Name: an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors
Uploaded: 2019-05-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية (منحة رقم 15SDG25740035، منحت لJ.Z.)، والمعهد الوطني للتصوير الطبي الحيوي والهندسة الحيوية (NIBIB) من المعاهد الوطنية للصحة (منحة رقم EB007507، منحت إلى C.C.)، و التحالف من أجل البحث والتدريب في مجال إعادة التأهيل التجديدي (AR3T، منحة رقم 1 P2C HD086843-01، منحت لJ.Z.). نود أن نعرب عن تقديرنا للبروفيسورة جين ستاشوياك (جامعة تكساس في أوستن) على مشورتها التقنية بشأن الفحص المجهري البؤري. كما أننا ممتنون للمناقشات مع صموئيل ميهيليتش (جامعة تكساس في أوستن)، والدكتورة أليسيا ألين (جامعة تكساس في أوستن)، والدكتورة جولي ريتلوفسكي (التكنولوجيا الحيوية التكيفية)، والدكتور ليون بيلان (جامعة فاندربيلت) لبصيرتهم في التحليل الحسابي للشبكات ثلاثية الجوانب. وأخيراً، نشكر الدكتور شياوبينغ باو (جامعة كاليفورنيا، بيركلي) على مشورته بشأن التمييز بين المراكز في مجال المجالات المتوسطة الأجل في مجال المجالات المتوسطة الأجل.

1. إعداد وسائل الإعلام الثقافية وحلول الطلاء
<ol><li>لإعداد محلول طلاء فيترونيكستين، تمييع فيتروينشينسين 1:100 في المالحة السالينة المخزنة بالفوسفات (DPBS) في دولبيكو. تحذير: بمجرد تخفيفه، لا ينصح بتخزين هذا الحل للاستخدام في المستقبل.</li>
	<li>عند تلقي الفينول خالية من الأحمر، عامل النمو خفض خلي?...

<ol>
	<li>Wang, K., Lin, R. -. Z., Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+human+vascular+networks:+trends+and+directions+in+endothelial+and+perivascular+cell+sources.">Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).</li><li>Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+approaches+to+spatiotemporally+directing+angiogenesis+in+host+and+engineered+tissues.">Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues.</a> Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).</li><li>Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+for+therapeutic+angiogenic+materials.">Design principles for therapeutic angiogenic materials.</a> Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).</li><li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+cell+tube+formation+assay+on+basement+membrane+turns+20:+State+of+the+science+and+the+art.">The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art.</a> Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).</li><li>Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+potential+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+form+microvascular+networks+in+3D+cultures.">Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).</li><li>Nakatsu, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF121+and+VEGF165+regulate+blood+vessel+diameter+through+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+in+an+in+vitro+angiogenesis+model.">VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model.</a> Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).</li><li>Shamloo, A., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+density+mediates+polarization+and+lumen+formation+of+endothelial+sprouts+in+VEGF+gradients.">Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients.</a> Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+functional+microvascular+networks+with+human+mesenchymal+stem+cells+in+microfluidic+systems.">Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems.</a> Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+network+formation+of+vascular+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Kusuma, S., Shen, Y. -. I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+vascular+networks+from+human+pluripotent+stem+cells+in+a+synthetic+matrix.">Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).</li><li>Charwat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+limitations+of+microscopy+and+Raman+spectroscopy+for+live-cell+analysis+of+3D+cell+cultures.">Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures.</a> Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).</li><li>Holnthoner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+induce+vascular+tube+formation+of+outgrowth+endothelial+cells+in+a+fibrin+matrix.">Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).</li><li>Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+for+quantifying+angiogenesis+in+the+Matrigel+assay+in+vitro.">A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).</li><li>Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+image+quantification+as+a+new+morphometry+method+for+tissue+engineering.">Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).</li><li>Kerschnitzki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+osteocyte+network+correlates+with+bone+material+quality.">Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).</li><li>Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+endothelial+progenitor+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+Wnt+activation+under+defined+conditions.">Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions.</a> Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).</li><li>Crosby, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+vasculogenic+potential+of+iPSC-derived+endothelial+progenitors+in+collagen+hydrogels.">Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2019).</li><li>Li, C. H., Tam, P. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iterative+algorithm+for+minimum+cross+entropy+thresholding.">An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding.</a> Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).</li><li>Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+world+of+osteocytes:+Connectomics+of+the+lacuno-canalicular+network+in+bone.">The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone.</a> New Journal of Physics. 19 (7), (2017).</li><li>Crosby, C. O., Zoldan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+physical+cues+of+the+ECM+in+angiogenic+biomaterials.">Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials.</a> Regenerative Biomaterials. , (2019).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+extracellular+matrix+density+and+mesenchymal+stem+cells+on+neovascularization+in+vivo.">Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).</li><li>Ghajar, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+matrix+density+on+the+regulation+of+3-D+capillary+morphogenesis.">The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).</li><li>Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+human+microvessels+formed+in+3D+fibrin+gel+by+constraint+of+gel+contraction.">Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction.</a> Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li></ol>

