Name: dna electrophoresis using thiazole orange instead of ethidium bromide or alternative dyes
Uploaded: 2019-03-31T13:00:00
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Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização a TDG de Christopher Newport University.

1. preparar o gel
Nota: Para protocolos de eletroforese de gel geral, ver também P.Y. Lee, et al. 14.
<ol><li>Misture a agarose (~ 1% p/v, percentagem pode ser variada para separações de determinado tamanho) em buffer (aproximadamente 70 mL para um mini gel (8 x 7 cm)). Buffers são comumente TAE (pH tris-Acetato-EDTA, 40 mM Tris, acetato de 20 mM, 1 mM EDTA, aproximadamente 8,6) ou TBE (pH tris-borato-EDTA, 90 mM Tris, borato de 90 mM, EDTA 2 mM, aproxima...

<ol>
	<li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis.">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li><li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella/microsome+test:+assay+of+300+chemicals.">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li><li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. 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P., Mergny, J. L., Monchaud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Bisquinolinium/Thiazole+Orange+Conjugates+for+Fluorescent+Sensing+of+G-Quadruplex+DNA.">Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).</li><li>Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+FIT-PNA+hybridization+probe+for+the+hybridization+state+specific+analysis+of+a+C+&#8594;+U+RNA+edit+via+FRET+in+a+binary+system.">A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C &#8594; U RNA edit via FRET in a binary system.</a> Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).</li><li>Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-up+properties+of+complexes+between+thiazole+orange-small+molecule+conjugates+and+aptamers.">Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers.</a> Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).</li><li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose.">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li></ol>

Brometo de etídio tem sido uma ferramenta padrão no laboratório de biologia molecular, apesar de toxicidade conhecida. Ele também sofre de exigir que a luz UV, que danifica o ADN, como ele está sendo detectado. Laranja de tiazol oferece uma alternativa barata para brometo de etídio, bem como corantes comerciais úteis mas caros.
Os benefícios da laranja tiazol são, portanto, duas vezes. Primeiro, laranja tiazol simplesmente pode ser usada como um substituto para o brometo de etídio. G...

A finalidade desse método é identificar o DNA em gel de agarose usando tiazol laranja (a) para a deteção de fluorescência. Devido a seu perfil de segurança de baixo custo e favorável, laranja tiazol pode ver benefício particular em laboratórios de ensino de graduação e laboratórios de pesquisa, realizando a biologia molecular, especialmente a ligadura e a clonagem.
Brometo de etídio permanece o corante mais comum para detecção de DNA em gel de agarose. Isto é principalmente porque pode ser obtido muito barata e requer apenas excitação com luz UV para a deteção. Ambas as ethidium brometo e tiazol laranja são baratos, com deteção de baixos limites (1-2 ng/pista)1. Existem duas desvantagens principais de brometo de etídio, no entanto, que laranja tiazol melhora.
Primeiro, brometo de etídio é um agente mutagénico2 com tratamento especial, transporte e eliminação requisitos, Considerando que laranja tiazol é menos mutagênico (3 – 4 x menos mutagênico no teste de Ames)3,4 e pode ser descartado em geral com resíduos químicos comuns.
Em segundo lugar, o brometo de ethidium requer luz UV para a deteção. Laranja de tiazol similarmente pode usar luz UV, se desejado, mas também pode ser detectada com luz azul. Luz UV, embora comumente utilizadas, tem algumas desvantagens importantes. Em primeiro lugar, é prejudicial para os olhos e a pele humana. Enquanto a luz UV pode ser usada com segurança por profissionais treinados, a pele ou os olhos danos acidentais (funcionalmente semelhante a queimaduras) da luz UV de laboratório não são incomuns particularmente com cientistas inexperientes. Em segundo lugar, a luz UV é extremamente prejudicial para DNA amostras5, que reduz o sucesso de experiências a jusante (tais como ligadura e transformação)1,6,7. TO permite a detecção com luz azul (λex, máximo = 510 nm (488 nm e 470 nm também mostrar forte excitação)), que não causa danos à pele ou danificar o DNA (embora qualquer luz intensa ainda pode ser prejudicial para os olhos), diminuindo significativamente os riscos para ambos o cientista e a amostra.
Não é a alternativa de tintura fluorescente só de brometo de etídio; sua vantagem é o custo. QUE foi descoberto na década de 1980 como uma mancha de Reticulócito8e encontrou o utilitário em um número de fluorescência baseado em DNA experiências9,10,11,12,13. Atualmente é vendida por vários fornecedores. QUE é o composto de adicional, mais caro, azul-luz – detectável corantes comerciais e se comporta da mesma forma durante a electroforese, UV ou luz azul para a deteção de1. Além disso, enquanto outros corantes são mais sensíveis a concentrações muito baixas de DNA que EtBr ou TO, para experimentos de electroforese genéricos, tais corantes são proibitivamente caros, em muitos contextos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-log DNA ladder</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N0469S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose (Genetic Analysis Grade)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Blue-light flashlight</td>
			<td style="width:71px;">WAYLLSHINE (Amazon)</td>
			<td style="width:119px;">WAYLLSHINE Scalable Blue LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ChemiDoc MP</td>
			<td style="width:71px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ethidium bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1302-10</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gel apparatus (Owl Easy Cast)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen Qiaquick Gel extraction kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Safe Imager Viewing Glasses</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S37103</td>
			<td>Necessary for using blue light flashlight.*</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">G6600</td>
			<td>Blue light flashlight may be used as alternative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-010-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thiazole orange</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">390062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>*Glasses are also included with Invitrogen G6600</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna electrophoresis using thiazole orange instead of ethidium bromide or alternative dyes

