Name: an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells
Uploaded: 2019-09-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells at JoVE.com

Denna studie finansierades av Terry Fox Research Institute (PPG # 1075), den kanadensiska Institute of Health Research (Stiftelsen Grant #154326), den kanadensiska cancer fonden Research Institute (704718), naturvetenskap och teknik Forskningsrådet i Kanada, Сanada Stiftelsen för innovation och Princess Margaret cancer Foundation.
Jag skulle vilja tacka Dr Marguerite Akens för att tillhandahålla den initiala VX2 celler för inrättandet av den ursprungliga VX2 modellen och frysta VX2 tumör blocken. Jag skulle vilja tacka Marco DiGrappa för att hjälpa till att utföra inledande VX2 cellkultur experiment och Lili Ding för att hjälpa till med VX2 cellkultur.

Djupa bukväggen stängning: identifiera spetsen av peritonealsnitt och ta tag i peritoneum, rectus muskler och fascia med vävnad forceps. Alla djurstudier utfördes i Animal Resource Center (ARC) godkända anläggningar i universitetets hälso-och sjukvårds nät och i enlighet med godkända djur användnings-och vårdprotokoll (AUP #3994/#4299). VX2 cell line erhölls från Dr Aken ' s Lab på University Health Network.
1. skapandet av in vitro-VX2 cellinjer
<ol><li>Skörda VX2 tumören f...

Häri har vi rapporterat en standardiserad kirurgisk metod för inrättandet av en VX2 endometriecancer modell och rapporterade om den första användningen av odlade VX2 celler för att skapa denna modell. Tumören ta hastighet av 75% är lägre än 100% procentsatsen tidigare rapporterats i litteraturen35,37,53,56; emellertid, THW 90% frekvens av patologiskt bekräftade lymfkörtel metastaser...

