Name: dna electrophoresis using thiazole orange instead of ethidium bromide or alternative dyes
Uploaded: 2019-03-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes at JoVE.com

Эта работа была поддержана запуска средства для пог от Университет Кристофера Ньюпорта.

1. Подготовка геля
Примечание: Для общего гель Протоколы электрофореза, смотрите также П.Ю. ли, и др. 14.
<ol><li>Смешайте агарозы (~ 1% w/v, процент может варьироваться для определенного размера Цветоделение) в буфере (примерно 70 мл для мини-гель (8 x 7 см)). Буферы, о?...

<ol>
	<li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis.">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li><li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella/microsome+test:+assay+of+300+chemicals.">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li><li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O&#8217;Leary, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+and+13C+NMR+Assignments+for+the+Cyanine+Dyes+SYBR+Safe+and+Thiazole+Orange.">1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange.</a> The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).</li><li>Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Probes, Inc. , (2005).</li><li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+induced+by+ultraviolet+light.">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li><li>Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+produced+by+ethidium+bromide+staining+and+exposure+to+ultraviolet+light.">DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).</li><li>Hartman, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transillumination+can+profoundly+reduce+transformation+frequencies.">Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies.</a> BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).</li><li>Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazole+orange:+a+new+dye+for+reticulocyte+analysis.">Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis.</a> Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).</li><li>Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Interactions+Between+the+Fluorescent+Dye+Thiazole+Orange+and+DNA.">The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA.</a> Biopolymers. , 1-13 (1998).</li><li>Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Up+Probes:+Thiazole+Orange-Conjugated+Peptide+Nucleic+Acid+for+Detection+of+Target+Nucleic+Acid+in+Homogeneous+Solution.">Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution.</a> Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).</li><li>Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Bisquinolinium/Thiazole+Orange+Conjugates+for+Fluorescent+Sensing+of+G-Quadruplex+DNA.">Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).</li><li>Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+FIT-PNA+hybridization+probe+for+the+hybridization+state+specific+analysis+of+a+C+&#8594;+U+RNA+edit+via+FRET+in+a+binary+system.">A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C &#8594; U RNA edit via FRET in a binary system.</a> Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).</li><li>Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-up+properties+of+complexes+between+thiazole+orange-small+molecule+conjugates+and+aptamers.">Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers.</a> Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).</li><li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose.">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li></ol>

Бромид ethidium уже давно стандартным инструментом в лаборатории молекулярной биологии, несмотря на известные токсичности. Он также страдает от требующих УФ света, который повреждает ДНК, как он определяется. Тиазол orange предлагает недорогой альтернативой бромид ethidium, а также полезные, но ?...

