Name: dna electrophoresis using thiazole orange instead of ethidium bromide or alternative dyes
Uploaded: 2019-03-31T13:00:00
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この作品はクリストファー ・ ニューポート大学から本校にスタートアップ資金によって支えられました。

1. ゲルの準備
注: 一般的なゲルの電気泳動のプロトコルも参照してください P.Y. 李ら。14。
<ol><li>アガロースをミックス (~ 1 %w/v、特定のサイズ分離の割合を変えることができる) バッファー (ミニ ゲル (8 × 7 cm) を約 70 mL)。バッファーは、一般的泰 (トリス酢酸 EDTA、40 mM 20 mM 酢酸トリス 1 ミリメートルの EDTA、pH 約 8.6) または TBE (tris ホウ酸 EDTA?...

<ol>
	<li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis.">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li><li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella/microsome+test:+assay+of+300+chemicals.">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li><li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O&#8217;Leary, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+and+13C+NMR+Assignments+for+the+Cyanine+Dyes+SYBR+Safe+and+Thiazole+Orange.">1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange.</a> The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).</li><li>Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Probes, Inc. , (2005).</li><li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+induced+by+ultraviolet+light.">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li><li>Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+produced+by+ethidium+bromide+staining+and+exposure+to+ultraviolet+light.">DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).</li><li>Hartman, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transillumination+can+profoundly+reduce+transformation+frequencies.">Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies.</a> BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).</li><li>Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange:+a+new+dye+for+reticulocyte+analysis.">Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis.</a> Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).</li><li>Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interactions+Between+the+Fluorescent+Dye+Thiazole+Orange+and+DNA.">The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA.</a> Biopolymers. , 1-13 (1998).</li><li>Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Up+Probes:+Thiazole+Orange-Conjugated+Peptide+Nucleic+Acid+for+Detection+of+Target+Nucleic+Acid+in+Homogeneous+Solution.">Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution.</a> Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).</li><li>Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Bisquinolinium/Thiazole+Orange+Conjugates+for+Fluorescent+Sensing+of+G-Quadruplex+DNA.">Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).</li><li>Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+FIT-PNA+hybridization+probe+for+the+hybridization+state+specific+analysis+of+a+C+&#8594;+U+RNA+edit+via+FRET+in+a+binary+system.">A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C &#8594; U RNA edit via FRET in a binary system.</a> Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).</li><li>Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-up+properties+of+complexes+between+thiazole+orange-small+molecule+conjugates+and+aptamers.">Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers.</a> Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).</li><li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose.">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li></ol>

臭化エチジウムは長い知られている毒性にもかかわらず、分子生物学の実験室の標準的なツールをされています。それはまたそれが検出されて、DNA を損傷する UV ライトを要求する苦しみます。チアゾール オレンジ便利ですが高価な商業染料と同様、エチジウム ブロマイドに安価な代替を提供しています。
チアゾール オレンジの利点は、このように 2 倍です。まず、チ...

