Name: dna electrophoresis using thiazole orange instead of ethidium bromide or alternative dyes
Uploaded: 2019-03-31T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de TMD de Christopher Newport University.

1. préparation du gel
Nota : Pour les protocoles d’électrophorèse sur gel général, voir aussi P.Y. Lee, et al. 14.
<ol><li>Mélanger le gel d’agarose (~ 1 % p/v, pourcentage peut varier pour des séparations de taille particulière) dans un tampon (environ 70 mL pour un mini-gel (8 x 7 cm)). Les mémoires tampons sont couramment TAE (pH de tris-acétate-EDTA, Tris, acétate de 20 mM, 40 mM EDTA 1 mM, environ 8,6) ou TBE (pH de tris-borate-EDTA, Tris...

<ol>
	<li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis.">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li><li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella/microsome+test:+assay+of+300+chemicals.">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li><li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. 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Le bromure d’éthidium est depuis longtemps un outil standard dans le laboratoire de biologie moléculaire, malgré la toxicité connue. Il souffre également d’exiger la lumière UV, ce qui endommage l’ADN tel qu’il est détecté. Thiazole orange offre une alternative peu coûteuse au bromure d’éthidium, ainsi que des colorants commerciaux utiles mais chers.
Les avantages d’orange thiazole sont ainsi deux fois. Tout d’abord, orange thiazole utilisable simplement comme un rempla...

Le but de cette méthode consiste à identifier l’ADN en gels d’agarose en utilisant thiazole orange (TO) pour la détection par fluorescence. En raison de son profil d’innocuité favorable et à faible coût, orange thiazole peut voir particulièrement bénéfique dans les laboratoires d’enseignement de premier cycle et des laboratoires de recherche effectuant la biologie moléculaire, en particulier des trompes et le clonage.
Le bromure d’éthidium reste la teinture plus courante pour la détection de l’ADN en gels d’agarose. C’est principalement parce qu’il peut être obtenu très peu de frais et ne nécessite que d’excitation avec la lumière UV pour détection. Les deux d’éthidium bromure thiazole orange sont peu coûteux, avec détection de faibles limites (ng/voie 1-2)1. Il y a deux principaux inconvénients au bromure d’éthidium, cependant, qui améliore orange thiazole.
Tout d’abord, le bromure d’éthidium est un agent mutagène2 avec un traitement spécial, l’envoi et exigences de la disposition, alors que thiazole orange est moins mutagène (3 – 4 x moins mutagène dans le test d’Ames)3,4 et peuvent être éliminées en général avec déchets chimiques communs.
Deuxièmement, le bromure d’éthidium exige la lumière UV pour la détection. Thiazole orange pouvez utiliser de la même façon de lumière UV si vous le souhaitez, mais peut également être détecté avec la lumière bleue. Lumière UV, bien que couramment utilisé, a quelques inconvénients marquants. Tout d’abord, il est dommageable pour les yeux et la peau humaine. Alors que la lumière UV peut être utilisé en toute sécurité par des professionnels qualifiés, cutanée ou oculaire dommages accidentels (fonctionnellement similaires aux coups de soleil) de la lumière UV de laboratoire ne sont pas rares en particulier avec les scientifiques inexpérimentés. En second lieu, la lumière UV est extrêmement nuisible à ADN échantillons5, ce qui réduit le succès des expériences en aval (par exemple la ligature et transformation)1,6,7. TO permet de détecter avec la lumière bleue (λex, max = 510 nm (488 nm et 470 nm montrent aussi forte excitation)), qui ne provoque pas de lésions cutanées ou d’endommager l’ADN (bien que toute lumière intense peut encore être nocif pour les yeux), qui réduit considérablement les risques pour les deux le scientifique et l’échantillon.
N’est pas l’alternative de colorant fluorescent seulement au bromure d’éthidium ; son avantage est le coût. A été découvert dans les années 1980 comme une tache de réticulocytes8et a trouvé l’utilitaire dans un certain nombre de fluorescence basées sur l’ADN des expériences9,10,11,12,13. Il est actuellement vendu par plusieurs fournisseurs. Est le composé parent de supplémentaires, plus cher, colorants commerciaux bleu lumière – détectables et se comporte de la même façon au cours de l’électrophorèse, UV ou lumière bleue pour détection1. En outre, alors que les autres colorants sont plus sensibles à très faibles concentrations d’ADN que le bromure d’éthidium ou TO, pour des expériences d’électrophorèse génériques, ces colorants sont prohibitifs dans de nombreux contextes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-log DNA ladder</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N0469S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose (Genetic Analysis Grade)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Blue-light flashlight</td>
			<td style="width:71px;">WAYLLSHINE (Amazon)</td>
			<td style="width:119px;">WAYLLSHINE Scalable Blue LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ChemiDoc MP</td>
			<td style="width:71px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ethidium bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1302-10</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gel apparatus (Owl Easy Cast)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen Qiaquick Gel extraction kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Safe Imager Viewing Glasses</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S37103</td>
			<td>Necessary for using blue light flashlight.*</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">G6600</td>
			<td>Blue light flashlight may be used as alternative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-010-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thiazole orange</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">390062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>*Glasses are also included with Invitrogen G6600</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna electrophoresis using thiazole orange instead of ethidium bromide or alternative dyes

Électrophorèse de gel d’ADN à l’aide de gel d’agarose est un outil commun dans les laboratoires de biologie moléculaire, permettant la séparation des fragments d’ADN de taille. Après la séparation, l’ADN est visualisé par coloration. Cet article montre comment utiliser ADN thiazole orange sur la tache. Orange de thiazole se compare favorablement à des méthodes de coloration courantes, qu’il est sensible, peu coûteux, excitables avec UV ou lumière bleue (pour éviter les dommages de l’échantillon) et plus sûr que le bromure d’éthidium. Laboratoires déjà équipés pour exécuter les expériences de l’électrophorèse d’ADN en utilisant du bromure d’éthidium peuvent généralement passer colorants sans modification supplémentaire à des protocoles existants, à l’aide de rayons UV pour la détection. Détection de la lumière bleue pour éviter tout endommagement de l’échantillon est possible en outre avec un filtre de source et d’émission de lumière bleue. Laboratoires déjà équipés pour la détection de la lumière bleue peuvent simplement passer colorants sans modification supplémentaire à des protocoles existants.