Этот метод предназначен для выявления ДНК в гелях агарозы, используя тиазол оранжевый (для) для флуоресценции обнаружения. Из-за его низкой стоимости и благоприятные безопасности профиля тиазола оранжевый может увидеть особую пользу в Бакалавриат учебных лабораторий и исследовательских лабораторий, выполняющих молекулярной биологии, особенно перешнуровок и клонирования.
Бромид ethidium остается наиболее распространенных краситель для обнаружения ДНК в гелях агарозы. Это главным образом потому, что она может быть получена весьма недорого и только требует возбуждения с ультрафиолетовый свет для обнаружения. Обе ethidium бромид и тиазол оранжевый недорогой, с низкой обнаружения пределов (1-2 нг/пер)1. Есть два главных недостатка бромид ethidium, однако, которые тиазол оранжевый улучшает.
Во-первых, бромид ethidium является мутагенным2 с специальной обработки, доставки и удаления требования, тогда как тиазол оранжевый менее мутагенные (3 – 4 x менее мутагенному Эймс теста)3,4 и может быть вообще утилизировать вместе с общие химические отходы.
Во-вторых бромид ethidium требует ультрафиолетовый свет для обнаружения. Тиазол оранжевый при желании также можно использовать УФ-излучения, но также могут быть обнаружены с синим светом. Ультрафиолетовый свет, в то время как широко используется, имеет несколько характерных недостатков. Во-первых это ущерб человеческой кожи и глаз. В то время как ультрафиолета может безопасно использоваться обученными профессионалами, кожи или глаз случайных (функционально похож на солнечных ожогов) от Лаборатория УФ света не являются редкостью особенно с неопытными учеными. Во-вторых ультрафиолета чрезвычайно повреждения ДНК образцов5, что снижает успех течению экспериментов (например, перевязки и трансформации)1,6,7. В позволяет обнаруживать с голубой свет (λex, Макс = 510 Нм (488 нм и 470 Нм также показывают сильного возбуждения)), которая не вызывает повреждения кожи или ДНК повреждения (хотя любой интенсивный свет все еще могут быть вредны для глаз), значительно снижается риск как ученый и образец.
Является не только Люминесцентную краску альтернативой бромид ethidium; его преимуществом является стоимость. ЧТОБЫ был обнаружен в 1980-х как пятно ретикулоцитов8и утилита в ряде на основе ДНК флуоресценции эксперименты9,10,11,12,13. В настоящее время он продается с несколькими поставщиками. Это родительский комплекса дополнительных, более дорогие, синий свет – необнаруживаемых коммерческих красители и ведет себя аналогично во время электрофореза, используя УФ или синий свет для обнаружения1. Кроме того в то время как другие красители более чувствительны к очень низкой концентрации ДНК чем бромистый этидий или к, для универсального электрофорез эксперименты, такие красители являются дорогими во многих контекстах.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:572px;" width="573">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">2-log DNA ladder</td>
			<td style="width:71px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N0469S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose (Genetic Analysis Grade)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Blue-light flashlight</td>
			<td style="width:71px;">WAYLLSHINE (Amazon)</td>
			<td style="width:119px;">WAYLLSHINE Scalable Blue LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ChemiDoc MP</td>
			<td style="width:71px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ethidium bromide</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1302-10</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gel apparatus (Owl Easy Cast)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen Qiaquick Gel extraction kit</td>
			<td style="width:71px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Safe Imager Viewing Glasses</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S37103</td>
			<td>Necessary for using blue light flashlight.*</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator)</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">G6600</td>
			<td>Blue light flashlight may be used as alternative</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYBR Safe</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S33102</td>
			<td>For comparison, not necessary for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAE (Tris-Acetate-EDTA)</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">46-010-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thiazole orange</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">390062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>*Glasses are also included with Invitrogen G6600</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna electrophoresis using thiazole orange instead of ethidium bromide or alternative dyes

Электрофорез геля дна агарозы с помощью является общим инструментом в лаборатории молекулярной биологии, позволяя разделения фрагментов ДНК по размеру. После разделения ДНК является визуализированы пятнать. Эта статья демонстрирует использование тиазол оранжевые пятна ДНК. Тиазол оранжевый выгодно общих пятная методов, в том, что чувствительные, недорогой, возбудимых с УФ или синий свет (во избежание повреждения образца) и безопаснее, чем бромид ethidium. Лаборатории, уже оснащены для запуска ДНК электрофорез эксперименты с использованием бромид ethidium обычно можно переключиться существующих протоколов, с помощью ультрафиолетовый свет для обнаружения красителей без дополнительных изменений. Синий свет обнаружения повреждения образца дополнительно может быть достигнуто с фильтром источника и выбросов синий свет. Лаборатории, уже оборудованные для обнаружения синий свет можно просто переключиться красителей без дополнительных изменений к существующим протоколам.

Тиазол оранжевый позволяет обнаружение ДНК, без использования бромид ethidium и без использования ДНК повреждения УФ-излучения. Бромид ethidium известный быть мутагенными свойствами, поэтому его ликвидации из лаборатории может быть выгодным. Свет УФ повреждений ДНК и снижает эффективность п?...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes at JoVE.com

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Электрофорез ДНК, вместо тиазол оранжевый бромид Ethidium или альтернативных красители

Здесь мы представляем протокол тиазол оранжевый для обнаружения ДНК в экспериментах электрофореза геля. Использование тиазол оранжевый позволяет ликвидации бромид ethidium, и флуоресценции обнаружения может быть достигнуто с УФ или синий свет.