يتضمن هذا البروتوكول ثقافة الخلايا على المدى الطويل في ثلاثة أنواع من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا: E8، LaSR Basal، وEGM-2. ولذلك، ينبغي توخي الحذر الشديد لتعقيم جميع المواد بشكل مناسب. بالإضافة إلى ذلك، يجب ارتداء معاطف المختبر والقفازات التي يتم تنظيفها بالإيثانول دائمًا عند العمل في غطاء تدفق ?...

وقد استخدمت الخلايا البطانية الوريد السري البشري (HUVECs) وأنواع الخلايا البطانية الأولية الأخرى لمدة عقدين لنمذجة الأوعية الدموية تنبت والتنمية في المختبر1. هذه المنصات الوعائية وعد لإلقاء الضوء على الآليات الجزيئية والأنسجة على مستوى أمراض القلب والأوعية الدموية، ويمكن أن تقدم نظرة فسيولوجية في تطوير شبكات الأوعية الدموية البدائية2،3. على الرغم من أن مجال النمذجة الوعائية قد شهد تقدما كبيرا، فإن اختبار "المعيار الذهبي" الذي يمكن أن نموذج كميا وتقييم تطور الأوعية الدموية الفسيولوجية لا يزال بعيد المنال. معظم البروتوكولات المنشورة لا تلخص بشكل كاف محراب الأوعية الدموية لتشجيع تشكيل الأوعية الدموية الناضجة والوظيفية أو ليس لديها طريقة لمقارنة كمية الإمكانات الأوعية الدموية لأنواع الخلايا المقدرة في ثلاثة أبعاد ( 3D).
العديد من نماذج الأوعية الدموية الحالية محدودة في قدرتها على تقليد محراب الأوعية الدموية الفسيولوجية. واحدة من الأكثر شيوعا المستخدمة في منصات المختبر هو البروتين الجيلاتيني القائم على خليط أنبوب تشكيل الاختبار. باختصار، يتم بذر HUVECs كخلايا واحدة على طبقة رقيقة من هلام الذي يتكون من البروتينات التي يتم حصادها من مصفوفة ساركوما المورين خارج الخلية (ECM)؛ في غضون يوم واحد إلى يومين، وHUVECs تجميع الذاتي في أنابيب بدائية4. ومع ذلك، تحدث هذه العملية في بعدين (2D) والخلايا البطانية (ECs) المستخدمة في هذا الفحص لا تشكل المغلقة، لومن جوفاء، وبالتالي الحد من الأهمية الفسيولوجية لهذه الدراسات. في الآونة الأخيرة، تم زراعة الخلايا الجذعية الإلكترونية والخلايا الداعمة (على سبيل المثال، الخلايا الجذعية المتوسطة (MSCs) وpericytes) في بيئات دقيقة ثلاثية المدة تحاكي الهندسة المعمارية الليفية لـ ECM الأصلي، مثل الكولاجين أو هيدروجيلات الفيبرين5. لنموذج تطوير الأوعية الدموية في هذه البيئة الدقيقة،وتستخدم عادة الخرز البوليمرالمغلفة مع ECs 6. إضافة عوامل النمو الخارجية و / أو عوامل النمو التي تفرزها الخلايا الأخرى جزءا لا يتجزأ من hydrogel يمكن أن تحفز ECs، طلاء الخرز البوليمري، لتنبت وتشكيل تجويف واحد؛ ويمكن بعد ذلك حساب عدد وقطر البراعم والأوعية. ومع ذلك، هذه البراعم هي فريدة من نوعها ولا تشكل شبكة مغلقة ومتصلة كما هو الحال في الظروف الفسيولوجية، وبالتالي هو أكثر تذكرنا نموذج الأوعية الدموية الورم. كما تم استخدام الأجهزة الميكروفلويدية لتقليد محراب الأوعية الدموية وتعزيز تشكيل الأوعية الدموية في هيدروجيلات محملة بالجماعة الأوروبية7،8. عادة، يتم تطبيق عامل نمو الأوعية والتدرج إلى وسط ثقافة الخلية المتداولة للحث على هجرة الجماعة الأوروبية وتنبت. الـ ECs التي تشكل تجويف الأوعية المتقدمة حساسة لإجهاد القص الناجم عن تطبيق تدفق السوائل من خلال الجهاز الميكروفلويديك؛ وبالتالي، فإن هذه الأجهزة microfluidic التقاط المعلمات الفسيولوجية الرئيسية التي لا يمكن الوصول إليها في النماذج الثابتة. ومع ذلك، تتطلب هذه الأجهزة قدرات تصنيع دقيق مكلفة.
والأهم من ذلك، جميع نماذج الأوعية الدموية الثلاثة (2D، 3D، microfluidic) تستخدم بشكل ساحق ECs الأولية، فضلا عن أنواع الخلايا الداعمة الأولية. لا يمكن تطوير الخلايا الأولية إلى علاج فعال للقلب والأوعية الدموية لأن الخلايا من شأنها أن تولد استجابة مناعية عند الزرع. وعلاوة على ذلك، HUVECs وأنواع الخلايا الأولية المماثلة ليست خاصة بالمريض ولا تلتقط تشوهات الأوعية الدموية التي تحدث في المرضى الذين يعانون من التصرف الوراثي أو الظروف الصحية الموجودة من قبل، على سبيل المثال، مرض السكري. ظهرت الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) في العقد الماضي كمصدر للخلايا التكاثرية الخاصة بالمريض التي يمكن تمييزها في جميع الخلايا الجسدية في جسم الإنسان9. وعلى وجه الخصوص، نُشرت بروتوكولات تحدد توليد وعزل الذرية البطانية المستمدة من iPSC (iPSC-EPs)10و11؛ iPSC-EPs ثنائية القدرة، وبالتالي، يمكن تمييزها أكثر في الخلايا البطانية وخلايا العضلات الملساء / pericytes، لبنات بناء الأوعية الدموية الناضجة والوظيفية. وقد فصلت دراسة واحدة فقط بشكل مقنع تطوير الضفيرة الشعرية الأولية من iPSC-EPs في بيئة دقيقة 3D12; على الرغم من أن هذه الدراسة أمر بالغ الأهمية لفهم الجمعية iPSC-EP والتمايز في هيدروجيلات الطبيعية والاصطناعية، فإنه لم يقارن كميا طبولوجيا الشبكة من الأوعية الدموية الناتجة. وقد استخدمت دراسة حديثة أخرى نموذج حبة البوليمر ية لمقارنة تنبت HUVECs وECs المستمدة من iPSC5. لذلك، هناك حاجة واضحة لمزيد من توضيح آليات الإشارات الفيزيائية والكيميائية التي تنظم الأوعية الدموية iPSC-EP في البيئات الدقيقة 3D وتحديد ما إذا كانت هذه الخلايا مناسبة للعلاج الإقفاري وأمراض القلب والأوعية الدموية النمذجه.
