Name: dna electrophoresis using thiazole orange instead of ethidium bromide or alternative dyes
Uploaded: 2019-03-31T13:00:00
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이 작품은 크리스토퍼 뉴포트 대학에서 TDG에 시작 기금에 의해 지원 되었다.

1. 젤을 준비
: 일반 젤 전기 이동 법 프로토콜에 대 한 참고 또한 P.Y.이, 외 알. 14.
<ol><li>Agarose를 혼합 (~ 1 %w / v, 비율 특정 크기 분판 변화 될 수 있다) 버퍼 (미니 젤 (8 x 7 cm) 약 70 mL). 버퍼는 일반적으로 태 (40 mM Tris, 20mm 아세테이트, 트리 스-아세테이트-EDTA, 1 m m EDTA, pH 약 8.6) 또는 TBE (90mm 트리 스, 90mm borate, 트리 스-borate-EDTA, 2 m m EDTA, pH 약 8.3))입니다.<...

<ol>
	<li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis.">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li><li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella/microsome+test:+assay+of+300+chemicals.">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li><li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. 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C., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+FIT-PNA+hybridization+probe+for+the+hybridization+state+specific+analysis+of+a+C+&#8594;+U+RNA+edit+via+FRET+in+a+binary+system.">A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C &#8594; U RNA edit via FRET in a binary system.</a> Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).</li><li>Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-up+properties+of+complexes+between+thiazole+orange-small+molecule+conjugates+and+aptamers.">Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers.</a> Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. 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Ethidium 평범한 사람은 오랫동안 알려진된 독성에도 불구 하 고 분자 생물학 실험실에서 표준 도구. 그것은 또한 요구로 감지 되 고 DNA를 손상 자외선에서 겪고 있다. Thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람 뿐만 아니라 유용 하지만 비싼 상업용 염료는 저렴 한 대안을 제공합니다.
Thiazole 오렌지의 혜택은 따라서 두 배. 첫째, thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람을 교체로 간단 하 게 사?...

이 방법의 목적은 agarose 젤 형광 탐지 thiazole 오렌지 (을)를 사용 하 여 DNA를 식별 하는 것입니다. 그것의 저가 및 유리한 안전 프로필로 인해 thiazole 오렌지 학부 교육 연구소 및 분자 생물학, 특히 ligations 및 복제를 수행 하는 연구 실험실에서 특정 혜택을 볼 수 있습니다.
Ethidium 평범한 사람 agarose 젤에서 DNA의 검출에 대 한 가장 일반적인 염료 남아 있습니다. 이 매우 저렴 하 게 얻을 수 있습니다 때문에 주로 하며만 자외선과 여기 검색. 두 ethidium 평범한 사람 및 thiazole 오렌지 낮은 검출 한계 (1-2 ng/레인)1비싼 되지 않습니다. 그러나 Thiazole 오렌지 시 향상 ethidium 평범한 사람,,에 두 가지 주요 단점이 있다.
첫째, ethidium 평범한 사람은 특수 처리, 운송, 및 처리 요구 사항, 돌연2 thiazole 오렌지는 덜 돌연변이 (3-4 x 덜 Ames 시험에서 변이 원 성)3,4 와 일반적으로 삭제 될 수 있습니다 일반적인 화학 폐기물입니다.
둘째, ethidium 평범한 사람 검색 UV를 빛을 필요합니다. Thiazole 오렌지 바란다면, UV 빛 마찬가지로 사용할 수 있습니다 하지만 또한 푸른 빛으로 검출 될 수 있습니다. UV 빛, 일반적으로 사용 되는 몇 가지 두드러진 단점이 있습니다. 첫째, 그것은 인간의 피부와 눈에 손상 이다. UV 빛은 숙련 된 전문가 의해 안전 하 게 사용할 수 있습니다, 하는 동안 사고 피부 또는 눈 손상 (기능적으로 비슷합니다 sunburns) 실험실 UV 빛에서 미숙한 과학자와 특히 흔히 되지 않습니다. 둘째, 자외선은 DNA 샘플5, (결 찰 및 변환) 등 다운스트림 실험1,,67의 성공을 감소 시키는 매우 파괴적 이다. TO 있습니다 푸른 빛으로 감지 (λ전, 최대 510 = nm (488 nm 및 470 nm도 강한 흥분을 표시))는 피부 손상의 원인이 되지 않습니다, 또는 DNA 손상 (하지만 어떤 강렬한 빛은 여전히 눈에 해로울 수 있습니다), 두 과학자를 위험을 크게 감소 그리고 샘플입니다.
아니다 ethidium 평범한 사람;에 형광 염료 대안 그것의 이점은 비용입니다. Reticulocyte 얼룩8, 1980 년대에서 발견 되었다 및 다양 한 형광 DNA 기반 실험9,10,11,,1213에 유틸리티를 발견 했다. 그것은 현재 여러 공급 업체에 의해 판매 됩니다. 추가 하 고, 더 비싼의 부모 화합물, 파랑-빛-감지 상업 염료 이며 탐지1UV 또는 푸른 빛을 사용 하 여 전기 이동 법 동안 유사 하 게 동작. 또한, 다른 염료 보다 더 민감한 DNA 농도 매우 낮은 EtBr 또는, 일반 전기 실험에 대 한 동안, 같은 염료는 많은 상황에서 엄청나게 비싸다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-log DNA ladder</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N0469S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose (Genetic Analysis Grade)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Blue-light flashlight</td>
			<td style="width:71px;">WAYLLSHINE (Amazon)</td>
			<td style="width:119px;">WAYLLSHINE Scalable Blue LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ChemiDoc MP</td>
			<td style="width:71px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ethidium bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1302-10</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gel apparatus (Owl Easy Cast)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen Qiaquick Gel extraction kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Safe Imager Viewing Glasses</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S37103</td>
			<td>Necessary for using blue light flashlight.*</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">G6600</td>
			<td>Blue light flashlight may be used as alternative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-010-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thiazole orange</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">390062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>*Glasses are also included with Invitrogen G6600</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna electrophoresis using thiazole orange instead of ethidium bromide or alternative dyes

