Name: an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors
Uploaded: 2019-05-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af American Heart Association (tilskudsnummer 15SDG25740035, tildelt J.Z.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) af National Institutes of Health (tilskudsnummer EB007507, tildelt C.C.), og Alliancen for regenerativ rehabiliterings forskning & uddannelse (AR3T, Grant nummer 1 P2C HD086843-01, tildelt J.Z.). Vi vil gerne anerkende Prof. Jeanne Stachowiak (University of Texas i Austin) for hendes tekniske rådgivning om confokal mikroskopi. Vi er også taknemmelige for diskussioner med Samuel Mihelic (University of Texas i Austin), Dr. Alicia Allen (University of Texas at Austin), Dr. Julie Rytlewski (adaptive Biotech), og Dr. Leon Bellan (Vanderbilt University) for deres indsigt i beregningsmæssige analyse af 3D-netværk. Endelig takker vi Dr. Xiaoping Bao (University of California, Berkeley) for hans råd om differentiering iPSCs i iPSC-EPs.

1. forberedelse af kultur medier og belægnings opløsninger
<ol><li>For at tilberede vitronectin-belægnings opløsningen fortyndes vitronectin 1:100 i Dulbecco's fosfat-bufferet saltvand (DPBS). Forsigtig: når det er fortyndet, anbefales det ikke at opbevare denne løsning til fremtidig brug.</li>
	<li>Ved modtagelse af phenolfri vækstfaktor-reduceret gelatinøs protein blanding (Se tabel over materialer) fra producenten, tø på is ved 4 °c, indtil blandingen er gennemsigtig og flydende. Hvis ...

<ol>
	<li>Wang, K., Lin, R. -. Z., Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+human+vascular+networks:+trends+and+directions+in+endothelial+and+perivascular+cell+sources.">Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).</li><li>Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+approaches+to+spatiotemporally+directing+angiogenesis+in+host+and+engineered+tissues.">Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues.</a> Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).</li><li>Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+for+therapeutic+angiogenic+materials.">Design principles for therapeutic angiogenic materials.</a> Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).</li><li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+cell+tube+formation+assay+on+basement+membrane+turns+20:+State+of+the+science+and+the+art.">The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art.</a> Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).</li><li>Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+potential+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+form+microvascular+networks+in+3D+cultures.">Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).</li><li>Nakatsu, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF121+and+VEGF165+regulate+blood+vessel+diameter+through+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+in+an+in+vitro+angiogenesis+model.">VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model.</a> Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).</li><li>Shamloo, A., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+density+mediates+polarization+and+lumen+formation+of+endothelial+sprouts+in+VEGF+gradients.">Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients.</a> Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+functional+microvascular+networks+with+human+mesenchymal+stem+cells+in+microfluidic+systems.">Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems.</a> Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+network+formation+of+vascular+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Kusuma, S., Shen, Y. -. I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+vascular+networks+from+human+pluripotent+stem+cells+in+a+synthetic+matrix.">Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).</li><li>Charwat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+limitations+of+microscopy+and+Raman+spectroscopy+for+live-cell+analysis+of+3D+cell+cultures.">Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures.</a> Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).</li><li>Holnthoner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+induce+vascular+tube+formation+of+outgrowth+endothelial+cells+in+a+fibrin+matrix.">Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).</li><li>Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+for+quantifying+angiogenesis+in+the+Matrigel+assay+in+vitro.">A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).</li><li>Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+image+quantification+as+a+new+morphometry+method+for+tissue+engineering.">Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).</li><li>Kerschnitzki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+osteocyte+network+correlates+with+bone+material+quality.">Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).</li><li>Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+endothelial+progenitor+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+Wnt+activation+under+defined+conditions.">Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions.</a> Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).</li><li>Crosby, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+vasculogenic+potential+of+iPSC-derived+endothelial+progenitors+in+collagen+hydrogels.">Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2019).</li><li>Li, C. H., Tam, P. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iterative+algorithm+for+minimum+cross+entropy+thresholding.">An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding.</a> Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).</li><li>Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+world+of+osteocytes:+Connectomics+of+the+lacuno-canalicular+network+in+bone.">The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone.</a> New Journal of Physics. 19 (7), (2017).</li><li>Crosby, C. O., Zoldan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+physical+cues+of+the+ECM+in+angiogenic+biomaterials.">Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials.</a> Regenerative Biomaterials. , (2019).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+extracellular+matrix+density+and+mesenchymal+stem+cells+on+neovascularization+in+vivo.">Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).</li><li>Ghajar, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+matrix+density+on+the+regulation+of+3-D+capillary+morphogenesis.">The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).</li><li>Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+human+microvessels+formed+in+3D+fibrin+gel+by+constraint+of+gel+contraction.">Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction.</a> Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li></ol>