وفي العقد الماضي، تم تطوير خطوط أنابيب حسابية مفتوحة المصدر وخوارزميات هيكل عظمي مختلفة لتحديد طول شبكة الأوعية الدموية وترابطها ومقارنتهما. على سبيل المثال، وضعت Charwat وآخرون خط أنابيب يستند إلى فوتوشوب لاستخراج مرشحة، صورة binarized من شبكات الأوعية الدموية المستمدة من ثقافة مشتركة من الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية وECs في مصفوفة الفيبرين13،14. ربما أداة مقارنة الطبولوجيا الأكثر استخداما هو AngioTool, برنامج نشر على الانترنت من قبل المعهد الوطني للسرطان15; على الرغم من اعتماد البرنامج على نطاق واسع والإخلاص موثقة جيدا، ويقتصر البرنامج على تحليل هياكل تشبه السفن في بعدين وبرامج أخرى، بما في ذلك أنجيوسيس وويماسيس، تشترك في نفس الحد من الأبعاد16. وقد تم تطوير أجنحة برامج قوية مثل Imaris, Lucis, وMetamorph لتحليل طبولوجيا الشبكة من microvasculature المهندسة; ومع ذلك، هذه الأجنحة باهظة التكلفة لمعظم المختبرات الأكاديمية وتحد من الوصول إلى التعليمات البرمجية المصدر، والتي قد تعوق قدرة المستخدم النهائي على تخصيص الخوارزمية لتطبيقها المحدد. 3D تقطيع اللحم، وهو مفتوح المصدر التصوير بالرنين المغناطيسي / الحوسبة التصوير المقطعي حزمة، يحتوي على مجموعة أدوات النمذجة الأوعية الدموية التي يمكن تحليل فعال طبولوجيا شبكات الأوعية الدموية 3D17؛ ومع ذلك، يعتمد التحليل على وضع المستخدم يدوياً النقاط النهائية للشبكة، والتي قد تصبح مملة عند تحليل مجموعة بيانات كبيرة ويمكن أن تتأثر بتحيزات المستخدم اللاشعورية. في هذه المخطوطة، يتم وصف خط أنابيب حسابي يمكن أن يحدد مقدار شبكات الأوعية الدموية ثلاثية المدة بالتفصيل. للتغلب على القيود المذكورة أعلاه، يستخدم خط الأنابيب الحسابي المفتوح المصدر هذا ImageJ إلى الصور البؤرية المكتسبة قبل العملية لتحميل وحدة التخزين ثلاثية الأبعاد في محلل هيكل عظمي. محلل الهيكل العظمي يستخدم خوارزمية رقيق محور وسيط ة موازية، وقد تم تطويره في الأصل من قبل Kerschnitzki وآخرون لتحليل طول واتصال شبكات osteocyte18; يمكن تطبيق هذه الخوارزمية بشكل فعال لتوصيف طول واتصال microvasculature المهندسة.
وإجمالاً، يحدد هذا البروتوكول إنشاء شبكات الأوعية الدموية الدقيقة في البيئات الدقيقة ثلاثية الجوانب، ويوفر خط أنابيب حسابي مفتوح المصدر وخال ٍ من تحيز المستخدم لمقارنة الإمكانات الأوعية الدموية للـ iPSC-EPs بسهولة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td>Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>The base media for iPSC-EP differentiation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50136165</td>
			<td>Water purification system; others can be readily substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A8412</td>
			<td>To preserve cell viability when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE, human (clone: AC136)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-140</td>
			<td>Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>C-6556</td>
			<td>Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg</td>
			<td>VWR</td>
			<td>354249</td>
			<td>Main component of the 3D microenvironment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes (15/50 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D/A</td>
			<td>Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>To counterstain and visualize cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320-082</td>
			<td>For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>To wash monolayer cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008</td>
			<td>For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td>Promotes endothelial cell viability and proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001&#160;&#160;</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,BioUltra, for molecular biology, &#62;=99.0% (NT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>Neutralizes remaining detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,&#62;=95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>Component of iPSC-EP differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>1.8.0_152</td>
			<td>Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>356231</td>
			<td>Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1825015</td>
			<td>Used to balance final hydrogel osmolarity and pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Stores small volumes of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>The main ingredient of the immunostaining solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td>Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine phalloidin</td>
			<td>Themo Fisher Scientific</td>
			<td>R415</td>
			<td>To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (nonionic surfactant)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td>Detergent used to gently permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (emulsifying reagent)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Increases the binding specificity of the added antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin (F-8)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9989&#160;</td>
			<td>To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14700</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td>Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors

الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) هي مصدر خلايا التكاثري خاص بالمريض يمكن أن يفرق في أي نوع من الخلايا الجسدية. وقد استمدت من كل من الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة الخلايا الجذعية المتعددة القوى، التي يمكن أن تفرق في أنواع الخلايا اللازمة لتجميع الأوعية الدموية الناضجة والوظيفية. ومع ذلك، لم يتم تقييم هذه الخلايا بدقة في بيئات ثلاثية الأبعاد، ولا يزال المقياس الكمي لإمكاناتها الأوعية الدموية بعيد المنال. هنا، يتم أولاً تحديد توليد وعزل iPSC-EPs عن طريق فرز الخلايا الفلورية المنشطة، تليها وصف للتغليف وثقافة iPSC-EPs في هيدروجيلات الكولاجين. هذه المصفوفة خارج الخلية (ECM) -محاكاة البيئة الدقيقة تشجع على استجابة الأوعية الدموية قوية; شبكات الأوعية الدموية تشكل بعد أسبوع من الثقافة. ويتم تحديد إنشاء خط أنابيب حسابي يستخدم برمجيات مفتوحة المصدر لتحديد كمية هذه الاستجابة الأوعية الدموية. تم تصميم خط الأنابيب هذا خصيصًا للحفاظ على البنية ثلاثية الجوانب للشبكة الشعرية لتحديد عدد الفروع ونقاط التفرع وطول الشبكة الإجمالي مع الحد الأدنى من مدخلات المستخدم.