Endometriecancer, eller cancer i livmoderslemhinnan, är den näst vanligaste gynekologiska malignitet i världen och den vanligaste malignitet i utvecklade nationer1. Incidensen av endometriecancer har stadigt ökat, ökar med 2,3% per år mellan 2005-2013 med en motsvarande 2,2% ökning av dödlighet1,2,3. Diagnosen lymfkörteln metastaser är av största vikt eftersom närvaron av positiva lymfkörtlar är en stark negativ prediktor för överlevnad4,5,6,7 och kan vägleda administrationen av adjuvant terapi8,9,10,11,12,13. Lymfkörtel metastaser diagnostiseras för närvarande genom kirurgiskt avlägsnande av lymfvävnaden överliggande de stora blodkärlen i bäckenet och buken. Detta förfarande, känd som en lymfadenektomi, är kontroversiellt på grund av motstridiga överlevnadsdata från två stora prövningar14,15,16,17,18 och den kända risk för intraoperativ15,19,20 och postoperativ morbiditet21,22,23. Eftersom nuvarande icke-invasiva avbildning modaliteter inte har erforderlig känslighet och specificitet för att ersätta lymfkörtel dissektion24, det har varit en push att utveckla nya diagnostiska Imaging tekniker. För att testa dessa nya tekniker i en preklinisk miljö krävs en tillförlitlig modell av endometriecancer med retroperitoneal lymfnodmetastaser.
Den kanin VX2 tumör modell är en väletablerad modell som har använts i stor utsträckning för att studera flera humana solida organtumörer 25 inklusive lung26, huvud och hals27,28, lever29, njure30, Ben31,32, Brain33, bukspottkörteln34 och livmodern35,36,37. Den VX2 modellen utvecklades ursprungligen i 1940 av Kidd och Rous38 genom att framgångsrikt transplanterade en cottontail kanin papillomvirus upptäcktes av shope i 193339. Sedan dess, den VX2 modellen har bibehållits in vivo, vilket kräver seriell passage i quadriceps muskeln av vita nya Zeeland kaniner40. På senare tid har dock flera grupper framgångsrikt vuxit VX2 celler in vitro40,41,42 och visat den balanserade tumorigenecity av den odlade cell linjen31, 42,43. VX2 tumörer är histologiskt definieras som anaplastiskt skivepitelcancer cell karcinom44 och innehåller körtelfunktioner som liknar adenocarcinom26. Tumörer kännetecknas av enkel implantation, snabb tillväxt och Hyper-vascularity44,45 och tillförlitligt metastasize, oftast till regionala och avlägsna lymfkörtlar45. Likheter i livmoder vaskulär och lymfatiska anatomi46 samt ortotopisk tillväxt webbplats se till att metastaserande mönster av kanin VX2 carcinoma härmar den av mänskliga endometriecancer, vilket gör VX2 modellen en tillförlitlig modell för att studera mänskliga metastaserande sjukdom. Dessutom, histologiska funktioner såsom onormal mikrovaskulär proliferation47 , samt immunologiska48 och genetiska likheter49,50 mellan människor och kaniner tyder på att tumören mikromiljö kan återspegla den mänskliga endometriecancer.
Flera grupper har rapporterat om användningen av VX2 att skapa en modell av endometriecancer med retroperitoneala metastaser med en hög rapporterade andelen framgångsrika36,51,52; Det finns dock en betydande variation inom den aktuella litteraturen med hänsyn till metoden för att skapa modeller. Cell suspension doser så låga som 4 x10 5 celler/livmoderhorn 51 och så hög som 5 x 109 celler/livmoder horn37,53 har rapporterats utan standard konsensus om den erforderliga VX2 cellulära dosen. Samt, en mängd olika inokuleringsmetoder har rapporterats inklusive mikro-kirurgisk implantation av tumör i livmodern myometrium36, injektion av VX2 cellsuspension37,44,52 , 53 och i vissa fall, tillsats av livmoder horn suturering före innoympning52. Slutligen har inga grupper rapporterat användningen av odlade VX2 celler för att skapa denna modell. Sålunda, syftet med denna studie är att demonstrera en framgångsrik standardiserad metod för VX2 modellskapande och att rapportera den första användningen av odlade VX2 celler för att skapa en modell av endometriecancer med retroperitoneala metastaser i en kanin.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>11-blade scalpel, Sterile, Disposible</td>
			<td>Aspen Surgical (VWR)</td>
			<td>80094-086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22-gague ear vein catheter</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>14332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0 braided absorbable suture (Polysorb)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>356718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70uM cell strainer, Individually wrapped, Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine (Atravet)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>1047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>4363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine solution (Poviodone iodine 10%)</td>
			<td>UHN Stores</td>
			<td>457955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>McGill University</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine solution</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>119872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354450</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354408</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354400</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/HAM F12 1:1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Caledon Lab Chem</td>
			<td>1/10/4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril injectable)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>11242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tube</td>
			<td>Corning Centri-Star</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500ml</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12483020</td>
			<td>brand/source not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>UHN in-patient pharmacy</td>
			<td>No Cat # Needed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isohexol contrast</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>407141210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam (Metacam 0.5%)</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>104674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline</td>
			<td>House Brand (UofT Medstore)</td>
			<td>1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Multicell or Sigma</td>
			<td>331-010-CL or D8537-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)</td>
			<td>Corning-Cellgro</td>
			<td>CA45000-652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)</td>
			<td>T.C.M.F (Dr Bristow)</td>
			<td>28-Jan-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Glue (Tissue Adhesive)</td>
			<td>3M Vetbond</td>
			<td>14695B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.25%), Proteomics Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-6567-5X20UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05%, 100ml</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-542-EL</td>
			<td>brand not important</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic endometrial cancer model with retroperitoneal lymphadenopathy made from in vivo propagated and cultured vx2 cells

Endometriecancer är den vanligaste gynekologiska malignitet i Nordamerika och incidensen stiger över hela världen. Behandling består av kirurgi med eller utan adjuvant terapi beroende på lymfkörtelengagemang som bestäms av lymfadenektomi. Lymfadenektomi är ett Morbid förfarande, som inte har visat sig ha en terapeutisk nytta hos många patienter, och därmed en ny metod för att diagnostisera lymfkörtel metastaser krävs. För att testa nya avbildnings agenter behövs en tillförlitlig modell av endometriecancer med retroperitoneala lymfnodmetastaser. Den VX2 endometriecancer modellen har beskrivits ofta i litteraturen; Det finns dock en betydande variation när det gäller metoden för modell etablering. Dessutom har inga studier rapporterat om användningen av odlade VX2 celler för att skapa denna modell eftersom endast celler som sprids in vivo tidigare har använts. Häri presenterar vi en standardiserad kirurgisk metod och postoperativ övervakningsmetod för inrättandet av VX2 endometriecancer modellen och rapportera om den första användningen av odlade VX2 celler för att skapa denna modell.

Tjugoåtta kaniner användes för att skapa endometriecancer modellen. Kaniner hade en genomsnittlig vikt på 2,83 kg (2,71-3.58 kg) vid tidpunkten för experimentet. Livmodertumörer växte framgångsrikt i 21 kaniner för en övergripande modell framgång på 75%. Innan införandet av livmodern suturering i protokollet, var andelen framgångsrika 57% jämfört med 81% efter livmoder suturering lades. Livmoder suturering lades till protokollet efter den 7: e kanin som svar på...

