Name: dna electrophoresis using thiazole orange instead of ethidium bromide or alternative dyes
Uploaded: 2019-03-31T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avvio al TDG da Christopher Newport University.

1. preparare il gel
Nota: Per protocolli di elettroforesi del gel di carattere generale, vedere anche P.Y. Lee, et al. 14.
<ol><li>Mescolare agarosio (~ 1% w/v, percentuale può essere variata per separazioni di particolari dimensioni) nel buffer (circa 70 mL per un mini-gel (8 x 7 cm)). I buffer sono comunemente TAE (pH tris-acetato-EDTA, 40 mM Tris, acetato 20 mM, 1 mM EDTA, circa 8,6) o TBE (pH di tris-borato-EDTA, 90 mM Tris, borato di 90 mM, 2 mM EDTA, c...

<ol>
	<li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis.">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li><li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella/microsome+test:+assay+of+300+chemicals.">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li><li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. 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C., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+FIT-PNA+hybridization+probe+for+the+hybridization+state+specific+analysis+of+a+C+&#8594;+U+RNA+edit+via+FRET+in+a+binary+system.">A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C &#8594; U RNA edit via FRET in a binary system.</a> Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).</li><li>Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-up+properties+of+complexes+between+thiazole+orange-small+molecule+conjugates+and+aptamers.">Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers.</a> Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).</li><li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose.">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li></ol>

Il bromuro di etidio è stata a lungo uno strumento standard nel laboratorio di biologia molecolare, nonostante la tossicità conosciuta. Si soffre anche che richiedono luce UV, che danneggia il DNA, come essa viene rilevata. Thiazole orange offre una conveniente alternativa al bromuro di etidio, nonché coloranti commerciale utile ma costosi.
I vantaggi dell'arancio di tiazolo sono così due volte. In primo luogo, arancio di tiazolo può essere utilizzato semplicemente come una sostituzione p...

Lo scopo di questo metodo è per identificare il DNA in gel dell'agarosi usando thiazole orange (a) per la rilevazione della fluorescenza. A causa del suo profilo di sicurezza favorevole e basso costo, arancio di tiazolo può vedere particolare beneficio nei laboratori di insegnamento universitario e laboratori di ricerca, esecuzione di biologia molecolare, specialmente legature e clonazione.
Il bromuro di etidio rimane il colorante più comune per il rilevamento del DNA in gel dell'agarosi. Questo è principalmente perché si può ottenere molto a buon mercato e solo richiede eccitazione con luce UV per il rilevamento. Entrambi etidio bromuro e thiazole orange sono economici, con rilevamento basso limiti (1-2 ng/lane)1. Ci sono due principali svantaggi al bromuro di etidio, tuttavia, che migliora l'arancio di tiazolo.
In primo luogo, il bromuro di etidio è un agente mutageno2 con gestione speciale, spedizione e requisiti di smaltimento, mentre thiazole orange è meno mutagena (3 – 4 x meno mutagena nel test di Ames)3,4 e possono generalmente essere smaltiti con comuni rifiuti chimici.
In secondo luogo, il bromuro di etidio richiede luce UV per il rilevamento. Thiazole orange similmente possibile utilizzare luce UV se desiderato, ma può anche essere rilevata con luce blu. Luce UV, mentre comunemente usati, ha alcuni svantaggi salienti. In primo luogo, è dannoso per gli occhi e la pelle umana. Mentre la luce UV può essere utilizzata in modo sicuro da professionisti qualificati, pelle o occhi danni accidentali (funzionalmente simili a scottature) da laboratorio UV luce non sono infrequenti specialmente con gli scienziati inesperti. In secondo luogo, la luce UV è estremamente dannoso a DNA campioni5, che riduce il successo di esperimenti a valle (ad esempio la legatura e trasformazione)1,6,7. TO permette la rilevazione con luce blu (λex, max = 510 nm (488 nm e 470 nm mostrano anche forte eccitazione)), che non provoca danni alla pelle o DNA danni (anche se qualsiasi luce intensa può ancora essere dannoso per gli occhi), diminuendo notevolmente i rischi per entrambi lo scienziato e l'esempio.
Non è l'alternativa di tintura fluorescente solo al bromuro di etidio; il suo vantaggio è il costo. A è stato scoperto nel 1980 come una macchia di reticolociti8e ha trovato il programma di utilità in un certo numero di fluorescenza basati sul DNA esperimenti9,10,11,12,13. È attualmente venduto da più fornitori. A è il composto progenitore di ulteriori, più costoso, coloranti commerciale blu-luce – rilevabile e si comporta allo stesso modo durante l'elettroforesi, usando UV o luce blu per rilevazione1. Inoltre, mentre altri coloranti sono più sensibili a concentrazioni molto basse di DNA di EtBr o TO, per esperimenti di elettroforesi generico, questi coloranti sono proibitivamente costosi in molti contesti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-log DNA ladder</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N0469S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose (Genetic Analysis Grade)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Blue-light flashlight</td>
			<td style="width:71px;">WAYLLSHINE (Amazon)</td>
			<td style="width:119px;">WAYLLSHINE Scalable Blue LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ChemiDoc MP</td>
			<td style="width:71px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ethidium bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1302-10</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gel apparatus (Owl Easy Cast)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen Qiaquick Gel extraction kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Safe Imager Viewing Glasses</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S37103</td>
			<td>Necessary for using blue light flashlight.*</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">G6600</td>
			<td>Blue light flashlight may be used as alternative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-010-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thiazole orange</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">390062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>*Glasses are also included with Invitrogen G6600</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna electrophoresis using thiazole orange instead of ethidium bromide or alternative dyes