Denne protokol omfatter den langsigtede kultur af celler i tre typer af cellekultur medier: E8, LaSR basal, og EGM-2. Derfor bør man være meget forsigtig med at sterilisere alle materialer korrekt. Derudover bør laboratorie frakker og ethanol-rengjorte handsker altid bæres, når de arbejder i laboratoriets laminar flow hætte. Det anbefales ofte at teste for Mycoplasma kontaminering; Hvis der observeres en stor mængde snavs under iPSC-kulturen eller et pludseligt fald i differentierings effektiviteten, er Mycoplasma...

Humane navle formede vene endotelceller (HUVECs) og andre primære endotelcelle typer er blevet udnyttet i to årtier til model blodkar spiring og udvikling in vitro1. Sådanne vaskulære platforme lover at belyse molekylære og vævs-niveau mekanismer af hjerte-kar-sygdom og kan præsentere fysiologisk indsigt i udviklingen af primitive vaskulære netværk2,3. Selvom feltet af vaskulær modellering har været vidne til betydelige fremskridt, en "guld standard" assay, der kan kvantitativt model og vurdere fysiologiske vaskulære udvikling forbliver undvigende. De fleste offentliggjorte protokoller ikke i tilstrækkelig grad rekapitulere den vaskulære niche til at fremme dannelsen af modne, funktionelle blodkar eller ikke har en metode til kvantitativt at sammenligne vasculogenic potentiale af de vurderede celletyper i tre dimensioner ( 3D).
Mange nuværende vaskulære modeller er begrænset i deres evne til at efterligne den fysiologiske vaskulære niche. En af de mest almindeligt anvendte in vitro-platforme er den gelatinøse protein blandings baserede rørdannelses analyse. Kort, HUVECs er seedet som enkeltceller på et tyndt lag af gel, der består af proteiner høstet fra murine sarkom ekstracellulær matrix (ECM); inden for en til to dage, HUVECs selv samles i primitive rør4. Denne proces forekommer dog i to dimensioner (2D), og endotelcellerne (ECs), der anvendes i denne analyse, danner ikke indesluttet, hule lumen og begrænser derved den fysiologiske betydning af disse undersøgelser. For nylig er ECs og understøttende celler (f. eks. mesenchymal stamceller (MSCS) og pericytes) blevet Co-dyrket i 3D-mikromiljøer, der simulerer den lokale ECM-fiber arkitektur, såsom kollagen eller fibrin silicagelrogeler5. At modellere vaskulære udvikling i dette mikromiljø, polymere perler belagt med ECs er typisk ansat6. Tilføjelsen af eksogene vækstfaktorer og/eller vækstfaktorer udskillet af andre celler interstitielt indlejret i hydrogel kan inducere ECs, belægning af polymere perler, at spire og danne enkelt lumen; antallet og diameteren af spirer og fartøjer kan derefter beregnes. Men disse spirer er ental og ikke danner en lukket, forbundet netværk som ses i fysiologiske forhold og dermed er mere minder om en tumor Vaskulaturen model. Microfluidic enheder er også blevet udnyttet til at efterligne den vaskulære niche og til at fremme dannelsen af Vaskulaturen i EC-laden silicagelrogeler7,8. Typisk påføres en angiogen vækstfaktor-gradient på det cirkulerende cellekulturmedium for at inducere EF-migration og spiring. ECs, der udgør lumen af udviklede fartøjer er følsomme over for forskydnings stress induceret af anvendelsen af fluid flow gennem mikrofluidisk enhed; således, disse mikrofluidisk enheder fange vigtige fysiologiske parametre, der ikke er tilgængelige i de statiske modeller. Men, disse enheder kræver dyre mikrofabrikation evner.
Vigtigst af alt, alle tre vaskulære modeller (2D, 3D, microfluidic) overvældende udnytte primære ECs samt primære understøttende celletyper. Primære celler kan ikke udvikles til en effektiv kardiovaskulær behandling, fordi cellerne vil skabe en immunrespons ved implantation; Desuden er Huvec'er og lignende primære celletyper ikke patientspecifikke og indfanger ikke vaskulære abnormaliteter, der forekommer hos patienter med genetisk disposition eller allerede eksisterende helbredstilstande, f. eks. Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er dukket op i det seneste årti som en patientspecifik, proliferativ celle kilde, der kan differentieres i alle somatiske celler i den menneskelige krop9. Navnlig er der offentliggjort protokoller, som skitserer dannelse og isolering af iPSC-afledte endotelorer (iPSC-EPs)10,11; iPSC-EPs er bipotent og kan derfor være yderligere differentieret i endotelceller og glatte muskelceller/pericytes, byggestenene i moden, funktionel vaskulatur. Kun én undersøgelse har overbevisende beskrevet udviklingen af en primær kapillar plexus fra iPSC-EPs i et 3D-mikromiljø12; selv om denne undersøgelse er afgørende for en forståelse af iPSC-EP forsamling og differentiering i naturlige og syntetiske hydrogels, det ikke kvantitativt sammenligne nettopologier af den resulterende Vaskulaturen. En anden nylig undersøgelse har brugt den polymere perle model til at sammenligne spiring af HUVECs og iPSC-afledte ECs5. Derfor er der et klart behov for yderligere at belyse de fysiske og kemiske signalerings mekanismer, der regulerer iPSC-EP vasculogenesis i 3D-mikromiljøer, og for at afgøre, om disse celler egner sig til iskæmisk behandling og Kardiovaskulær sygdom Modellering.
