved hjelp av den vedlagte suturen, gjør løpende masker vinkelrett på snittet gjennom lagene i bukveggen, arbeider trinnvis langs snittet fra side til side før du knytter av suturen og kutter de løse endene.For overfladisk abdominal vegglukking, bruk en begravet løpende subkupulær 3-0 absorberbar polyfilament sutur for å suturere dypt til overfladisk på den ene siden av snittet og overfladisk til dypt på den andre. Etter å ha knyttet suturene, bruk de forankrede suturene til å lage løpemasker i det dermale laget parallelt med snittet, og arbeider trinnvis langs snittet fra side til side. Bind suturene og fjern de løse endene.Påfør kirurgisk lim til lukket snitt for å appose hudkantene. Deretter plasserer du dyret på et varmt teppe med oksygen og overvåking, til dyret er våken og i stand til å sitte selvstendig. Ved etablering av denne modellen, en dose på to ganger 10 til de syv cellene per livmor horn var vellykket i fire kaniner, i en gjennomsnittlig tid på 45 dager fra inokulasjon til eksperiment og ble dermed bestemt som den optimale injeksjon dose for den kultiverte VX2-modellen.For in vivo-spredt VX2 modell, som ble opprettet i 16 kaniner med en gjennomsnittlig tid fra inokulasjon til eksperiment på 29 dager, fem ganger 10 til de seks cellene per livmor horn ble bestemt som optimal injeksjon dose. Alle modellene resulterte i en vellykket metastatisk transformasjon av retroperitoneale lymfeknuter. Videre dukket svulster og metastatiske lymfeknuter fra kultiverte VX2-celler ut som ligner på svulster fra in vivo-spredte VX2-celler ved histologisk analyse, med tettemetotoksolinfargede celler observert i den invaderende muskelen og forming av kjertellignende strukturer med mange patologiske mytotiske figurer.Plasser suturmedisineringen til livmorarterien for å unngå blødning fra en karpunktering og vær forsiktig med å infiltrere cellene i myometrium og ikke endometriehulen. Vær forsiktig med å bruke riktig steril teknikk under modellopprettelsen for å forhindre postoperativ infeksjon og for å beskytte deg med bariummaterialet under operasjonen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescent ortotopiske musemodell for kreft i bukspyttkjertelen

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Eksperimentell modell av Original Tumor Utvikling og Peritoneal metastaser<em&gt; via</em&gt; Ortotopiske Inoculation med ovarialcancer Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolering av sirkulerende tumorceller i en ortotopisk musemodell av kolorektal kreft

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Utviklingen av en menneskelig prekliniske modell av Osteoclastogenesis fra perifert blod monocytter co kultivert med bryst kreftcelle linjer

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

En i Vivo Murine Sciatic Nerve modell Perineural invasjon

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping av Orthotopic Homograft (Syngeneic) av Murine primære KPC bukspyttkjertelen Ductal Adenocarcinoma av flowcytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Development and Angiographic Use of the Rabbit VX2 Model for Liver Cancer

Utvikling og Angiographic bruk av kanin VX2 modellen for leverkreft

The rabbit VX2 tumor is an animal model commonly utilized for translational research regarding hepatocellular carcinoma (HCC) in the field of ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Romlig og Temporal kontroll av murine melanom innvielse fra mutant melanocyte stamceller

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studere trippel negativ brystkreft ved hjelp ortotopisk brystkreft modell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

En ortotopisk reseksjonell musemodell av kreft i bukspyttkjertelen

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...