Name: an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors
Uploaded: 2019-05-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (Grant-Nummer 15SDG25740035, an J.Z.), dem National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) der National Institutes of Health (Grant-Nummer EB007507, vergeben an C.C.) und die Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T, Grant Nummer 1 P2C HD086843-01, an J.Z.) verliehen. Wir möchten Prof. Jeanne Stachowiak (University of Texas at Austin) für ihre technische Beratung zur konfokalen Mikroskopie danken. Wir sind auch dankbar für Gespräche mit Samuel Mihelic (The University of Texas at Austin), Dr. Alicia Allen (The University of Texas at Austin), Dr. Julie Rytlewski (Adaptive Biotech) und Dr. Leon Bellan (Vanderbilt University) für ihre Einblicke in die Berechnungsanalyse von 3D-Netzwerken. Abschließend danken wir Dr. Xiaoping Bao (University of California, Berkeley) für seinen Rat, iPSCs in iPSC-EPs zu differenzieren.

1. Vorbereitung von Kulturmedien und Beschichtungslösungen
<ol><li>Zur Herstellung einer vitronectin-Beschichtungslösung ist vitronectin 1:100 in der phosphatgepufferten Saline (DPBS) von Dulbecco verdünnt. VORSICHT: Nach der Verdünnung wird nicht empfohlen, diese Lösung für die zukünftige Verwendung zu speichern.</li>
	<li>Bei Aufnahme von phenolrot-frei, Wachstumsfaktor-reduzierten gelatinösen Protein-Mischung (siehe Tabelle der Materialien) vom Hersteller, tauen auf Eis bei 4 °C, bis die...

<ol>
	<li>Wang, K., Lin, R. -. Z., Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+human+vascular+networks:+trends+and+directions+in+endothelial+and+perivascular+cell+sources.">Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).</li><li>Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+approaches+to+spatiotemporally+directing+angiogenesis+in+host+and+engineered+tissues.">Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues.</a> Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).</li><li>Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF121+and+VEGF165+regulate+blood+vessel+diameter+through+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+in+an+in+vitro+angiogenesis+model.">VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model.</a> Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).</li><li>Shamloo, A., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+density+mediates+polarization+and+lumen+formation+of+endothelial+sprouts+in+VEGF+gradients.">Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients.</a> Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+functional+microvascular+networks+with+human+mesenchymal+stem+cells+in+microfluidic+systems.">Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems.</a> Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+network+formation+of+vascular+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Kusuma, S., Shen, Y. -. I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+vascular+networks+from+human+pluripotent+stem+cells+in+a+synthetic+matrix.">Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).</li><li>Charwat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+limitations+of+microscopy+and+Raman+spectroscopy+for+live-cell+analysis+of+3D+cell+cultures.">Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures.</a> Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).</li><li>Holnthoner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+induce+vascular+tube+formation+of+outgrowth+endothelial+cells+in+a+fibrin+matrix.">Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).</li><li>Khoo, C. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iterative+algorithm+for+minimum+cross+entropy+thresholding.">An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding.</a> Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).</li><li>Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+world+of+osteocytes:+Connectomics+of+the+lacuno-canalicular+network+in+bone.">The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone.</a> New Journal of Physics. 19 (7), (2017).</li><li>Crosby, C. O., Zoldan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+physical+cues+of+the+ECM+in+angiogenic+biomaterials.">Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials.</a> Regenerative Biomaterials. , (2019).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+extracellular+matrix+density+and+mesenchymal+stem+cells+on+neovascularization+in+vivo.">Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).</li><li>Ghajar, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+matrix+density+on+the+regulation+of+3-D+capillary+morphogenesis.">The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).</li><li>Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+human+microvessels+formed+in+3D+fibrin+gel+by+constraint+of+gel+contraction.">Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction.</a> Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li></ol>

Dieses Protokoll bezieht die langfristige Zellkultur in drei Arten von Zellkulturmedien ein: E8, LaSR Basal und EGM-2. Daher sollte sehr darauf geachtet werden, alle Materialien angemessen zu sterilisieren. Darüber hinaus sollten Labormäntel und ethanolgereinigte Handschuhe immer getragen werden, wenn sie in der laminaren Durchflusshaube des Labors arbeiten. Es wird empfohlen, häufig auf Mykoplasmenkontamination zu testen; Wenn während der iPSC-Kultur eine große Menge an Schmutz beobachtet wird oder ein plötzlicher...

Menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) und andere primäre Endothelzelltypen werden seit zwei Jahrzehnten verwendet, um das Keimen von Blutgefäßen und die Entwicklung in vitro1zu modellieren. Solche Gefäßplattformen versprechen, molekulare und Gewebe-Level-Mechanismen von Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu beleuchten und können physiologische Einblicke in die Entwicklung von primitiven Gefäßnetzwerken darstellen2,3. Obwohl das Gebiet der vaskulären Modellierung erhebliche Fortschritte gemacht hat, bleibt ein "Goldstandard"-Assay, der die physiologische Gefäßentwicklung quantitativ modellieren und bewerten kann, schwer fassbar. Die meisten veröffentlichten Protokolle rekapitulieren die vaskuläre Nische nicht angemessen, um die Bildung reifer, funktioneller Blutgefäße zu fördern, oder verfügen nicht über eine Methode, um das vaskulogene Potenzial der untersuchten Zelltypen quantitativ in drei Dimensionen zu vergleichen ( 3D).
Viele aktuelle Vaskuläre Sind in ihrer Fähigkeit, die physiologische Vaskuläre Nische nachzuahmen, begrenzt. Eine der am häufigsten eingesetzten In-vitro-Plattformen ist der gelatinöse Protein-Gemisch-basierte Rohrbildungstest. Kurz gesagt, HUVECs werden als einzelne Zellen auf einer dünnen Gelschicht gesät, die aus Proteinen besteht, die aus der extrazellulären Matrix des murinen Sarkoms (ECM) geerntet werden; innerhalb von ein bis zwei Tagen bauen sich die HUVECs selbst in primitive Rohre4zusammen. Dieser Prozess findet jedoch in zwei Dimensionen (2D) statt und die in diesem Test verwendeten Endothelzellen (ECs) bilden keine geschlossenen, hohlen Lumen, wodurch die physiologische Bedeutung dieser Studien eingeschränkt wird. In jüngerer Zeit wurden ECs und unterstützende Zellen (z. B. mesenchymale Stammzellen (MSCs) und Pericyte) in 3D-Mikroumgebungen mitkultiviert, die die faserige Architektur des nativen ECM simulieren, wie Kollagen oder Fibrinhydrogele5. Um die Gefäßentwicklung in dieser Mikroumgebung zu modellieren, werden in der Regel mit ECs beschichtete Polymerperlen verwendet6. Die Zugabe von exogenen Wachstumsfaktoren und/oder Wachstumsfaktoren, die von anderen Zellen, die interstitiell in das Hydrogel eingebettet sind, sezerniert werden, kann die ECs, die die polymeren Perlen beschichten, dazu veranlassen, zu sprießen und ein einziges Lumen zu bilden; Die Anzahl und der Durchmesser von Sprossen und Gefäßen können dann berechnet werden. Diese Sprossen sind jedoch einzigartig und bilden kein geschlossenes, vernetztes Netzwerk, wie es bei physiologischen Bedingungen zu beobachten ist, und erinnern daher eher an ein Tumorvaskulaturmodell. Mikrofluidische Geräte wurden auch verwendet, um die vaskuläre Nische nachzuahmen und die Bildung von Vaskulatur in EC-beladenen Hydrogelen7,8zu fördern. Typischerweise wird ein angiogener Wachstumsfaktor-Gradient auf das zirkulierende Zellkulturmedium angewendet, um DIE MIGRATION und das Keimen der EG zu induzieren. ECs, die das Lumen der entwickelten Gefäße bilden, reagieren empfindlich auf die Scherspannung, die durch die Anwendung des Flüssigkeitsflusses durch die mikrofluidische Vorrichtung verursacht wird; Daher erfassen diese mikrofluidischen Geräte wichtige physiologische Parameter, die in den statischen Modellen nicht zugänglich sind. Diese Geräte erfordern jedoch kostspielige Mikrofertigungsfähigkeiten.