بعد التمايز (الشكل1)،FACS وتغليف iPSC-EPs في هيدروجيلات الكولاجين، وسوف تبقى الخلايا عادة تقريب لمدة 24 ساعة قبل البدء في الهجرة وتشكيل التجويف الأولي. بعد حوالي 6 أيام من الثقافة، سوف تكون الضفيرة الشعرية البدائية مرئية فيهيدروجيل عندما ينظر إل...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors at JoVE.com

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

الذرية البطانية المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSC-EPs) لديها القدرة على إحداث ثورة في علاجات أمراض القلب والأوعية الدموية وتمكين خلق نماذج أكثر إخلاصا لأمراض القلب والأوعية الدموية. هنا، يتم وصف تغليف iPSC-EPs في البيئات الدقيقة الكولاجين ثلاثية الأبعاد (3D) وتحليل كمي للإمكانات الأوعية الدموية لهذه الخلايا.

نموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر وخط أنابيب حسابي لتحديد الإمكانات الأوعية الدموية لالذرية البطانية المشتقة من iPSC

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

بروتوكول لدينا تمكن رؤى فريدة من نوعها في آليات مستوى الأنسجة الجزيئية والجملة من vasculogenesis التي قد تساعد في هندسة vasculature وظيفية لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية في النمذجة. يسمح هذا البروتوكول بإنشاء شبكات الأوعية الدموية القوية ثلاثية الأبعاد لتقييم الإمكانات الوعائية لمختلف المنصات ، كما يوفر خط أنابيب حسابي مفتوح المصدر المجاني لتحليل طبولوجيا الشبكة النهائية. تبدأ بإضافة 250 ميكروليتريس من حل انفصال الخلية في بئر من ثقافة الخلية D5D6 متمايزة لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، استخدم نصيحة P1000 ماصة لفك الخلايا في تعليق خلية واحدة. تجمع حلول الخلية في أنبوب مخروطي واحد 15 ملليلتر للطرد المركزي. نحن تعليق بيليه في 200 ميكرولترات من الجليد الباردة فرز العازلة وتسمية الخلايا مع خمسة microliters من الأجسام المضادة CD34 مترافق الفلوروستين المركزة لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا في خمسة mililitres من الجليد الباردة فرز العازلة. تصفية التعليق من خلال 40 ميكرومتر صب مصفاة في خمس ملليلتر الفلوريسنس تنشيط فرز الخلايا، أو FACS، أنبوب. قبل تشغيل العينة، فرز مرة واحدة 10 من الخلايا غير المصنفة الرابعة على مقياس النسل، يسور منطقة في شدة الفلوريسين عالية التي لا تحتوي على أي من الخلايا غير المصنفة لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي.ثم فرز العينة المسماة تحتوي على السلف البطانية المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات استناداً إلى تعبيرها CD34 عالية. في نهاية هذا النوع، نقل الخلايا السلف البطانية إلى أنبوب microcentrifuge للطرد المركزي. لكولاجين التغليف الهيدروجيل من الخلايا السلف، ونحن تعليق بيليه الخلية فرزها في 200 ميكرولتر من النمو Endothelial المتوسطة 2، تستكمل مع 10 ميكروميلتر من المانع روك Y-27632.إضافة الخلايا إلى 400 ميكرولترات من متوسطة البذر في أنبوب microcentrifuge 1.8 mililiter على الجليد. مزيج 350 ميكرولترات من الكولاجين في تعليق الخلية. الحل سيصبح أصفر شاحب.بعد ذلك، اخلط عشرة ميكرولترات من هيدروكسيد الصوديوم 1-مولر في محلول الكولاجين والخلايا. الحل سيصبح الآن وردي مشرق. Pipette 56 ميكرولترات من هذا حل خلية الكولاجين تحييد في الآبار الفردية من 96 جيدا مرفق منخفضة جدا U-القاع خلية لوحة الثقافة لاحتضان 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، فحص الآبار تحت المجهر الميداني مشرق للتأكد من أن الخلايا قد تم توزيعها بالتساوي. ثم إضافة 100 ميكرولتررس من النمو Endothelial إعدادها حديثا متوسط 2، تستكمل مع المانع روك وعائي عامل النمو البطانية لكل بئر والعودة لوحة إلى الحاضنة 37 درجة مئوية. بعد أسبوع واحد من الثقافة، إضافة 250 ميكرولترات من 4٪ شبهformaldehyde إلى بئر واحد من 48 لوحة جيدا لكل هيدروجيل وإزالة المتوسطة من الهيدروجيل.