Name: an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells
Uploaded: 2019-09-12T12:30:00
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Este estudio fue financiado por el Terry Fox Research Institute (PPG-1075), el Instituto Canadiense de Investigación Sanitaria (Foundation Grant #154326), el Canadian Cancer Society Research Institute (704718), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Fundación para la Innovación y Fundación Princesa Margaret contra el Cáncer.
Me gustaría dar las gracias a la Dra. Marguerite Akens por proporcionar las células VX2 iniciales para el establecimiento del modelo VX2 inicial y los bloques tumorales VX2 congelados. Me gustaría agradecer a Marco DiGrappa por ayudar a realizar experimentos iniciales de cultivo celular VX2 y Lili Ding por ayudar con el cultivo celular VX2.

Cierre profundo de la pared abdominal: Identificar el ápice de la incisión peritoneal y agarrar el peritoneo, el músculo rectus y la fascia con fórceps tisulares. Todos los estudios en animales se llevaron a cabo en las instalaciones aprobadas por el Centro de Recursos Animales (ARC) de la Red Universitaria de Salud y de acuerdo con los protocolos aprobados de uso y cuidado de animales (AUP #3994/#4299). La línea celular VX2 se obtuvo del Laboratorio del Dr. Aken en la Red de Salud de la Universidad.
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En este documento, hemos informado de un método quirúrgico estandarizado para el establecimiento de un modelo de cáncer de endometrio VX2 y reportado sobre el primer uso de células VX2 cultivadas para crear este modelo. La tasa de toma de tumores del 75% es inferior a la tasa del 100% reportada anteriormente en la literatura35,37,53,56; sin embargo, la tasa del 90% de metástasis de ganglio...