Am wichtigsten ist, dass alle drei Vaskulärenmodelle (2D, 3D, mikrofluidic) überwiegend primäre ECs sowie primäre unterstützende Zelltypen nutzen. Primärzellen können nicht zu einer wirksamen kardiovaskulären Therapie entwickelt werden, da die Zellen bei der Implantation eine Immunantwort hervorrufen würden; Darüber hinaus sind HUVECs und ähnliche primäre Zelltypen nicht patientenspezifisch und erfassen keine Gefäßanomalien, die bei Patienten mit einer genetischen Disposition oder bereits bestehenden Gesundheitlichen Erkrankungen auftreten, z. B. Diabetes mellitus. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) haben sich in den letzten zehn Jahren als patientenspezifische, proliferative Zellquelle herauskristallisiert, die in alle somatischen Zellen im menschlichen Körper unterschieden werden kann9. Insbesondere wurden Protokolle veröffentlicht, die die Erzeugung und Isolierung von iPSC-abgeleiteten endotheliale Vorläuferitoren (iPSC-EPs)10,11beschreiben; iPSC-EPs sind bipotent und lassen sich daher weiter in Endothelzellen und glatte Muskelzellen/Pericyten, die Bausteine einer reifen, funktionellen Vaskulatur, differenzieren. Nur eine Studie hat die Entwicklung eines primären Kapillarplexus aus iPSC-EPs in einer 3D-Mikroumgebung überzeugend detailliert beschrieben12; Obwohl diese Studie für das Verständnis der iPSC-EP-Montage und Differenzierung in natürlichen und synthetischen Hydrogelen von entscheidender Bedeutung ist, wurden die Netzwerktopologien der resultierenden Vaskulatur nicht quantitativ verglichen. Eine weitere aktuelle Studie hat das Polymerperlenmodell verwendet, um das Keimen von HUVECs und iPSC-abgeleiteten ECs5zu vergleichen. Daher besteht die klare Notwendigkeit, die physikalischen und chemischen Signalmechanismen, die die iPSC-EP-Vaskulogenese in 3D-Mikroumgebungen regulieren, weiter aufzuklären und festzustellen, ob diese Zellen für ischämische Therapien und Herz-Kreislauf-Erkrankungen geeignet sind. Modellierung.
In den letzten zehn Jahren wurden verschiedene Open-Source-Rechenpipelines und Skelettierungsalgorithmen entwickelt, um die Länge und Konnektivität von vaskulären Netzwerken zu quantifizieren und zu vergleichen. Zum Beispiel entwickelten Charwat et al. eine Photoshop-basierte Pipeline, um ein gefiltertes, binarisiertes Bild von Gefäßnetzwerken zu extrahieren, das aus einer Kokultur von adipose-abgeleiteten Stammzellen und Auswuchs-ECs in einer Fibrin-Matrix13,14abgeleitet wurde. Das vielleicht am weitesten verbreitete Topologie-Vergleichstool ist AngioTool, ein Programm, das online vom National Cancer Institute15veröffentlicht wurde; trotz der weit verbreiteten Akzeptanz und gut dokumentierten Treue des Programms beschränkt sich das Programm auf die Analyse von schiffsähnlichen Strukturen in zwei Dimensionen und andere Programme, einschließlich AngioSys und Wimasis, teilen die gleiche Maßeinheitsbeschränkung16. Leistungsstarke Software-Suiten wie Imaris, Lucis und Metamorph wurden entwickelt, um die Netzwerktopologie der technischen Mikrovaskulatur zu analysieren; Diese Suiten sind jedoch für die meisten akademischen Labors kostenprohibitiv und beschränken den Zugriff auf den Quellcode, was die Fähigkeit des Endbenutzers, den Algorithmus an seine spezifische Anwendung anzupassen, behindern kann. 3D Slicer, ein Open-Source-Magnetresonanztomographie/Computertomographie-Paket, enthält ein Vascular Modeling Toolkit, das die Topologie von 3D-Gefäßnetzwerken effektiv analysieren kann17; Die Analyse hängt jedoch davon ab, dass der Benutzer die Endpunkte des Netzwerks manuell platziert, was bei der Analyse eines großen Datasets mühsam werden kann und durch die unbewussten Verzerrungen des Benutzers beeinflusst werden kann. In diesem Manuskript wird eine Rechnerpipeline beschrieben, die 3D-Gefäßnetzwerke quantifizieren kann. Um die oben beschriebenen Einschränkungen zu überwinden, verwendet diese Open-Source-Rechenpipeline ImageJ, um erfasste konfokale Bilder vorab zu verarbeiten, um das 3D-Volumen in einen Skelettanalysator zu laden. Der Skelettanalysator verwendet einen parallelen medialen Achsenausdünnungsalgorithmus und wurde ursprünglich von Kerschnitzki et al. entwickelt, um die Länge und Konnektivität von Osteozytennetzwerken zu analysieren18; Dieser Algorithmus kann effektiv angewendet werden, um die Länge und Konnektivität der technischen Mikrovaskulatur zu charakterisieren.