DNA 젤 전기 이동 법은 agarose를 사용 하 여 크기에 의해 DNA 파편의 분리를 수 분자 생물학 실험실에서 일반적인 도구입니다. 분리 후 DNA 얼룩에 의해 시각 이다. 이 문서에서는 thiazole 주황색 얼룩을 DNA를 사용 하는 방법을 보여 줍니다. Thiazole 오렌지 비교 호의 일반적인 착 방법, 그것은, 저렴 한, UV 또는 파란 빛 (손상을 방지 하기 위해 샘플), 고르기 민감하고 ethidium 평범한 사람 보다 안전 합니다. 이미 DNA 전기 영동 실험 ethidium 평범한 사람을 사용 하 여 실행을 갖추고 실험실 일반적으로 자외선을 사용 하 여 검색에 대 한 기존 프로토콜을 추가 변경 없이 염료를 전환할 수 있습니다. 블루 빛 감지 샘플의 손상을 방지 하려면 블루 빛 소스와 배출 필터 또한 얻을 수 있습니다. 이미 블루 빛 감지 장비 실험실 단순히 기존 프로토콜 추가 변경 없이 염료를 전환할 수 있습니다.

Thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람을 사용 하지 않고 고 DNA 손상 자외선을 사용 하지 않고 DNA의 검색을 수 있습니다. Ethidium 평범한 사람은 변이 원 성, 되 고 그래서 실험실에서 그것을 제거 하는 유리한 수 있습니다. UV 빛 DNA를 손상 하 고 파란 빛은 DNA를 손상 하지 않습니다 반면 크게, 변환 효율을 낮춘 다. 검출 한계는 ethidium 평범한 사람, thiazole 오렌지, 일반적인, 파랑-빛-감지 상업 DNA 염색 유사 ...

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DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법

여기, 선물이 젤 전기 이동 법 실험에서 DNA의 검출을 위한 thiazole 오렌지를 사용 하는 프로토콜. Thiazole 오렌지의 사용 ethidium 평범한 사람의 제거를 허용 하 고 형광 탐지 UV 또는 푸른 빛으로 달성 될 수 있다.

