Name: an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells
Uploaded: 2019-09-12T12:30:00
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Este estudo foi financiado pelo Terry Fox Research Institute (PPG # 1075), o Instituto canadense de pesquisa em saúde (Fundação Grant #154326), o Instituto canadense de pesquisa da sociedade do câncer (704718), ciências naturais e Conselho de pesquisa de engenharia do Canadá, Fundação сanada para a inovação e a Princesa Margaret Cancer Foundation.
Gostaria de agradecer ao Dr. Marguerite Akens por fornecer as células VX2 iniciais para o estabelecimento do modelo inicial de VX2 e os blocos de tumor VX2 congelados. Gostaria de agradecer a Marco DiGrappa por ajudar a realizar experimentos iniciais de cultura de células VX2 e Lili Ding para ajudar na cultura de células VX2.

Fechamento da parede abdominal profunda: identifique o ápice da incisão peritoneal e segure o peritônio, músculo reto e fáscia com fórceps tecidual. Todos os estudos em animais foram conduzidos em instalações aprovadas pelo centro de recursos animais (ARC) da rede de saúde universitária e de acordo com os protocolos de uso e cuidado de animais aprovados (AUP #3994/#4299). A linha celular VX2 foi obtida do laboratório do Dr. Aken na rede de saúde da Universidade.
1. criação de linha...

Nisto, nós relatamos um método cirúrgico estandardizado para o estabelecimento de um modelo endometrial do cancro de VX2 e relatado no primeiro uso de pilhas VX2 cultivadas para criar este modelo. O tumor toma a taxa de 75% é mais baixo do que a taxa de 100% por cento relatada previamente na literatura35,37,53,56; Entretanto, a taxa de THW 90% de metástases de nó de linfa patològica conf...