Insgesamt skizziert dieses Protokoll die Schaffung mikrovaskulärer Netzwerke in 3D-Mikroumgebungen und bietet eine Open-Source- und Benutzer-Bias-freie Rechenpipeline, um das vaskulogene Potenzial von iPSC-EPs leicht zu vergleichen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td>Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>The base media for iPSC-EP differentiation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50136165</td>
			<td>Water purification system; others can be readily substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A8412</td>
			<td>To preserve cell viability when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE, human (clone: AC136)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-140</td>
			<td>Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>C-6556</td>
			<td>Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg</td>
			<td>VWR</td>
			<td>354249</td>
			<td>Main component of the 3D microenvironment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes (15/50 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D/A</td>
			<td>Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>To counterstain and visualize cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320-082</td>
			<td>For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>To wash monolayer cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008</td>
			<td>For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td>Promotes endothelial cell viability and proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001&#160;&#160;</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,BioUltra, for molecular biology, &#62;=99.0% (NT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>Neutralizes remaining detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,&#62;=95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>Component of iPSC-EP differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>1.8.0_152</td>
			<td>Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>356231</td>
			<td>Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1825015</td>
			<td>Used to balance final hydrogel osmolarity and pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Stores small volumes of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>The main ingredient of the immunostaining solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td>Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine phalloidin</td>
			<td>Themo Fisher Scientific</td>
			<td>R415</td>
			<td>To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (nonionic surfactant)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td>Detergent used to gently permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (emulsifying reagent)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Increases the binding specificity of the added antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin (F-8)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9989&#160;</td>
			<td>To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14700</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td>Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) sind eine patientenspezifische, proliferative Zellquelle, die sich in jeden somatischen Zelltyp differenzieren kann. Bipotente endotheliale Vorläufer (EPs), die sich in die Zelltypen differenzieren können, die für die Zusammenbau einer reifen, funktionellen Vaskulatur erforderlich sind, wurden sowohl aus embryonalen als auch aus induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet. Diese Zellen wurden jedoch in dreidimensionalen Umgebungen nicht streng evaluiert, und ein quantitatives Maß ihres vaskulogenen Potenzials bleibt schwer fassbar. Hier beiderin skizziert die Erzeugung und Isolierung von iPSC-EPs über fluoreszierend aktivierte Zellsortierung, gefolgt von einer Beschreibung der Verkapselung und Kultur von iPSC-EPs in Kollagenhydrogelen. Diese extrazelluläre Matrix (ECM)-mimitierende Mikroumgebung fördert eine robuste vaskulogene Reaktion; Gefäßnetzwerke bilden sich nach einer Woche Kultur. Die Erstellung einer Rechenpipeline, die Open-Source-Software verwendet, um diese vaskulogene Reaktion zu quantifizieren, wird abgegrenzt. Diese Pipeline wurde speziell entwickelt, um die 3D-Architektur des Kapillarplexus beizubehalten, um die Anzahl der Verzweigungen, Verzweigungspunkte und die gesamte Netzwerklänge mit minimaler Benutzereingabe robust zu identifizieren.