El cáncer de endometrio, o cáncer del revestimiento del útero, es la segunda neoplasia maligna ginecológica más común a nivel mundial y la neoplasia maligna más común en las naciones desarrolladas1. La incidencia de cáncer de endometrio ha aumentado constantemente, aumentando un 2,3% anual entre 2005-2013, con un correspondiente aumento del 2,2% en la mortalidad1,2,3. El diagnóstico de metástasis de ganglios linfáticos es primordial ya que la presencia de ganglios linfáticos positivos es un fuerte predictor negativo de supervivencia4,5,6,7 y puede guiar la administración de terapia adyuvante8,9,10,11,12,13. Actualmente, las metástasis de los ganglios linfáticos se diagnostican mediante la extirpación quirúrgica del tejido linfático que cubre los vasos sanguíneos principales de la pelvis y el abdomen. Este procedimiento, conocido como linfadenectomía, es controvertido debido a los datos de supervivencia contradictorios de dos grandes ensayos14,15,16,17,18 y los conocidos riesgo intraoperatorio15,19,20 y morbilidad postoperatoria21,22,23. Dado que las modalidades de imagen no invasivas actuales no tienen la sensibilidad y especificidad necesarias para reemplazar la disección24de los ganglios linfáticos, se ha producido un impulso para desarrollar nuevas técnicas de diagnóstico por imágenes. Para probar estas nuevas técnicas en un entorno preclínico, se requiere un modelo fiable de cáncer de endometrio con metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales.
El modelo tumoral de conejo VX2 es un modelo bien establecido que se ha utilizado ampliamente para estudiar múltiples tumores de órganos sólidos humanos25 incluyendo pulmón26,cabeza y cuello27,28, hígado29, riñón30, hueso31,32, cerebro33, páncreas34 y útero35,36,37. El modelo VX2 fue desarrollado originalmente en 1940 por Kidd y Rous38 trasplantando con éxito un virus del papiloma de conejo de cola de algodón descubierto por Shope en 193339. Desde entonces, el modelo VX2 se ha mantenido in vivo, requiriendo paso en serie en el músculo cuádriceps de conejos blancos de Nueva Zelanda40. Más recientemente, sin embargo, múltiples grupos han cultivado con éxito células VX2 in vitro40,41,42 y demostrado la tumorigeneidad retenida de la línea celular cultivada31, 42,43. Los tumores VX2 se definen histológicamente como carcinomas de células escamosas anaplásicas44 y contienen rasgos glandulares que se asemejan al adenocarcinoma26. Los tumores se caracterizan por la facilidad de implantación, crecimiento rápido e hipervascularización44,45 y metástasis fiable, más comúnmente a los ganglios linfáticos regionales y distantes45. Las similitudes en la anatomía uterina vascular y linfática46, así como en el sitio de crecimiento ortotópico aseguran que el patrón metastásico del carcinoma VX2 del conejo imita al del cáncer de endometrio humano, haciendo del modelo VX2 un modelo fiable para el estudio humano enfermedad metastásica. Además, características histológicas como la proliferación microvascular anormal47, así como las similitudes inmunológicas48 y genéticas49,50 entre humanos y conejos sugieren que el tumor microambiente puede reflejar el del cáncer de endometrio humano.
Múltiples grupos han informado sobre el uso de VX2 para crear un modelo de cáncer de endometrio con metástasis retroperitoneales con una alta tasa de éxito reportado36,51,52; sin embargo, existe una variación significativa dentro de la literatura actual con respecto al método de creación de modelos. Dosis de suspensión celular tan bajas como 4 x 105 células/cuerno uterino51 y tan altas como 5 x 109 células/cuerno uterino37,53 se han reportado sin consenso estándar sobre la dosis celular VX2 requerida. También, una variedad de métodos de inoculación se han divulgado incluyendo la implantación microquirúrgica del tumor en el miometrio uterino36, inyección de suspensión celular VX237,44,52 , 53 y en algunos casos, la adición de cuerno uterino suturando antes de la innoculación52. Por último, ningún grupo ha informado del uso de celdas VX2 cultivadas para crear este modelo. Por lo tanto, el propósito de este estudio es demostrar un método estandarizado exitoso de creación de modelos VX2 e informar del primer uso de células VX2 cultivadas para crear un modelo de cáncer endometrial con metástasis retroperitoneales en un conejo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>11-blade scalpel, Sterile, Disposible</td>
			<td>Aspen Surgical (VWR)</td>
			<td>80094-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gague ear vein catheter</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>14332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 braided absorbable suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine (Atravet)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>4363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution (Poviodone iodine 10%)</td>
			<td>UHN Stores</td>
			<td>457955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>McGill University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine solution</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>119872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354450</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354408</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354400</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/HAM F12 1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Caledon Lab Chem</td>
			<td>1/10/4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril injectable)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>11242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube</td>
			<td>Corning Centri-Star</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12483020</td>
			<td>brand/source not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isohexol contrast</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>407141210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam 0.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>104674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>House Brand (UofT Medstore)</td>
			<td>1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Multicell or Sigma</td>
			<td>331-010-CL or D8537-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>CA45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)</td>
			<td>T.C.M.F (Dr Bristow)</td>
			<td>28-Jan-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Glue (Tissue Adhesive)</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>14695B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.25%), Proteomics Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6567-5X20UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-542-EL</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells

El cáncer de endometrio es la neoplasia maligna ginecológica más común en América del Norte y la incidencia está aumentando en todo el mundo. El tratamiento consiste en cirugía con o sin tratamiento adyuvante dependiendo de la afectación de los ganglios linfáticos según lo determinado por la linfadenectomía. La linfadenectomía es un procedimiento mórbido, que no ha demostrado tener un beneficio terapéutico en muchos pacientes, por lo que se requiere un nuevo método para diagnosticar metástasis de ganglios linfáticos. Para probar nuevos agentes de imágenes, se necesita un modelo fiable de cáncer endometrial con metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales. El modelo de cáncer de endometrio VX2 se ha descrito con frecuencia en la literatura; sin embargo, existe una variación significativa con respecto al método de establecimiento de modelos. Además, no se han reportado estudios sobre el uso de células VX2 cultivadas para crear este modelo, ya que sólo las células propagadas in vivo se han utilizado previamente. En este documento, presentamos un método quirúrgico estandarizado y un método de monitoreo postoperatorio para el establecimiento del modelo de cáncer de endometrio VX2 e informamos sobre el primer uso de células VX2 cultivadas para crear este modelo.