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Этот протокол является легкой и недорогой альтернативой использованию бромистого этидия для обнаружения ДНК во время электрофореза. Удалив бромид этидия, для обнаружения можно использовать ультрафиолетовый или синий свет. Синий свет не повреждает ДНК, что повышает шансы на успех для экспериментов ниже по течению.Это действительно легко попробовать это. Вы просто должны заменить бромид этидия в гелях с тиазол оранжевый. Для начала приготовьте 1%мини-гелей, смешивая примерно 0,7 грамма агарозы в 70 миллилитров трис-ацетат-ЭДТА или трис-борат буферов.Затем растворите тиазол оранжевый в DMSO, чтобы сделать 10,000X фондовый раствор. Хотя не особенно свет чувствительны, хранить тиазол оранжевый в темноте, когда не используется. Для длительного хранения сделайте алициты из смеси тиазол оранжево-DMSO и заморозьте их.Затем добавьте тиазоловый апельсин в окончательную концентрацию 1,3 микрограмма на миллилитр, и микроволновая печь смесь буфера агарозы и апельсина тиазола растворить агарозу в течение примерно 60 секунд. Налейте смесь агарозы в гель литья аппарат, содержащий соответствующий гребень, и позволяют раствор агарозы затвердеть в гель. Чтобы загрузить гель, сначала поместите гель в электрофорезный аппарат, если его уже нет.Затем добавьте taE или TBE бегущий буфер, чтобы покрыть поверхность геля. Далее, используя погрузочный краситель, загрузите 10 микролитров образца ДНК. Включите лестницу размеров ДНК для справки.Прикрепите крышку и электроды, и запустить мини-гель на 100 вольт, пока погрузочный краситель путешествует примерно четыре-семь сантиметров для мини-гель. Если тиазол оранжевый не был применен до литья геля, пятно гель, погрузив его в буфер, содержащий тиазол оранжевый с нежным возбуждением в течение 20 минут или до тех пор, пока полосы полностью обнаружены. Чтобы визуализировать гель с помощью УФ-трансиллюминатора, удалите гель из электрофорезного аппарата и поместите его на УФ-трансиллюминатор.Чтобы визуализировать гель с помощью синего светового трансиллюминатора или фонарика, поместите гель на синий свет трансиллюминатор или направить синий светодиодный фонарик на гель сверху или снизу. Используйте фильтр выбросов янтаря, чтобы отфильтровать синий свет, что позволяет визуализировать флуоресценцию из ДНК тиазол оранжевых комплексов и для защиты красителей. Для дальнейшего пищеварения или перевязки, вырезать желаемые полосы ДНК из геля и приступить к извлечению ДНК с помощью легко доступны комплекта или протокола.Выберите соответствующие настройки возбуждения и выбросов в гелеобразующей аппарате. При отсутствии системы визуализации с соответствующими фильтрами поместите янтарный фильтр между камерой и гелем синего света источника возбуждения. Пределы обнаружения аналогичны между бромистым этидием, тиазол-оранжевым и обычным коммерческим красителем ДНК, обнаруживаемым синим светом, при этом предел обнаружения всех трех красителей составляет от одного до двух нанограммов на полосу в мини-геле.Тиазол оранжевый окрашенных агароза гель ограничения дайджест обнаруживается, когда он возбужденных с УФ или синий свет трансиллюминатора или с синим фонариком света. Хотя тиазол оранжевый, как представляется, менее опасны, чем бромид этидия, стандартные средства индивидуальной защиты, такие как перчатки и очки по-прежнему следует носить.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Без футляра Капиллярный электрофорез-масс-спектрометрии для Метаболический Профилирование биологических образцов

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Характеристика Multi-субъединица белковых комплексов человеческого MxA Использование неденатурирующем электрофорез на полиакриламидном геле

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Capillary Electrophoresis Separation of Monoclonal Antibody Isoforms Using a Neutral Capillary

Капиллярный электрофорез Разделение моноклональных антител изоформ с нейтральным капилляра

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Горизонтальный гель-электрофорез для расширенного обнаружения комплексов протеин-РНК

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

ДНК-полимераза деятельности пробирного с использованием флуоресцентных помечены ДНК ближней ИК-области визуализирована электрофорезом геля акриламида

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

An Alternative Culture Method to Maintain Genomic Hypomethylation of Mouse Embryonic Stem Cells Using MEK Inhibitor PD0325901 and Vitamin C

Метод альтернативной культуры для поддержания геномной Hypomethylation мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием MEK ингибитор PD0325901 и витамином С

Embryonic stem (ES) cells have the potential to differentiate into any of the three germ layers (endoderm, mesoderm, or ectoderm), and can generate many ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Использование двух мерных полу денатурируя стирального геля агарозы подтвердить размер неоднородность волокон амилоида или амилоид как

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Анализ AtHIRD11 внутренние беспорядки и привязки к ионов металлов Капиллярный электрофорез и близость капиллярного электрофореза

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Анализ тилакоидной мембраны белковых комплексов, синий родной гель-электрофорез

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Распознавание последовательности ДНК с помощью высокопроходимых профилирований primase

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...