このメソッドの目的は、チアゾール オレンジ (する) を使用して蛍光検出のための agarose のゲルの DNA を識別するためにです。その低コスト、良好な安全性プロファイルのためチアゾール オレンジが学部教育研究所と研究所分子生物学、特にをおよびクローン作成を実行することで特定の利点を参照してください。
臭化エチジウムのまま agarose のゲルの DNA の検出のための最も一般的な染料です。それは非常に安価で得ることができる主な理由で、検出のため紫外線で励起を必要なだけ。両方のエチジウム ブロマイドとチアゾール オレンジが低い検出限界 (1-2 ng/車線)1で、高価ではありません。チアゾール オレンジをさらに強化、ただし、エチジウム ブロマイドに 2 つの主な欠点があります。
まず、エチジウム ブロマイドは特別な処理、配送、廃棄要件と変異原2チアゾール オレンジはあまり変異原性 (3-4 x より Ames 試験で変異原性)3,4と一般との破棄できます一般的な化学廃棄物。
第二に、エチジウム ブロマイドは検出の紫外光を必要とします。チアゾール オレンジは紫外線必要に応じて、同様に使用することができますが、青色光とも検出することができます。紫外線は、一般的に使用されるいくつかの顕著な欠点を持っています。最初に、それは目や皮膚に有害です。紫外線は、訓練を受けた専門家によって安全に使用できる、偶発的な肌や目に害 (機能的日焼けに似て) 研究所 UV 光からは未熟な科学者は特に珍しいことではありません。第二に、紫外線は、DNA サンプル5(結紮変換など) 下流の実験1,6、7の成功を減らす非常に有害です。青い光で検出が可能に (λex、最大= 510 nm (488 nm、470 nm はまた強力な励起を示す))、皮膚の損傷は発生しませんまたは DNA 損傷 (ただし、任意の強烈な光は目に有害なあります)、両方科学者へのリスクが大幅に低減サンプル。
臭化エチジウム; にのみ蛍光色素の代替ではないです。その利点は、コストです。網状赤血球染色8、1980 年代に発見され、DNA ベースの蛍光実験9,10、11,12,13の数のユーティリティを発見しました。現在複数の仕入先によって販売しています。親化合物の追加より高価な青い光 – 検出可能な商業染料と検出1紫外線や青色光を用いた電気泳動の間に同様に動作します。さらに他の染料が汎用電気泳動実験の EtBr 以上に、非常に低い DNA 濃度により敏感になる中、このような染料は多くのコンテキストで価.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-log DNA ladder</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N0469S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose (Genetic Analysis Grade)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Blue-light flashlight</td>
			<td style="width:71px;">WAYLLSHINE (Amazon)</td>
			<td style="width:119px;">WAYLLSHINE Scalable Blue LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ChemiDoc MP</td>
			<td style="width:71px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ethidium bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1302-10</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gel apparatus (Owl Easy Cast)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen Qiaquick Gel extraction kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Safe Imager Viewing Glasses</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S37103</td>
			<td>Necessary for using blue light flashlight.*</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">G6600</td>
			<td>Blue light flashlight may be used as alternative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-010-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thiazole orange</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">390062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>*Glasses are also included with Invitrogen G6600</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna electrophoresis using thiazole orange instead of ethidium bromide or alternative dyes

アガロースゲルを用いた DNA 電気泳動は、サイズによる DNA のフラグメントの分離が可能分子生物学研究所で一般的なツールです。分離後、DNA は汚損によって視覚化です。この記事は、チアゾール オレンジ染色する DNA を使用する方法を示します。チアゾール オレンジは一般的な染色方法を好意的に比較し、機密性の高い、安価な紫外線やブルーライト (サンプル破損しないように)、興奮、エチジウム ブロマイドよりも安全です。臭化エチジウムを用いた DNA 電気泳動実験を実行する、既に設置されて研究所一般に検出の UV ライトを使用して、既存のプロトコルを追加変更なしで染料を切り替えることができます。サンプルの損傷を防ぐため青色光検出は、青の光のソースと排出フィルターでさらに実現できます。青色光検出のため、既に設置されて研究所単に既存のプロトコルを追加変更なしで染料を切り替えることができます。

チアゾール オレンジ エチジウム ブロマイドを使用せず、DNA にダメージを与える紫外線を使用せず、DNA の検出が有効にします。臭化エチジウムは研究室から排除することは有利かもしれないので、変異原性、よく知られています。紫外線は DNA を損傷、青い光は、DNA を損傷していませんが変換効率を大幅に下げます。検出限界がエチジウム ブロマイド、チアゾール オレンジとブルー光 – ?...

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DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動

ここでは、チアゾール オレンジをゲル電気泳動の実験で DNA の検出に使用するプロトコルを提案する.チアゾール オレンジの使用により、エチジウム ブロマイド除去、紫外線や青色光を蛍光検出を実現できます。