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

이 프로토콜은 전기 전구 중 DNA 검출을 위해 에디듐 브로마이드를 사용하는 쉽고 저렴한 대안입니다. 에티듐 브로마이드를 제거함으로써 UV 라이트 또는 청색광을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 청색광은 DNA에 손상을 입히고 다운스트림 실험의 성공 가능성을 향상시킵니다.이 것을 시도하는 것은 정말 쉽습니다. 젤의 에티듐 브로마이드를 티아졸 오렌지로 교체하기만 하면 됩니다. 시작하려면 약 0.7 그램의 아가로즈를 tris-acetate-EDTA 또는 트라이스 보레이트 버퍼70 밀리리터에 혼합하여 1%mini-gels를 준비하십시오.다음으로, DMSO에 티아졸 오렌지를 녹여 10, 000X 스톡 솔루션을 만듭니다. 특히 가벼운 민감하지는 않지만 사용하지 않을 때는 티아졸 오렌지를 어둠 속에서 보관하십시오. 장기 보관을 위해 티아졸 오렌지-DMSO 혼합물의 알리쿼트(aliquots)를 만들어 동결하십시오.그런 다음, 티아졸 오렌지를 밀리리터당 1.3 마이크로그램의 최종 농도에 넣고 아가로즈 버퍼와 티아졸 오렌지의 혼합물을 전자레인지에 넣고 약 60초 동안 아가로즈를 녹입니다. 아가로즈 혼합물을 적절한 빗을 함유한 젤 주조 장치에 붓고, 아가로즈 용액이 젤로 고화되도록 한다. 젤을 적재하기 위해, 먼저 겔을 전기전도 장치에 배치하고, 아직 존재하지 않는 경우.그런 다음 TAE 또는 TBE 실행 버퍼를 추가하여 젤 표면을 덮습니다. 다음으로, 로딩 염료를 사용하여 DNA 샘플의 10 마이크로리터를 적재합니다. 참조를 위해 DNA 크기 조정 사다리를 포함한다.커버와 전극을 부착하고, 로딩 염료가 미니 젤을 위해 약 4~7cm까지 주행할 때까지 100볼트에서 미니 젤을 실행합니다. 티아졸 오렌지가 젤 주조 전에 적용되지 않은 경우, 약 20분 동안 또는 밴드가 완전히 검출될 때까지 티아졸 오렌지를 함유한 완충제에 침지하여 젤을 얼룩지게 한다. UV 트랜틸루미나이터를 사용하여 젤을 시각화하려면 전기 전광 장치에서 젤을 제거하고 UV 트랜틸루미노이터에 배치하십시오.청색광 트랜실루미나이터 또는 손전등을 사용하여 젤을 시각화하려면, 젤을 블루라이트 트랜실루미노이터에 놓거나 위 또는 아래에서 젤에 파란색 LED 손전등을 직접 배치한다. 호박색 방출 필터를 사용하여 청색광을 걸레로 하여 DNA 티아졸 오렌지 복합체에서 형광을 시각화하고 염료를 보호합니다. 추가 소화 또는 결찰을 위해, 젤에서 원하는 DNA 밴드를 잘라 쉽게 사용할 수있는 키트 또는 프로토콜을 사용하여 DNA를 추출진행합니다.젤 이미징 장치에서 적절한 여기 및 방출 설정을 선택합니다. 적절한 필터가 있는 이미징 시스템이 없는 경우 카메라와 젤 블루라이트 여기 소스 사이에 호박색 필터를 놓습니다. 검출 한계는 에티듐 브로마이드, 티아졸 오렌지 및 일반적인 청색 광 검출 가능한 상업용 DNA 염료 와 유사하며, 세 개의 염료에 대한 검출 제한은 미니 젤의 차선당 1~2나노그램입니다.제한 다이제스트의 티아졸 오렌지 스테인드 아가로즈 젤은 UV 또는 블루 라이트 트랜실루미나이터 또는 청색 조명 손전등으로 흥분할 때 감지할 수 있습니다. 티아졸 오렌지는 에티듐 브로마이드보다 덜 위험해 보이지만 장갑과 고글과 같은 표준 개인 보호 장비는 여전히 착용해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

생물 시료의 대사 프로파일 링에 대한 쉬스 모세관 전기 영동 - 질량 분석

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

연구

생화학

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

비 변성 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동을 사용하여 인간의 MXA의 멀티 서브 유닛 단백질 복합체의 특성

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

중립 모세관을 사용하여 단일 클론 항체 동종의 모세관 전기 영동 분리

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

고처리량 프리마제 프로파일링을 사용하여 DNA 프리마제에 의한 DNA 서열 인식

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...