Eletroforese em gel de DNA usando agarose é uma ferramenta comum em laboratórios de biologia molecular, que permite a separação de fragmentos de DNA de tamanho. Após a separação, o DNA é visualizado pela coloração. Este artigo demonstra como usar o DNA de tiazol laranja para manchar. Laranja de tiazol compara-se favoravelmente a métodos comuns de coloração, em que é sensível, barata, excitáveis com UV ou luz azul (para não danificar a amostra) e mais seguro do que o brometo de etídio. Laboratórios já equipados para executar experiências de electroforese de DNA utilizando o brometo de etídio geralmente podem alternar corantes sem alterações adicionais aos protocolos existentes, usando luz UV para a deteção. Deteção de luz azul para evitar dano da amostra além disso pode ser alcançada com um filtro de fonte e de emissão de luz azul. Laboratórios já equipados para a deteção de luz azul podem simplesmente alternar corantes sem alterações adicionais aos protocolos existentes.

Laranja de tiazol permite a detecção de DNA, sem o uso de brometo de etídio e sem usar luz UV nocivas para o DNA. Brometo de etídio é conhecido para ser mutagénico, para que eliminá-la do laboratório pode ser vantajoso. Luz UV danifica o DNA e reduz a eficiência de transformação significativamente, Considerando que a luz azul não danifica o DNA. Limites de detecção são semelhantes entre o brometo de ethidium, tiazol laranja e um corante comercial comum, azul-luz – detectável do DNA (<strong class="xfig"...

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DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Eletroforese de DNA usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos

Aqui, apresentamos um protocolo para usar tiazol laranja para a detecção de DNA em experimentos de electroforese do gel. O uso de laranja tiazol permite a eliminação do brometo de etídio, e detecção de fluorescência pode ser obtida com UV ou luz azul.