Veintiocho conejos fueron utilizados para la creación del modelo de cáncer de endometrio. Los conejos tenían un peso promedio de 2,83 kg (2,71-3,58 kg) en el momento del experimento. Los tumores uterinos crecieron con éxito en 21 conejos para una tasa general de éxito del modelo del 75%. Antes de la inclusión de la sutura uterina en el protocolo, la tasa de éxito fue del 57% en comparación con el 81% después de que se añadiera la sutura uterina. Sutura uterina se añadió al pro...

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An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Este protocolo presenta un método estandarizado para cultivar células VX2 en cultivo y para crear un modelo ortotópico VX2 de cáncer endometrial con metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales en conejos. Los modelos de cáncer de endometrio ortotópico son importantes para el estudio preclínico de nuevas modalidades de diagnóstico por imágenes para el diagnóstico de metástasis de ganglios linfáticos.

Un modelo de cáncer de endometrio ortotópico con linfadenopatía retroperitoneal hecha de células VX2 cultivadas y cultivadas en Vivo

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Este modelo de cáncer de endometrio VX2 con metástasis de ganglios linfáticos retroperitoneales se puede utilizar para estudiar la tecnología para la cirugía guiada por imágenes. Las principales ventajas de esta técnica son que es fiable, simple, y que crea una difusión metastásica consistente, que imita el patrón del cáncer de endometrio humano. En general, esta es una técnica simple.Sin embargo, practicar la sutura antes de intentar crear el modelo ayudará a facilitar el proceso. La demostración visual de esta técnica es importante, ya que ayuda a demostrar los pasos quirúrgicos involucrados en el establecimiento modelo. Demostrando el procedimiento con Harley Chan y yo estaremos Lili Ding, una técnico de nuestro laboratorio.Para preparar células VX2 in vitro para inyección, comience calentando los viales congelados de las células VX2 en un cordón de 37 grados Celsius o un baño de agua durante un minuto. Cuando las células se hayan descongelado, tire de las suspensiones celulares en un tubo de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de medio de cultivo. Sedimentar las células por centrifugación.Resuspender el pellet en nueve mililitros de medio. Transfiera las células a un gran matraz de cultivo para incubación a 37 grados celsius sin agitar, comprobando las células diariamente en busca de confluencia por microscopía de luz. Cuando las células hayan alcanzado el 80% de confluencia, agregue tres mililitros de 0,2% de trippsina al matraz y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante cinco minutos.Cuando las células se hayan desprendido, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico para recoger las células por centrifugación. Lave el pellet celular tres veces con nueve mililitros de PBS fresco por lavado. Después del último lavado, resuspendir las células en PBS fresco para contar antes de diluir a un cuatro veces 10 a las siete células VX2 por mililitro de concentración de PBS en un nuevo tubo cónico en hielo.Para preparar células VX2 propagadas in vivo para inyección, descongele los bloques tumorales VX2 congelados de uno por un centímetro y utilice un bisturí para picar las muestras de tejido en una placa de cultivo. Transfiera los fragmentos de tejido a un filtro de 70 micrómetros y agregue pequeñas alícuotas de hasta un mililitro de la solución de sal equilibrada de Hank, o HBSS, para asegurar que todas las células se pasen a través del colador. Luego cuente las células antes de diluir la suspensión celular a una de una por 10 a las siete células VX2 por mililitro de concentración de HBSS en un tubo estéril sobre hielo.Después de confirmar la falta de respuesta al estímulo, coloque el conejo blanco anestesado de Nueva Zelanda en la posición dorsal en la mesa de operaciones. Sujeta el cabello sobre la pelvis y el abdomen, y usa una preparación quirúrgica de la piel de tres pasos para limpiar la piel expuesta. Usar una gorra quirúrgica y una mascarilla facial, frotar las manos con desinfectante antes de ponerse una bata estéril y guantes quirúrgicos estériles.Marca la parte superior del hueso púbico y cubre el campo quirúrgico con cortinas de laparotomía, dejando una zona de cinco