I det seneste årti, forskellige open-source beregningsmæssige pipelines og skeletonization algoritmer er blevet udviklet til at kvantificere og sammenligne vaskulære netværk længde og tilslutningsmuligheder. For eksempel, charwat et al. udviklet en Photoshop-baserede pipeline til at udtrække en filtreret, binarized billede af vaskulære netværk afledt af en co-kultur af Adipose-afledte stamceller og udvækst ECs i en fibrin matrix13,14. Måske den mest udbredte topologi sammenligning værktøj er AngioTool, et program offentliggjort online af National Cancer Institute15; på trods af programmets udbredte vedtagelse og veldokumenteret troskab, programmet er begrænset til at analysere fartøj-lignende strukturer i to dimensioner og andre programmer, herunder AngioSys og Wimasis, deler den samme dimensionalitet begrænsning16. Kraftfulde software suiter som Imaris, Lucis og Metamorph er blevet udviklet til at analysere netværkstopologien af manipuleret mikrovaskulatur; men disse suiter er cost-prohibitive for de fleste akademiske laboratorier og begrænse adgangen til kildekoden, som kan hæmme muligheden for slutbrugeren til at tilpasse algoritmen til deres specifikke anvendelse. 3D slicer, en open source magnetisk resonans imaging/computertomografi pakke, indeholder en vaskulær modellering Toolkit, der effektivt kan analysere topologi af 3D vaskulære netværk17; Men, analysen er afhængig af brugeren manuelt placere slutpunkter af netværket, som kan blive kedelig, når du analyserer et stort datasæt og kan påvirkes af brugerens underbevidste bias. I dette manuskript er en beregnings pipeline, der kan kvantificere 3D-vaskulære netværk, beskrevet i detaljer. For at overvinde de ovenfor skitserede begrænsninger, bruger denne open source Computational pipeline ImageJ til at forbehandle erhvervede confokale billeder for at indlæse 3D-volumen i en skelet analysator. Skelet analysatoren bruger en parallel mediale-akse udtynding algoritme, og blev oprindeligt udviklet af Kerschnitzki et al. at analysere længden og forbindelsen af osteocyte Networks18; denne algoritme kan effektivt anvendes til at karakterisere længden og konnektivitet af manipuleret microvasculature.
I alt, denne protokol skitserer oprettelsen af microvaskulære netværk i 3D mikromiljøer og giver en open-source og User-bias gratis Computational pipeline til let sammenligne vasculogenic potentiale af iPSC-EPs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td>Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>The base media for iPSC-EP differentiation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50136165</td>
			<td>Water purification system; others can be readily substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A8412</td>
			<td>To preserve cell viability when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE, human (clone: AC136)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-140</td>
			<td>Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>C-6556</td>
			<td>Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg</td>
			<td>VWR</td>
			<td>354249</td>
			<td>Main component of the 3D microenvironment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes (15/50 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D/A</td>
			<td>Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>To counterstain and visualize cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320-082</td>
			<td>For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>To wash monolayer cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008</td>
			<td>For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td>Promotes endothelial cell viability and proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001&#160;&#160;</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,BioUltra, for molecular biology, &#62;=99.0% (NT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>Neutralizes remaining detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,&#62;=95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>Component of iPSC-EP differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>1.8.0_152</td>
			<td>Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>356231</td>
			<td>Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1825015</td>
			<td>Used to balance final hydrogel osmolarity and pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Stores small volumes of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>The main ingredient of the immunostaining solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td>Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine phalloidin</td>
			<td>Themo Fisher Scientific</td>
			<td>R415</td>
			<td>To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (nonionic surfactant)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td>Detergent used to gently permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (emulsifying reagent)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Increases the binding specificity of the added antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin (F-8)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9989&#160;</td>
			<td>To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14700</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td>Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors

Inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er en patientspecifik, proliferativ celle kilde, der kan differentiere sig til enhver somatisk celletype. Bipotente endotheliale progenitorer (EPs), som kan differentiere sig i de celletyper, der er nødvendige for at samle moden, funktionel vaskulatur, er afledt af både embryonale og inducerede pluripotente stamceller. Men, disse celler er ikke blevet nøje evalueret i tredimensionale miljøer, og en kvantitativ måling af deres vasculogenic potentiale forbliver undvigende. Her er generering og isolering af iPSC-EPs via fluorescerende aktiveret celle sortering først skitseret, efterfulgt af en beskrivelse af indkapsling og kultur af iPSC-EPs i kollagen hydrogels. Dette ekstracellulære matrix (ECM)-mimicking mikromiljø tilskynder en robust vasculogenic respons; vaskulære netværk danner efter en uges kultur. Oprettelsen af en beregningsmæssige pipeline, der udnytter open source-software til at kvantificere denne vasculogenic respons er afgrænset. Denne rørledning er specielt designet til at bevare den 3D-arkitektur af kapillar plexus til robust at identificere antallet af grene, forgrenings punkter, og den samlede netværks længde med minimal brugerinput.

Efter differentiering (figur 1), facer og indkapsling af IPSC-EPS i kollagen hydrogels, cellerne vil typisk forblive afrundet til 24 h før du begynder at migrere og danne indledende lumen. Efter ca. 6 dages kultur vil en primitiv kapillær plexus være synlig i hydrogel, når den ses med lysfelt mikroskopi (figur 2). Efter at have afbildet de faste, farvede, celle belastede silicagelrogeler på et confokalt mikroskop (fi...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors at JoVE.com

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Endotheliale progenitorer afledt af inducerede pluripotente stamceller (iPSC-EPs) har potentialet til at revolutionere kardiovaskulære sygdoms behandlinger og gøre det muligt at skabe mere trofaste kardiovaskulære sygdomsmodeller. Heri beskrives indkapsling af iPSC-EPs i tredimensionale (3D) kollagenmikromiljøer og en kvantitativ analyse af disse cellers vasculogeniske potentiale.

En in vitro 3D-model og beregnings ledning til kvantificering af det Vasculogeniske potentiale af iPSC-afledte Endotelafprogenitorer