L'elettroforesi del gel del DNA usando agarosio è uno strumento comune in laboratori di biologia molecolare, consentendo la separazione dei frammenti di DNA di dimensioni. Dopo la separazione, il DNA è visualizzato dalla macchiatura. In questo articolo viene illustrato come utilizzare DNA thiazole orange a macchia. Arancio di tiazolo paragona favorevole ai comuni metodi di colorazione, in quanto è sensibile, poco costoso, eccitabile con UV o luce blu (per evitare danni di campione) e più sicuro che il bromuro di etidio. Laboratori già attrezzati per eseguire esperimenti di elettroforesi di DNA usando il bromuro di etidio possono passare generalmente coloranti senza ulteriori modifiche ai protocolli esistenti, utilizzando la luce UV per il rilevamento. Rilevamento di luce blu per evitare danni di campione può inoltre avvenire con un filtro di origine e di emissione di luce blu. Laboratori già attrezzati per il rilevamento di luce blu possono semplicemente passare coloranti senza ulteriori modifiche ai protocolli esistenti.

Arancio di tiazolo consente l'individuazione di DNA, senza utilizzare il bromuro di etidio e senza l'utilizzo di luce UV danneggiano il DNA. Bromuro di etidio è ben noto per essere mutageno, quindi eliminarlo dal laboratorio può essere vantaggioso. Luce UV danneggia il DNA e abbassa l'efficienza di trasformazione in modo significativo, considerando che la luce blu non danneggia il DNA. Limiti di rilevazione sono simili tra il bromuro di etidio, thiazole orange e un colorante DNA commerciale comune, blu-luce – rilevab...

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DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Elettroforesi di DNA usando Thiazole Orange invece di bromuro di etidio o coloranti alternativi

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare thiazole orange per la rilevazione di DNA negli esperimenti di elettroforesi del gel. L'uso dell'arancio di tiazolo permette l'eliminazione del bromuro di etidio, e rilevazione di fluorescenza può essere realizzato con UV o luce blu.

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Questo protocollo è un'alternativa facile ed economica all'uso del bromuro di etidio per il rilevamento del DNA durante l'elettroforesi. Rimuovendo il bromuro di etidio, la luce UV o la luce blu possono essere utilizzate per il rilevamento. La luce blu non è dannosa per il DNA, il che migliora le possibilità di successo per gli esperimenti a valle.È davvero facile provarlo. Devi solo sostituire il bromuro di etidio nei tuoi gel con l'arancia tiazolo. Per iniziare, preparare mini-gel all'1% mescolando circa 0,7 grammi di agarosio in 70 millilitri di tamponi tris-acetato-EDTA o tris-borato.Quindi, sciogliere l'arancione tiazolo in DMSO per creare una soluzione stock 10.000X. Sebbene non particolarmente sensibile alla luce, conservare l'arancione tiazolo al buio quando non è in uso. Per la conservazione a lungo termine, fare aliquote della miscela tiazolo arancione-DMSO e congelarle.Quindi, aggiungere l'arancia tiazolo a una concentrazione finale di 1,3 microgrammi per millilitro e microonde la miscela di tampone di agarosio e arancia tiazolo per sciogliere l'agarosio per circa 60 secondi. Versare la miscela di agarosio in un apparecchio di fusione del gel contenente un pettine appropriato e lasciare che la soluzione di agarosio si solidifichiamo in un gel. Per caricare il gel, posizionare prima il gel nell'apparato di elettroforesi, se non già presente.Quindi aggiungere il buffer di corsa TAE o TBE per coprire la superficie del gel. Successivamente, utilizzando un colorante di carico, caricare 10 microlitri di un campione di DNA. Includere una scala di dimensionamento del DNA come riferimento.Fissare il coperchio e gli elettrodi ed eseguire il mini-gel a 100 volt fino a quando la tintura di carico viaggia di circa quattro-sette centimetri per un mini-gel. Se l'arancia tiazolo non è stata applicata prima della fusione del gel, macchiare il gel immergendolo nel tampone contenente arancia tiazolo con agitazione delicata per circa 20 minuti o fino a quando le bande non sono completamente rilevate. Per visualizzare il gel utilizzando un transilluminatore UV, rimuovere il gel dall'apparato di elettroforesi e posizionarlo sul transilluminatore UV.Per visualizzare il gel utilizzando un transilluminatore a luce blu o una torcia elettrica, posizionare il gel sul transilluminatore a luce blu o dirigere la torcia a LED blu sul gel dall'alto o dal basso. Utilizzare un filtro ad emissione ambra per filtrare la luce blu, consentendo la visualizzazione della fluorescenza dai complessi arancioni tiazole del DNA e per proteggere i coloranti. Per un'ulteriore digestione o legatura, tagliare le bande di DNA desiderate dal gel e procedere all'estrazione del DNA utilizzando un kit o un protocollo prontamente disponibile.Selezionare le impostazioni di eccitazione ed emissione appropriate nell'apparato gel-imaging. In assenza di un sistema di imaging con filtri appropriati, posizionare un filtro ambra tra la fotocamera e la sorgente di eccitazione gel blu-luce. I limiti di rilevamento sono simili tra bromuro di etidio, arancione tiazolo e un comune colorante di DNA commerciale rilevabile dalla luce blu, con il limite di rilevamento per tutti e tre i coloranti da uno a due nanogrammi per corsia in un mini-gel.Il gel di agarosio tinto arancione tiazolo di un digest di restrizione è rilevabile quando è eccitato con un UV o un transilluminatore a luce blu o con una torcia a luce blu. Mentre l'arancione tiazolo sembra essere meno pericoloso del bromuro di etidio, i dispositivi di protezione individuale standard come guanti e occhiali dovrebbero ancora essere indossati.

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