Orange de thiazole permet la détection de l’ADN, sans utiliser le bromure d’éthidium et sans moyen de rayons UV endommagent l’ADN. Le bromure d’éthidium est connu pour être mutagène, afin de l’éliminer du labo peut être avantageux. Lumière UV endommage l’ADN et diminue l’efficacité de la transformation significativement, tandis que la lumière bleue n’endommage pas l’ADN. Limites de détection sont similaires entre le bromure d’éthidium, thiazole orange et un colorant ADN commercial commun, ...

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DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Électrophorèse d’ADN à l’aide de Thiazole Orange au lieu de bromure d’éthidium ou autres colorants

Nous présentons ici un protocole pour utiliser thiazole orange pour la détection de l’ADN dans les expériences d’électrophorèse de gel. L’utilisation d’orange thiazole permet d’éliminer le bromure d’éthidium, et la détection par fluorescence peut être réalisée avec UV ou lumière bleue.

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Ce protocole est une alternative facile et peu coûteuse à l’utilisation du bromure d’éthidium pour la détection de l’ADN pendant l’électrophorèse. En enlevant le bromure d’éthidium, la lumière UV ou la lumière bleue peuvent être utilisées pour la détection. La lumière bleue n’est pas dommageable pour l’ADN, ce qui améliore les chances de succès pour les expériences en aval.C’est vraiment facile d’essayer cela. Vous n’avez qu’à remplacer le bromure d’éthidium dans vos gels par de l’orange thiazole. Pour commencer, préparez 1% de mini-gels en mélangeant environ 0,7 gramme d’agarose dans 70 millilitres de tampons tris-acétate-EDTA ou tris-borate.Ensuite, dissoudre l’orange thiazole dans DMSO pour faire une solution de stock de 10 000 X. Bien qu’il ne soit pas particulièrement sensible à la lumière, conservez le thiazole orange dans l’obscurité lorsqu’il n’est pas utilisé. Pour un stockage à long terme, faire des aliquots du mélange thiazole orange-DMSO et les congeler.Ensuite, ajouter l’orange thiazole à une concentration finale de 1,3 microgramme par millilitre, et micro-ondes le mélange de tampon d’agarose et d’orange thiazole pour dissoudre l’agarose pendant environ 60 secondes. Verser le mélange d’agarose dans un appareil de coulée de gel contenant un peigne approprié, et permettre à la solution agarose de se solidifier en gel. Pour charger le gel, placez d’abord le gel dans l’appareil électrophoresis, s’il n’est pas déjà présent.Ajoutez ensuite tae ou TBE tampon en cours d’exécution pour couvrir la surface du gel. Ensuite, à l’aide d’un colorant de chargement, chargez 10 microlitres d’un échantillon d’ADN. Inclure une échelle de dimensionnement de l’ADN pour référence.Fixez le couvercle et les électrodes, et exécutez le mini-gel à 100 volts jusqu’à ce que le colorant de chargement se déplace environ quatre à sept centimètres pour un mini-gel. Si l’orange thiazole n’a pas été appliquée avant la coulée de gel, tacher le gel en l’immergeant dans le tampon contenant de l’orange thiazole avec une agitation douce pendant environ 20 minutes ou jusqu’à ce que les bandes soient complètement détectées. Pour visualiser le gel à l’aide d’un transilluminateur UV, retirez le gel de l’appareil électrophoresis et placez-le sur le transilluminateur UV.Pour visualiser le gel à l’aide d’un transilluminateur de lumière bleue ou d’une lampe de poche, placez le gel sur le transilluminateur de lumière bleue ou dirigez la lampe de poche LED bleue sur le gel d’en haut ou d’en bas. Utilisez un filtre d’émission d’ambre pour filtrer la lumière bleue, permettant la visualisation de la fluorescence des complexes orange thiazole d’ADN et pour protéger les colorants. Pour faciliter la digestion ou la ligature, découpez les bandes d’ADN désirées du gel et procédez à l’extraction de l’ADN à l’aide d’un kit ou d’un protocole facilement disponible.Sélectionnez les paramètres d’excitation et d’émission appropriés dans l’appareil d’imagerie par gel. En l’absence d’un système d’imagerie avec des filtres appropriés, placez un filtre ambrée entre la caméra et la source d’excitation gel blue-light. Les limites de détection sont similaires entre le bromure d’éthidium, l’orange thiazole et un colorant commercial commun à adn détectable par la lumière bleue, la limite de détection pour les trois colorants étant d’un à deux nanogrammes par voie dans un mini-gel.Le gel d’agarose taché d’orange thiazole d’un digest de restriction est détectable quand il est excité avec un UV ou un transilluminateur de lumière bleue ou avec une lampe de poche bleue de lumière. Bien que l’orange thiazole semble être moins dangereuse que le bromure d’éthidium, l’équipement de protection individuelle standard comme les gants et les lunettes doit encore être porté.

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