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Vores protokol giver unik indsigt i de molekylære og bulkvæv niveau mekanismer vaskculogenesis, der kan støtte i den tekniske funktionelle vaskulatur for hjerte-kar-sygdom terapi i modellering. Denne protokol gør det muligt at skabe robuste, tre-dimensionelle vaskulære netværk til evaluering af det vaskulære potentiale af forskellige platforme, og giver også en gratis, open source beregningsmæssige pipeline til analyse af det endelige netværk topologi. Begynd med at tilføje 250 mikroliter celleløsning pr. brønd af D5D6 differentieret cellekultur i 10 minutter ved 37 grader Celsius.Ved slutningen af inkubationen skal du bruge en P1000-pipettespids til at adskille cellerne i enkeltcellesuspensioner. Pool celleopløsningerne i et enkelt 15 milliliter konisk rør til centrifugering. Vi suspenderer pellet i 200 mikroliter af iskold sortering buffer og mærke cellerne med fem mikroliter af koncentreret fluorescens konjugeret CD34 antistof i 10 minutter ved fire grader Celsius.Ved slutningen af inkubationen vaskes cellerne i fem mililiter af iskold sorteringsbuffer. Suspensionen filtreres gennem en 40 mikrometer hæld si i en fem milliliter fluorescens aktiveret cellesortering, eller FACS, rør. Før prøven køres, sorteres én gange 10 af de fjerde ikke-mærkede celler på fluocitometeret, hvor en region gating med en høj fluorescensintensitet, der ikke indeholder nogen af de umærkede celler, der kan fungere som den negative kontrol.Sorter derefter den mærkede prøve indeholder endotelprogenitorer, der stammer fra inducerede pluripotente stamceller baseret på deres høje CD34-udtryk. Ved slutningen af den slags overføres endotelprogenecellerne til et mikrocentrifugerør til centrifugering. For kollagen hydrogel indkapsling af progenitorcellerne suspenderer vi den sorterede cellepellet i 200 mikroliter af endotelvækstmedium 2 suppleret med 10 mikromiliter af ROCK-inhibitoren Y-27632.Tilsæt cellerne til 400 mikroliter af såning medium i en 1,8 mililiter mikrocentrifuge rør på is. Bland 350 mikroliter af kollagen i cellesuspensionen. Opløsningen bliver lysegul.Dernæst blandes ti mikroliter af 1-Muller natriumhydroxid i kollagen og celleopløsning. Løsningen vil nu blive lyserød. Pipette 56 mikroliter af denne neutraliserede kollagencelleopløsning i individuelle brønde af en 96 brønd ultra-lav vedhæftet fil U-bund cellekulturplade til en 30-minutters inkubation ved 37 grader Celsius.I slutningen af inkubationen skal du undersøge brøndene under et lyst feltmikroskop for at kontrollere, at cellerne er jævnt fordelt. Derefter tilsættes 100 mikroliter frisklavet endotelvækst medium 2, suppleret med ROCK-inhibitor og vaskulær endotelvækstfaktor til hver brønd og returnere pladen til 37 grader Celsius inkubator. Efter en uges kultur, tilsæt 250 mikroliter af 4% paraformaldehyd til en brønd af en 48 brøndplade pr hydrogel og fjern mediet fra hydrogels.Brug derefter fint tippede pincet til at overføre hydrogels til paraformaldehyd, der indeholder brønde. Efter 10 minutter ved stuetemperatur vaskes hydrogelerne hurtigt med PBS og permeabilisere 3D-kulturerne med 250 mikroliter af et 0,5% ikke-ionisk overfladeaktivt stof i fem minutter ved stuetemperatur. Hydrogelerne vaskes med to fem minutters vaske ved