O cancro endometrial, ou o cancro do forro do útero, são a segunda malignidade gynecologic a mais comum no mundo inteiro e a malignidade a mais comum em nações desenvolvidas1. A incidência de câncer de endométrio tem aumentado constantemente, elevando-se em 2,3% ao ano entre 2005-2013 com um aumento correspondente de 2,2% na mortalidade1,2,3. O diagnóstico das metástases linfonodais é primordial, pois a presença de linfonodos positivos é um forte preditor negativo desobrevida4,5,6,7e pode orientar a administração de terapia adjuvante8,9,10,11,12,13. As metástases de nó de linfa são diagnosticadas cirurgicamente removendo o tecido linfático que sobrejacente os vasos sanguíneos principais na pelve e no abdômen. Este procedimento, conhecido como lymphadenectomy, é controverso devido aos dados conflitantes da sobrevivência de dois testes grandes14,15,16,17,18 e o conhecido risco de15,19,20 e morbidade pós-operatória21,22,23. Como as modalidades não invasoras atuais da imagem latente não têm a sensibilidade e a especificidade exigidas para substituir a dissecção do nó de linfa24, houve um impulso para desenvolver técnicas diagnósticas novas da imagem latente. Para testar estas técnicas novas em um ajuste pre-Clinical, um modelo de confiança do cancro endometrial com metástases de nó de linfa retroperitoneal é exigido.
O modelo do tumor do coelho VX2 é um modelo bem estabelecido que seja usado extensivamente para estudar tumores contínuos humanos múltiplos do órgão25 que incluem o pulmão26, a cabeça e a garganta27,28, fígado29, rim30, osso31,32, cérebro33, pâncreas34 e útero35,36,37. O modelo VX2 foi originalmente desenvolvido em 1940 por Kidd e Rous38 ao transplantar com sucesso um vírus de papiloma de coelho de algodão descoberto por Shope em 193339. Desde aquela época, o modelo VX2 foi mantido in vivo, exigindo passagem serial no músculo quadríceps de coelhos brancos da Nova Zelândia40. Mais recentemente entretanto, os grupos múltiplos cresceram com sucesso VX2 pilhas in vitro40,41,42 e demonstraram o tumorigenecity retido da linha de pilha cultivada31, 42,43. Os tumores VX2 são definidos histològica como carcinomas de pilha Squamous Anaplastic44 e contêm as características glandular que se assemelham ao adenocarcinoma26. Os tumores são caracterizados pela facilidade da implantação, pelo crescimento rápido e pelo Hyper-vascularity44,pelo45 e por metastasize confiantemente, o mais geralmente aos nós de linfa regionais e distantes45. Similaridades na anatomia vascular e linfática uterine46 assim como o local transplantação orthotopic do do crescimento asseguram-se de que o teste padrão metastático da carcinoma VX2 do coelho imita aquele do cancro endometrial humano, fazendo ao modelo VX2 um modelo de confiança para estudar o ser humano doença metastática. Além disso, as características histologic tais como a proliferação microvascular anormal47 , assim como48 imunológicos e similaridades genéticas49,50 entre seres humanos e coelhos sugerem que o tumor microambiente pode refletir o de câncer de endométrio humano.
Os grupos múltiplos relataram no uso de VX2 para criar um modelo do cancro endometrial com metástases retroperitoneal com uma taxa relatada elevada do sucesso36,51,52; no entanto, existe uma variação significativa na literatura atual com respeito ao método de criação do modelo. As doses da suspensão da pilha tão baixas quanto 4 x 105 pilhas/chifre uterine51 e tão altamente quanto 5 x 109 pilhas/chifre uterine37,53 foram relatados sem o consenso padrão na dose celular exigida VX2. Também, uma variedade de métodos da inoculação foi relatada que inclui a implantação microcirúrgica do tumor no miométrio uterine36, injeção da suspensão VX2 da pilha37,44,52 , 53 e, em alguns casos, a adição de chifre uterino suturando antes da inoculação52. Finalmente, nenhum grupo relatou o uso de células VX2 cultivadas para criar esse modelo. Assim, a finalidade deste estudo é demonstrar um método padronizado bem sucedido da criação do modelo VX2 e relatar o primeiro uso de pilhas VX2 cultivadas para criar um modelo do cancro endometrial com metástases retroperitoneal em um coelho.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>11-blade scalpel, Sterile, Disposible</td>
			<td>Aspen Surgical (VWR)</td>
			<td>80094-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gague ear vein catheter</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>14332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 braided absorbable suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine (Atravet)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>4363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution (Poviodone iodine 10%)</td>
			<td>UHN Stores</td>
			<td>457955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>McGill University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine solution</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>119872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354450</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354408</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354400</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/HAM F12 1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Caledon Lab Chem</td>
			<td>1/10/4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril injectable)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>11242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube</td>
			<td>Corning Centri-Star</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12483020</td>
			<td>brand/source not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isohexol contrast</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>407141210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam 0.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>104674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>House Brand (UofT Medstore)</td>
			<td>1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Multicell or Sigma</td>
			<td>331-010-CL or D8537-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>CA45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)</td>
			<td>T.C.M.F (Dr Bristow)</td>
			<td>28-Jan-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Glue (Tissue Adhesive)</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>14695B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.25%), Proteomics Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6567-5X20UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-542-EL</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells

O cancro endometrial é a malignidade gynecologic a mais comum em America do Norte e a incidência está levantando-se no mundo inteiro. O tratamento consiste em cirurgia com ou sem terapia adjuvante, dependendo da participação do linfonodo, conforme determinado pela linfadenectomia. Lymphadenectomy é um procedimento mórbido, que não seja mostrado para ter um benefício terapêutico em muitos pacientes, e assim um método novo para diagnosticar metástases de nó de linfa é exigido. Para testar os agentes novos da imagem latente, um modelo de confiança do cancro endometrial com metástases de nó de linfa retroperitoneal é necessário. O modelo VX2 do cancro endometrial foi descrito freqüentemente na literatura; no entanto, existe uma variação significativa no que diz respeito ao método de estabelecimento de modelo. Além disso, nenhum estudo relatou sobre o uso de células VX2 cultivadas para criar esse modelo, pois apenas as células propagadas in vivo têm sido utilizadas anteriormente. Neste estudo, apresentamos um método cirúrgico padronizado e um método de monitorização pós-operatória para o estabelecimento do modelo de câncer endometrial VX2 e relato do primeiro uso de células VX2 cultivadas para criar esse modelo.