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

このプロトコルは、電気泳動中のDNA検出に臭化エチジウムを使用する簡単で安価な代替手段です。臭化エチジウムを除去することにより、UV光または青色光のいずれかを検出に使用することができる。青色光はDNAにダメージを与えるものではなく、下流の実験の成功の可能性を高めます。これを試すのは本当に簡単です。ゲルの臭化エチジウムをチアゾールオレンジに置き換えるだけです。始めに、トリス-酢酸-EDTAまたはトリスホウ酸塩バッファーの70ミリリットルにアガロースの約0.7グラムを混合することによって1%ミニゲルを調製します。次に、DMSOにチアゾールオレンジを溶解し、10,000Xストック溶液を作る。特に光に敏感ではないが、使用していないときに暗闇の中でチアゾールオレンジを保存します。長期保存のために、チアゾールオレンジDMSO混合物のアリコートを作り、それらを凍結する。次に、1ミリリットル当たり1.3マイクログラムの最終濃度にチアゾールオレンジを加え、アガロースバッファーとチアゾールオレンジの混合物をマイクロ波にしてアガロースを約60秒間溶解させた。適切な櫛を含むゲル鋳造装置にアガロース混合物を注ぎ、アガロース溶液をゲルに固化させます。ゲルをロードするには、まず、ゲルを電気泳動装置に入れ、まだ存在しない場合。次に、TAE または TBE ランニング バッファーを追加して、ゲルの表面を覆います。次に、負荷染料を用いて、DNAサンプルの10マイクロリットルをロードする。参照用のDNAサイジングラダーを含めます。カバーと電極を取り付け、ローディング染料がミニジェルのために約4〜7センチメートル移動するまで、ミニゲルを100ボルトで実行します。ゲル鋳造前にチアゾールオレンジを塗布しなかった場合は、チアゾールオレンジを含む緩衝液に浸してゲルを約20分間、またはバンドが完全に検出されるまで穏やかに撹拌して染色する。UVトランイルミエータを用いてゲルを可視化するには、電気泳動装置からゲルを取り出し、UVトランスイルミエータに置きます。青色光トランイルミエーターまたは懐中電灯を使用してゲルを可視化するには、青色光トランイルミエータにゲルを置くか、青色のLED懐中電灯を上または下からゲルに向けます。オレンジ色のDNAから蛍光を可視化し、色素を保護するために、青色光を除外するためにアンバーエミッションフィルターを使用してください。さらなる消化または結紮のために、ゲルから所望のDNAバンドを切り取り、容易に入手可能なキットまたはプロトコルを使用してDNAを抽出する。ゲルイメージング装置で適切な励起および発光設定を選択します。適切なフィルターを備えたイメージングシステムがない場合は、カメラとゲルブルーライト励起源の間にオレンジ色のフィルターを配置します。検出限界は、臭化エチジウム、チアゾールオレンジ、および一般的な青色光検出可能な市販DNA染料の間で類似しており、3つの色素の検出限界はミニゲル内のレーンあたり1〜2ナノグラムである。制限消化のチアゾールオレンジ染色アガロースゲルは、UVまたは青色光の経照度器または青色光懐中電灯で励起されたときに検出可能である。チアゾールオレンジは臭化エチジウムよりも危険ではないようですが、手袋やゴーグルなどの標準的な個人用保護具は着用する必要があります。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

生体試料の代謝プロファイリングのためのSheathlessキャピラリー電気泳動 - 質量分析法

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

ニュートラルキャピラリーを使用したモノクローナル抗体アイソフォームのキャピラリー電気泳動分離

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

アクリルアミドゲル電気泳動法で可視化した近赤外蛍光標識 DNA を用いた DNA ポリメラーゼ活性測定法

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

MEK 阻害剤 PD0325901 とビタミン C を用いたマウス胚性幹細胞のゲノムの低いメチル化を維持するために代替カルチャ メソッド

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

アミロイドやアミロイドのような繊維のサイズの不均一性を確認するため 2 次元半変化洗剤 Agarose のゲル電気泳動の使用

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 本質的な障害とキャピラリー電気泳動と親和性キャピラリー電気泳動による金属イオンへの結合の解析

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

ハイスループットプリマゼプロファイリングを用いたDNAプリマゼによるDNA配列認識

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

エチジウム ブロマイドや代替染料ではなくチアゾール オレンジを用いた DNA 電気泳動

エチジウムブロマイドや代替染料ではなくチアゾールオレンジを用いた DNA 電気泳動