ثم استخدم ملاقط ذات رؤوس دقيقة لنقل الهيدروجيل إلى شبه شكلي يحتوي على آبار. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وغسل بسرعة الهيدروجيل مع برنامج تلفزيوني و permeabilize الثقافات ثلاثية الأبعاد مع 250 ميكرولترات من 0.5٪ غير الأيونية السطحي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الهيدروجيل مع اثنين من غسل خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع 250 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، وتستكمل مع 300 ملليلتر الجليسين في الغسيل، تليها الغمر من كل هيدروجيل في 250 ميكرولترات من العازلة سد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.تسمية الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة المخففة في عازلة سد بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية, تليها اثنين من يغسل في 0.5٪ مستحلب الكاشف وبرنامج تلفزيوني دولبيككو. بعد الغسيل الثاني، تسمية الخلايا مع الأنواع المناسبة الأجسام المضادة الثانوية محددة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء، قبل غسل الثقافات ثلاثية الأبعاد مرتين في 0.5٪ مستحلب الكاشف وبرنامج تلفزيوني دولبيكو، كما هو موضح. لتصور نواة الخلية، إضافة DAPI، مخففة في تركيز واحد إلى 10000 في برنامج تلفزيوني للعينات لاحتضان لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، تليها اثنين من يغسل في 0.5٪ مستحلب كاشف وبرنامج تلفزيوني دولبيكو.ثم استخدم ملاقط ذات رؤوس دقيقة لنقل كل عينة إلى وعاء عرض مناسب. بعد التمايز والفرز والتغليف في هيدروجيلات الكولاجين، والخلايا عادة ما تبقى مقربة لمدة 24 ساعة، قبل البدء في الهجرة وتشكيل التجويف الأولي. بعد حوالي ستة أيام من الثقافة ، ستكون الضفيرة الشعرية البدائية مرئية في الهيدروجيل عندما ينظر إليها مع المجهر الميدانية الزاهية.بعد تصوير الهيدروجيلات الثابتة والملطخة والمثقلة بالخلايا على مجهر confocal ، يتم تحويل الصور المعالجة مسبقًا إلى هيكل عظمي يمكّن من تحليل الطول الإجمالي والاتصال بالشبكة. من الضروري إضافة المضادات الحيوية بعد FACS ، حيث يصعب تعقيم الجزء الداخلي من هذا الجهاز ، وإزالة المضادات الحيوية بعد 24 ساعة من تغليف الخلايا. باستخدام هذه التقنية، تمكنا من تحديد الخصائص الفيزيائية والكيميائية التي تحاكي المصفوفة غير الخلوية المواد الحيوية التي تتحكم في الإمكانات الوعائية للنسل endothelial المشتقة من iPSC.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق<em&gt; في فيفو</em&gt; و<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

تطوير<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لتقييم مقلص وظيفة الخلايا الجذعية الوسيطة التي خضعت طلائي-الوسيطة الانتقالية

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

في المختبر وفي النماذج الحية لدراسة الانتقال القرنية غشائي-الوسيطة

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

وجه التفريق بين فروعه المكونة للدم البدائي والنهائي من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

جيل المستمدة IPSC-Organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات النمو العصبي في وقت مبكر

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

والرزن ثقافة المشارك خاتم الابهري: أداة ملائمة تقييم إمكانات الأوعية الوسيطة Stromal الخلايا في المختبر

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

هندسة أنسجة القرنية: في المختبر نموذجا للتفاعلات Stromal العصب القرنية البشرية

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

دمج بيريسيتيس حبة غشائي خلية نبتت الإنزيم

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...