Watch this Scientific Journal Video about An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells at JoVE.com

An Orthotopic Endometrial Cancer Model with Retroperitoneal Lymphadenopathy Made From In Vivo Propagated and Cultured VX2 Cells

Detta protokoll presenterar en standardiserad metod för att odla VX2 celler i kulturen och att skapa ett ortoämne VX2 modell av endometriecancer med retroperitoneal lymfkörtel metastaser i kaniner. Ortoämnet endometriecancer modeller är viktiga för den prekliniska studien av nya Imaging modaliteter för diagnos av lymfkörteln metastaser.

En ortotopisk endometriecancer modell med retroperitoneal lymfadenopati tillverkad av in vivo propagerade och odlade VX2 celler

Endometrial cancer is the most common gynecologic malignancy in North America and the incidence is rising worldwide. Treatment consists of surgery with or ...

Denna VX2 livmodercancer modell med retroperitoneal lymfkörtel metastasering kan användas för att studera teknik för bildstyrd kirurgi. De viktigaste fördelarna med denna teknik är att den är tillförlitlig, enkel, och att det skapar konsekvent metastaserande spridning, som efterliknar mönstret av mänsklig livmodercancer. Sammantaget är detta en enkel teknik.Men öva suturering innan du försöker skapa modellen kommer att bidra till att göra processen enklare. Visuell demonstration av denna teknik är viktigt, eftersom det bidrar till att visa de kirurgiska stegen som deltar i modell etablering. Demonstrerar proceduren med Harley Chan och jag blir Lili Ding, en tekniker från vårt laboratorium.För att förbereda in vitro-förökade VX2-celler för injektion, börja med att värma frysta injektionsflaska med VX2-celler i en 37 grader Celsius pärla eller vattenbad i en minut. När cellerna tinat, dra cellupphängningar i en 15-milliliter tub som innehåller 10 milliliter odlingsmedium. Sediment cellerna genom centrifugeringen.Resuspend pelleten i nio milliliter medium. Överför cellerna till en stor odlingskolv för inkubation vid 37 grader Celsius utan att skaka, kontrollera cellerna dagligen för sammanflödet genom lätt mikroskopi. När cellerna har nått 80%konfluency, tillsätt tre milliliter av 0,2%trypsin till kolven och returnera cellerna till cellodlingsinkubatorn i fem minuter.När cellerna har lossnat, överför cellupphängningen till ett koniskt rör för att samla in cellerna genom centrifugering. Tvätta cellpelleten tre gånger med nio milliliter färsk PBS per tvätt. Efter den sista tvätten, resuspend cellerna i färska PBS för räkning innan spädning till en fyra gånger 10 till de sju VX2 celler per milliliter PBS koncentration i ett nytt koniskt rör på is.För att förbereda in vivo-förökade VX2-celler för injektion, tina fryst en med en centimeter VX2 tumör block och använda en skalpell för att finhacka vävnadsproverna i en odlingsplatta. Överför vävnadsfragmenten till ett 70-mikrometerfilter och tillsätt små alikvoter på upp till en milliliter av Hanks balanserade saltlösning, eller HBSS, för att säkerställa att alla cellerna förs genom silen. Räkna sedan cellerna innan cellupphängningen späds till en gånger 10 till de sju VX2-cellerna per milliliter av HBSS-koncentration i ett sterilt rör på is.Efter att ha bekräftat en brist på svar på stimulans, placera den sövda kvinnliga vita Nya Zeeland kanin i dorsala position på operationsbordet. Klipp håret över bäckenet och buken, och använd en tre steg kirurgisk hud prep för att rengöra den exponerade huden. Iklädd en kirurgisk mössa och ansiktsmask, skrubba händerna med desinfektionsmedel innan du sätter på en steril klänning och sterila kirurgiska handskar.Landmark toppen av blygdbenet och drapera det kirurgiska fältet med laparotomy draperier, lämnar en fem med fem centimeter område av nedre delen av buken exponeras. Därefter använder ett nummer 11 skalpell blad för att göra en 2,5-centimeters snitt en centimeter hjärnskålen till symphysis pubis genom hud och subkutan vävnad. Incise rectus fascia och dissekera rectus musklerna i lateralt att exponera den underliggande peritoneum.Bekräfta att underytan är fri från tarm eller andra bukorgan. Skarpt in i bukhinnan för att identifiera urinblåsan och sopa en gloved finger superiorly, posteriorly, och lateralt över spetsen av urinblåsan för att lokalisera livmodern horn. Extrahera livmoderhornen genom bukans snitt för att vila på bukväggen.Använd en 3-0 flätad absorberbar sutur för att utföra en enda suturligering av varje livmoderhorn, cirka 1,5 till två centimeter distalt till cervices och bara mediala till livmoderartärerna. Sedan knyta suturerna tätt för att inkludera de distala livmoderhornen. För att inokulera myometriumet med den tidigare beredda VX2-cellupphängningen, ladda en en-milliliterspruta utrustad med en 27-gauge nål med en milliliter celler.Spruta långsamt in 0,5 milliliter av cellupphängningen under en minut i varje livmoderhorn proximalt till suturstället mellan suturen och livmoderhalsen. Applicera sedan tryck på myometriets injektionsställe i 30 sekunder för att minimera cellläckage. Inspektera injektions- och suturställena för hemostas innan livmoderhornen placeras tillbaka i buken.För djup bukväggen stängning, identifiera apex av peritoneal ancision och använda en kirurgisk klämma för att gripa tag i bukhinnan rectus muskel och fascia. Förankra suturen genom att placera en 3-0 absorberbar polyfilament sutur, ytlig till djup på en spets av snittet, och djupt till ytlig på den andra. Med hjälp av den bifogade suturen, gör löpande stygn vinkelrätt mot snittet genom lagren av bukväggen, arbetar stegvis längs snittet från sida till sida innan binda av suturen och skära de lösa ändarna.För ytliga bukväggen stängning, använd en begravd kör subkutik[ 3-0 absorberbara polyfilament sutur till sutur djupt till ytliga på ena sidan av snittet och ytliga till djupt på den andra. Efter att ha knutit suturerna, använd de förankrade suturerna för att göra löpstygn i det dermala lagret parallellt med snittet, arbeta stegvis längs snittet från sida till sida. Knyt suturerna och ta bort de lösa ändarna.Applicera kirurgiskt lim på det slutna snittet för att appose hudkanterna. Placera sedan djuret på en varm filt med syre och övervakning, tills djuret är alert och kan sitta självständigt. När upprättandet av denna modell, en dos av två gånger 10 till de sju cellerna per livmoderhorn var framgångsrik i fyra kaniner, i en genomsnittlig tid på 45 dagar från inokulering till experiment och fastställdes därmed som den optimala injektionsdosen för den odlade VX2-modellen.För in vivo-förökade VX2 modell, som framgångsrikt skapades i 16 kaniner med en genomsnittlig tid från inokulering till experiment på 29 dagar, fem gånger 10 till de sex cellerna per livmoderhorn bestämdes som den optimala injektionsdosen. Alla modeller resulterade i en framgångsrik ögonbevarande omvandling av de retroperitoneal lymfkörtlarna. Vidare, tumörer och ögonbevarande lymfkörtlar från odlade VX2 celler verkade liknar tumörer från in vivo-förökade VX2 celler genom histologisk analys, med densymetoxolin-färgade celler som observerats i den invaderande muskeln och bildar glandular som strukturer med många patologiska mytotiska siffror.Placera din sutur mediala till livmoderns artär för att undvika blödning från ett kärl punktering och noga med att infiltrera cellerna i myometrium och inte livmodercancer hålighet. Var noga med att använda korrekt steril teknik under modellskapandet för att förhindra postoperativ infektion och för att skydda dig med bariummaterialet under operationen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Fluorescerande Orthotopic musmodell för cancer i bukspottskörteln