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Este protocolo é uma alternativa fácil e barata para usar brometo de ethidium para detecção de DNA durante a eletroforese. Removendo brometo de ethidium, a luz UV ou a luz azul podem ser usadas para detecção. A luz azul não é prejudicial ao DNA, o que melhora a chance de sucesso para experimentos a jusante.É muito fácil experimentar isso. Você só tem que substituir o brometo de ethidium em seus géis por laranja de tiazol. Para começar, prepare 1%mini-géis misturando aproximadamente 0,7 gramas de agarose em 70 mililitros de tris-acetato-EDTA ou tampões tris-borate.Em seguida, dissolva laranja de tiazol no DMSO para fazer uma solução de estoque de 10.000X. Embora não seja particularmente sensível à luz, armazene laranja de tiazol no escuro quando não estiver em uso. Para armazenamento a longo prazo, faça alíquotas da mistura laranja-DMSO de tiazol e congele-as.Em seguida, adicione laranja de tiazol a uma concentração final de 1,3 microgramas por mililitro, e micro-ondas a mistura de tampão de agarose e laranja de tiazol para dissolver agarose por aproximadamente 60 segundos. Despeje a mistura de agarose em um aparelho de fundição de gel contendo um pente apropriado, e permita que a solução agarose se solidifique em um gel. Para carregar o gel, primeiro coloque o gel no aparelho de eletroforese, se ainda não estiver presente.Em seguida, adicione o tampão de execução TAE ou TBE para cobrir a superfície do gel. Em seguida, usando um corante de carga, carregue 10 microliters de uma amostra de DNA. Inclua uma escada de dimensionamento de DNA para referência.Conecte a tampa e os eletrodos, e execute o mini-gel a 100 volts até que o corante de carga viaje aproximadamente quatro a sete centímetros para um mini-gel. Se a laranja thiazole não foi aplicada antes do fundição de gel, colori o gel, imergindo-o no tampão contendo laranja de tiazol com agitação suave por cerca de 20 minutos ou até que as bandas sejam totalmente detectadas. Para visualizar o gel usando um transilluminador UV, remova o gel do aparelho de eletroforese e coloque-o no transilluminador UV.Para visualizar o gel usando um transilluminador de luz azul ou uma lanterna, coloque o gel no transilluminador de luz azul ou direcione a lanterna LED azul no gel de cima ou abaixo. Use um filtro de emissão âmbar para filtrar a luz azul, permitindo a visualização da fluorescência dos complexos laranjas de dna thiazole e para proteger os corantes. Para maior digestão ou ligadura, corte as faixas de DNA desejadas do gel e prossiga para extrair DNA usando um kit ou protocolo prontamente disponível.Selecione as configurações de excitação e emissão apropriadas no aparelho de imagem em gel. Na ausência de um sistema de imagem com filtros apropriados, coloque um filtro âmbar entre a câmera e a fonte de excitação de luz azul-gel. Os limites de detecção são semelhantes entre brometo de ethidium, laranja de tiazol e um corante de DNA comercial comum detectável pela luz azul, com o limite de detecção para todos os três corantes sendo de um a dois nanogramas por pista em um mini-gel.O gel de agarose manchado de laranja thiazole de um digestor de restrição é detectável quando ele está animado com um UV ou um transilluminador de luz azul ou com uma lanterna de luz azul. Enquanto a laranja thiazole parece ser menos perigosa que o brometo de ethidium, equipamentos de proteção individual padrão, como luvas e óculos, ainda devem ser usados.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Eletroforese Capilar-Espectrometria de Massa para Metabolic Profiling de amostras biológicas

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Bioquímica

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Caracterização de complexos multi-subunidade de proteína de humano utilizando MxA não desnaturante em gel de poliacrilamida-electroforese

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Electroforese Capilar Separação de Anticorpo Monoclonal isoformas utilizando um capilar de ponto morto

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Eletroforese em gel horizontal para detecção melhorada de complexos de ARN-proteína

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Um método alternativo de cultura para manter Hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias Mouse usando MEK inibidor PD0325901 e vitamina C

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Utilização de eletroforese em Gel de Agarose detergente semi desnaturação Dimensional dois para confirmar a heterogeneidade de tamanho das fibras de amiloides ou Amyloid-como

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Análise de AtHIRD11 desordem intrínseca e ligação para íons metálicos por eletroforese em Gel capilar e afinidade de eletroforese capilar

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por electroforese em Gel azul nativo

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Reconhecimento da seqüência do ADN pelo primase do ADN usando o perfilamento da primase da elevado-produção

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...