por cinco centímetros de la parte inferior del abdomen expuesta. A continuación, usa una hoja de bisturí número 11 para hacer una incisión de 2,5 centímetros de craneal a la sínfisis pubis a través de la piel y el tejido subcutáneo. Incitar el recto fascia y diseccionar los músculos del recto lateralmente para exponer el peritoneo subyacente.Confirme que la superficie inferior está libre de intestino u otros órganos abdominales. Entra bruscamente en el peritoneo para identificar la vejiga urinaria y barre un dedo enguantado superior, posterior y lateralmente sobre el ápice de la vejiga para localizar los cuernos uterinos. Extraiga los cuernos uterinos a través de la incisión abdominal para descansar sobre la pared abdominal.Utilice una sutura absorbible trenzada de 3-0 para realizar una sola ligadura de sutura de cada cuerno uterino, aproximadamente 1,5 a dos centímetros distales a los cuellos de cervicio y sólo medial a las arterias uterinas. A continuación, ate las suturas cómodamente para incluir los cuernos uterinos distales. Para inocular el miometrio con la suspensión celular VX2 previamente preparada, cargue una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 27 con un mililitro de células.Inyecte lentamente 0,5 mililitros de la suspensión celular durante un minuto en cada cuerno uterino proximal en el lugar de la sutura entre la sutura y el cuello uterino. A continuación, aplique presión en el lugar de inyección miometrial durante 30 segundos para minimizar las fugas celulares. Inspeccione los sitios de inyección y sutura en busca de hemostasia antes de volver a colocar los cuernos uterinos en el abdomen.Para el cierre profundo de la pared abdominal, identifique el ápice de la incisión peritoneal y utilice una abrazadera quirúrgica para agarrar el músculo peritoneo rectus y la fascia. Ancle la sutura colocando una sutura de polifilamento absorbible 3-0, superficial a profunda en un ápice de la incisión, y de profundidad a superficial en el otro. Usando la sutura adjunta, haga puntos de correr perpendiculares a la incisión a través de las capas de la pared abdominal, trabajando paso a paso a lo largo de la incisión de lado a lado antes de atar la sutura y cortar los cabos sueltos.Para el cierre superficial de la pared abdominal, utilice un subcuticular enterrado 3-0 sutura de polifilamento absorbible para suturar de profundidad a superficial en un lado de la incisión y superficial a profundo en el otro. Después de anudar las suturas, utilice las suturas ancladas para hacer puntos de correr en la capa dérmica paralela a la incisión, trabajando paso a paso a lo largo de la incisión de lado a lado. Ate las suturas y retire los cabos sueltos.Aplique pegamento quirúrgico a la incisión cerrada para aprete los bordes de la piel. Luego, coloque el animal en una manta caliente con oxígeno y monitoreo, hasta que el animal esté alerta y sea capaz de sentarse de forma independiente. Al establecer este modelo, una dosis de dos veces 10 a las siete células por cuerno uterino tuvo éxito en cuatro conejos, en un tiempo promedio de 45 días desde la inoculación hasta el experimento y por lo tanto se determinó como la dosis de inyección óptima para el modelo de VX2 cultivado.Para el modelo VX2 propagado in vivo, que se creó con éxito en 16 conejos con un tiempo promedio desde la inoculación hasta el experimento de 29 días, cinco veces 10 a las seis células por cuerno uterino se determinó como la dosis de inyección óptima. Todos los modelos dieron lugar a una transformación metastásica exitosa de los ganglios linfáticos retroperitoneales. Además, los tumores y los ganglios linfáticos metastásicos de las células VX2 cultivadas parecían similares a los tumores de células VX2 propagadas in vivo mediante análisis histológicos, con células manchadas de densymetoxina observadas en el músculo invasor y formando estructuras glandulares con muchas figuras mitóticas patológicas.Coloque la sutura medial en la arteria uterina para evitar el sangrado de una punción en el vaso y tenga cuidado de infiltrarse en las células en el miometrio y no en la cavidad endometrial. Tenga cuidado de utilizar la técnica estéril adecuada durante la creación del modelo para prevenir la infección postoperatoria y para protegerse con el material de bario durante la cirugía.

Research

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