Vinte e oito coelhos foram utilizados para a criação do modelo de câncer endometrial. Os coelhos apresentaram um peso médio de 2,83 kg (2,71-40, 5kg) no momento do experimento. Os tumores uterine cresceram com sucesso em 21 coelhos para uma taxa de sucesso total do modelo de 75%. Antes da inclusão da sutura uterina no protocolo, a taxa de sucesso foi de 57% em relação a 81% após a sutura uterina ser adicionada. A sutura uterina foi adicionada ao protocolo após o 7º co...

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An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Este protocolo apresenta um método estandardizado para crescer VX2 pilhas na cultura e para criar um modelo VX2 transplantação orthotopic do do cancro endometrial com metástases de nó de linfa retroperitoneal nos coelhos. Os modelos do cancro endometrial de orthotopic são importantes para o estudo pré-clínico de modalidades novas da imagem latente para o diagnóstico de metástases de nó de linfa.

Um modelo de câncer endometrial ortotópico com linfadenopatia retroperitoneal feita a partir de in vivo propagadas e cultivadas VX2 células

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Este modelo de câncer endometrial VX2 com metástase de linfonodo retroperitoneal pode ser usado para estudar a tecnologia para cirurgia guiada por imagem. As principais vantagens dessa técnica são que ela é confiável, simples, e que cria uma propagação metastática consistente, que imita o padrão do câncer endometrial humano. No geral, esta é uma técnica simples.No entanto, praticar a sutura antes de tentar criar o modelo ajudará a facilitar o processo. A demonstração visual dessa técnica é importante, pois ajuda a demonstrar os passos cirúrgicos envolvidos no estabelecimento do modelo. Demonstrando o procedimento com Harley Chan e eu seremos Lili Ding, uma técnica do nosso laboratório.Para preparar células VX2 propagadas in vitro para injeção, comece aquecendo frascos congelados de células VX2 em uma conta de 37 graus Celsius ou banho de água por um minuto. Quando as células tiverem descongelado, puxe as suspensões celulares em um tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de meio de cultura. Sedimentar as células por centrifugação.Resuspend a pelota em nove mililitros de médio. Transfira as células para um frasco de grande cultura para incubação a 37 graus Celsius sem tremer, verificando as células diariamente para confluência por microscopia leve. Quando as células atingirem 80% de confluência, adicione três mililitros de 0,2% de trippsina ao frasco e devolva as células à incubadora de cultura celular por cinco minutos.Quando as células se separarem, transfira a suspensão celular para um tubo cônico para coletar as células por centrifugação. Lave a pelota da célula três vezes com nove mililitros de PBS frescos por lavagem. Após a última lavagem, resuspenja as células em PBS fresco para contar antes de diluir para quatro vezes 10 para as sete células VX2 por mililitro de concentração de PBS em um novo tubo cônico no gelo.Para preparar células VX2 propagadas in vivo para injeção, descongele um por blocos tumorais VX2 de um centímetro e use um bisturi para picar as amostras de tecido em uma placa de cultura. Transfira os fragmentos de tecido para um filtro de 70 micrômetros e adicione pequenas alíquotas de até um mililitro da solução de sal balanceada de Hank, ou HBSS, para garantir que todas as células sejam passadas através do coador. Em seguida, conte as células antes de diluir a suspensão celular para uma única vezes 10 às sete células VX2 por mililitro de concentração de HBSS em um tubo estéril no gelo.Depois de confirmar a falta de resposta ao estímulo, coloque o coelho branco da Nova Zelândia anestesiado na posição dorsal na mesa de operação. Corte o cabelo sobre a pelve e abdômen, e use uma preparação cirúrgica de três passos para limpar a pele exposta. Usando um boné cirúrgico e máscara facial, esfregue as mãos com desinfetante antes de colocar um vestido estéril e luvas cirúrgicas estéreis.Marco o topo do osso púbico e cubra o campo cirúrgico com cortinas de laparotomia, deixando uma área de cinco por cinco centímetros