Nach der Differenzierung (Abbildung1), FACS und Verkapselung von iPSC-EPs in Kollagenhydrogelen bleiben die Zellen in der Regel 24 h gerundet, bevor sie mit der Migration beginnen und erste Lumen bilden. Nach ca. 6 Tagen Kultur wird ein primitiver Kapillarplexus im Hydrogel sichtbar sein, wenn er mit der Hellfeldmikroskopie betrachtet wird (Abbildung 2). Nach der Abbildung der fixierten, mit Zell beladenen Hydrogele auf einem kon...

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An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Endotheliale Vorläufer, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC-EPs) gewonnen werden, haben das Potenzial, Herz-Kreislauf-Behandlungen zu revolutionieren und die Schaffung von originalgetreueren Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu ermöglichen. Dabei werden die Verkapselung von iPSC-EPs in dreidimensionalen (3D) Kollagen-Mikroumgebungen und eine quantitative Analyse des vaskulogenen Potenzials dieser Zellen beschrieben.

Ein In-Vitro-3D-Modell und eine Computational Pipeline zur Quantifizierung des vaskulogenen Potenzials von iPSC-derived endotheliaalen Vorläufern

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Unser Protokoll ermöglicht einzigartige Einblicke in die molekularen und Massengewebe-Level-Mechanismen der Vaskulogenese, die bei der technischen funktionellen Vaskulatur für die Therapie von Herz-Kreislauf-Erkrankungen bei der Modellierung helfen können. Dieses Protokoll ermöglicht die Schaffung robuster, dreidimensionaler Gefäßnetzwerke zur Bewertung des vaskulogenen Potenzials verschiedener Plattformen und bietet auch eine kostenlose, Open-Source-Rechenpipeline für die Analyse der endgültigen Netzwerktopologie. Beginnen Sie mit 250 Mikroliter Zellablösung pro Bohrung der D5D6 differenzierten Zellkultur für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius.Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine P1000 Pipettenspitze, um die Zellen in einzellige Suspensionen zu dissoziieren. Bündeln Sie die Zelllösungen in einem einzigen 15 Milliliter konischen Rohr für die Zentrifugation. Wir setzen das Pellet in 200 Mikrolitere eiskaltes Sortierpuffer aus und beschriften die Zellen mit fünf Mikrolitern konzentrierter Fluoreszenz konjugierter CD34-Antikörper für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Am Ende der Inkubation die Zellen in fünf Millilitere eiskalte sortierende Puffer waschen. Filtern Sie die Suspension durch ein 40 Mikrometer gegossenes Sieb in ein fünf Milliliter Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieroder oder FACS-Rohr. Vor dem Ausführen der Probe ein mal 10. der vierten nicht beschrifteten Zellen auf dem Fluocitometer sortieren, einen Bereich mit einer hohen Fluoreszenzintensität, die keine der nicht beschrifteten Zellen enthält, um als negative Kontrolle zu dienen.Sortieren Sie dann die beschriftete Probe enthalten endotheliale Vorläufer, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen auf der Grundlage ihrer hohen CD34-Expression abgeleitet wurden. Am Ende der Sortierung die endotheliale Vorläuferzellen zur Zentrifugation in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Für die Kollagen-Hydrogelverkapselung der Vorläuferzellen