stuetemperatur med 250 mikroliter PBS suppleret med 300 milliliterglycin pr. vask efterfulgt af nedsænkning af hver hydrogel i 250 mikroliter blokerende buffer i 30 minutter ved stuetemperatur.Mærke cellerne med de relevante primære antistoffer fortyndet i blokerende buffer natten over ved fire grader Celsius, efterfulgt af to vaske i 0,5% emulgerende reagens og Dulbecco's PBS. Efter den anden vask mærkes cellerne med det relevante artsspecifikke sekundære antistof i to timer ved stuetemperatur beskyttet mod lys, før 3D-kulturerne vaskes to gange i 0,5% emulgerende reagens og Dulbeccos PBS, som påvist. For at visualisere cellekernerne tilsættes DAPI, der fortyndes med en 1-10000 koncentration i PBS, til prøverne i to minutters inkubation ved stuetemperatur efterfulgt af to vaske i 0,5% emulgerende reagens og Dulbeccos PBS.Brug derefter en pincet med fint spidse ord til at overføre hver prøve til et passende synskar. Efter differentiering, sortering og indkapsling i kollagen hydrogels, vil cellerne typisk forblive afrundet i 24 timer, før du begynder at migrere og danne indledende lumen. Efter ca. seks dages kultur vil en primitiv kapillær plexus være synlig i hydrogelen, når den ses med lys feltmikroskopi.Efter billeddannelse af faste, farvede, cellebelæssede hydrogels på et konfokal mikroskop konverteres de forbearbejdede billeder til et skelet, som muliggør en analyse af netværkets samlede længde og forbindelse. Det er bydende nødvendigt at tilføje antibiotika efter FACS, som sterilisering det indre af dette instrument er vanskeligt, og at fjerne antibiotika 24 timer efter celle indkapsling. Ved hjælp af denne teknik, vi var i stand til at afgøre, hvilke fysiske og kemiske egenskaber ekstracellulære matrix efterligne biomaterialer styre det vaskulogene potentiale i iPSC-afledte afledte endotel forfædre.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering af tymisk Bundfældning Progenitorer i Mouse Embryo Brug<em&gt; In vivo</em&gt; Og<em&gt; In vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Udvikling af et<em&gt; In vitro</em&gt; Assay til Evaluer kontraktionsfunktion af mesenchvmal-celler der undergik Epithelial-Mesenchymal Overgangseffekter

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In vitro og in vivo modeller til at studere hornhindeendothel-mesenkymale Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Instrueret differentiering af Primitive og endelige hæmatopoietisk ophav fra humane pluripotente stamceller

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generation af iPSC-afledte menneskelige hjerne organoider til Model Tidlig forstyrrelser i nervesystemets

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Aorta Ring Co kultur Assay: Et praktisk værktøj til at vurdere angiogene af mesenchymale stromale celler In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Hornhindevæv Engineering: En In Vitro Model af den menneskelige hornhinden stromale-nerve interaktioner

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Indarbejde Pericytes i en endotel celle perle spiring Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation af stillads-fri, tre-dimensionelle Insulin udtrykker Pancreatoids fra mus i bugspytkirtlen stamfaderen In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...