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Murina Experimentellt av ursprungliga tumören utveckling och peritonealdialys metastasering<em&gt; via</em&gt; Orthotopic Ympning med ovarialcancer celler

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolering av cirkulerande tumörceller i en ortotopisk musmodell av kolorektal cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Utveckling av en mänsklig preklinisk modell av Osteoclastogenesis från perifert blod monocyter Co odlade med Breast Cancer cellinjer

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

An In Vivo Murine Sciatic Nerve Model of Perineural Invasion

En In Vivo murina ischiasnerven modell av Perineural Invasion

Cancer cells invade nerves through a process termed perineural invasion (PNI), in which cancer cells proliferate and migrate in the nerve ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping av ortotop Homograft (syngena) av murina primära KPC pankreas duktal adenokarcinom av flödescytometri

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Development and Angiographic Use of the Rabbit VX2 Model for Liver Cancer

Utveckling och angiografiska användning av kanin VX2 modell för levercancer

The rabbit VX2 tumor is an animal model commonly utilized for translational research regarding hepatocellular carcinoma (HCC) in the field of ...

Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells

Rumslig och temporal kontroll av murina melanom initiering från Mutant melanocyte stamceller

Cutaneous melanoma is well known as the most aggressive skin cancer. Although the risk factors and major genetic alterations continue to be documented ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studera Triple negativ bröstcancer med ortopotopic bröstcancer modell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

En ortopisk sambandsmusmodell av bukspottskörtelcancer

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...