do abdômen inferior exposta. Em seguida, use uma lâmina de bisturi número 11 para fazer uma incisão de 2,5 centímetros um centímetro craniano para a púbica da sífilis através da pele e tecido subcutâneo. Incisar a fascia do reto e dissecar os músculos do reto lateralmente para expor o peritônio subjacente.Confirme que a superfície inferior está livre do intestino ou outros órgãos abdominais. Entre fortemente no peritônio para identificar a bexiga urinária e varrer um dedo enluvado superior, posteriormente e lateralmente sobre o ápice da bexiga para localizar os chifres uterinos. Extrair os chifres uterinos através da incisão abdominal para descansar na parede abdominal.Use uma sutura absorvível trançada 3-0 para realizar uma única ligadura sutura de cada chifre uterino, aproximadamente 1,5 a dois centímetros distal para as cervices e apenas medial para as artérias uterinas. Em seguida, amarre as suturas snugly para incluir os chifres uterinos distal. Para inocular o miométrio com a suspensão celular VX2 previamente preparada, carregue uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 27 com um mililitro de células.Injete lentamente 0,5 mililitros da suspensão celular ao longo de um minuto em cada chifre uterino proximal ao local da sutura entre a sutura e o colo do útero. Em seguida, aplique pressão no local da injeção miometrial por 30 segundos para minimizar o vazamento celular. Inspecione os locais de injeção e sutura para hemostasia antes de colocar os chifres uterinos de volta no abdômen.Para fechamento profundo da parede abdominal, identifique o ápice da incisão peritêneo e use um grampo cirúrgico para agarrar o músculo do reto peritônio e a fáscia. Ancore a sutura colocando uma sutura de polifilamento 3-0 absorvível, superficial a profunda em um ápice da incisão, e profundamente superficial na outra. Usando a sutura anexada, faça pontos de corrida perpendiculares à incisão através das camadas da parede abdominal, trabalhando passo-a-passo ao longo da incisão de um lado para o outro antes de amarrar a sutura e cortar as pontas soltas.Para o fechamento superficial da parede abdominal, use uma sutura de polifilamento absorvível subcuticular enterrada 3-0 para sutura de sutura superficial de um lado da incisão e superficial para fundo do outro. Depois de amarrar as suturas, use as suturas ancoradas para fazer pontos de corrida na camada dérmica paralela à incisão, trabalhando passo-a-passo ao longo da incisão de um lado para o outro. Amarre as suturas e remova as pontas soltas.Aplique cola cirúrgica na incisão fechada para apensar as bordas da pele. Em seguida, coloque o animal em um cobertor quente com oxigênio e monitoramento, até que o animal esteja alerta e capaz de sentar-se independentemente. Ao estabelecer este modelo, uma dose de duas vezes 10 para as sete células por chifre uterino foi bem sucedida em quatro coelhos, em um tempo médio de 45 dias de inoculação para experimento e foi assim determinada como a dose ideal de injeção para o modelo VX2 cultivado.Para o modelo VX2 in vivo propagado, que foi criado com sucesso em 16 coelhos com um tempo médio de inoculação para experimento de 29 dias, cinco vezes 10 para as seis células por chifre uterino foi determinada como a dose ideal de injeção. Todos os modelos resultaram em uma transformação metastática bem sucedida dos linfonodos retroperitoneais. Além disso, tumores e linfonodos metastáticos de células VX2 cultivadas pareciam semelhantes aos tumores de células VX2 propagadas in vivo pela análise histológica, com células manchadas de densiostoxolina observadas no músculo invasor e formando estruturas glandulares como estruturas com muitas figuras micológicas patológicas.Coloque sua sutura medial na artéria uterina para evitar sangramento de uma punção do vaso e tome cuidado para infiltrar as células no miométrio e não na cavidade endometrial. Tome cuidado para usar a técnica estéril adequada durante a criação do modelo para prevenir infecções pós-operatórias e para se proteger com o material de bário durante a cirurgia.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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