setzen wir das sortierte Zellpellet in 200 Mikroliteren Endotheliaal Growth Medium 2 aus, ergänzt durch 10 Mikroliter des ROCK-Hemmers Y-27632.Fügen Sie die Zellen zu 400 Mikrolitern Sämedium in einem 1,8-Milliliter Mikrozentrifugenrohr auf Eis hinzu. Mischen Sie 350 Mikroliter Kollagen in die Zellsuspension. Die Lösung wird blassgelb.Als nächstes mischen Sie zehn Mikroliter 1-Muller Natriumhydroxid in die Kollagen- und Zelllösung. Die Lösung wird nun leuchtend rosa. Pipette 56 Mikroliter dieser neutralisierten Kollagenzelllösung in einzelne Brunnen einer 96 gut ultra-niedrigen Befestigung U-Boden-Zellkulturplatte für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius.Am Ende der Inkubation untersuchen Sie die Brunnen unter einem hellfeldmikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellen gleichmäßig verteilt wurden. Dann fügen Sie 100 Mikroliter frisch zubereiteten Endotheliaal Growth Medium 2, ergänzt mit ROCK Inhibitor und Vascular Endothelial Growth Factor, zu jedem Brunnen und geben Sie die Platte auf den 37 Grad Celsius Inkubator zurück. Nach einer Woche Kultur 250 Mikroliter 4%Paraformaldehyd in einen Brunnen einer 48-Well-Platte pro Hydrogel geben und das Medium aus den Hydrogelen entfernen.Dann verwenden Sie eine feingekippte Pinzette, um die Hydrogele auf die paraformaldehydhaltigen Brunnen zu übertragen. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur die Hydrogele schnell mit PBS waschen und die 3D-Kulturen mit 250 Mikrolitern eines 0,5% nichtionischen Tensids bei Raumtemperatur fünf Minuten lang durchdringen. Waschen Sie die Hydrogele mit zwei fünfminütigen Waschungen bei Raumtemperatur mit 250 Mikroliter PBS, ergänzt mit 300 Milliliter Glycin pro Waschgang, gefolgt vom Eintauchen jedes Hydrogels in 250 Mikroliter Sperrpuffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur.Beschriften Sie die Zellen mit den entsprechenden primärantikörpern, die über Nacht bei vier Grad Celsius im Blockierpuffer verdünnt werden, gefolgt von zwei Waschungen in 0,5% emulgierendem Reagenz und Dulbeccos PBS. Nach der zweiten Wäsche die Zellen zwei Stunden lang bei Lichtschutz mit dem entsprechenden artspezifischen Sekundärantikörper kennzeichnen, bevor Sie die 3D-Kulturen zweimal in 0,5% emulgierendem Reagenz und Dulbeccos PBS waschen, wie gezeigt. Um die Zellkerne zu visualisieren, fügen Sie DAPI hinzu, die mit einer Konzentration von 1 bis 10000 in PBS zu den Proben für eine zweiminütige Inkubation bei Raumtemperatur verdünnt wird, gefolgt von zwei Waschungen in 0,5% emulgierendem Reagenz und Dulbeccos PBS.Verwenden Sie dann eine feingekippte Pinzette, um jede Probe auf ein geeignetes Sichtgefäß zu übertragen. Nach Differenzierung, Sortierung und Verkapselung in Kollagenhydrogelen bleiben die Zellen in der Regel 24 Stunden lang gerundet, bevor sie zu migrieren beginnen und erste Lumen bilden. Nach etwa sechs Tagen Kultur wird ein primitiver Kapillarplexus im Hydrogel sichtbar sein, wenn er mit heller Feldmikroskopie betrachtet wird.Nach der Abbildung der fixierten, gefärbten, zellbeladenen Hydrogele auf einem konfokalen Mikroskop werden die vorverarbeiteten Bilder in ein Skelett umgewandelt, das eine Analyse der Gesamtlänge und Konnektivität des Netzwerks ermöglicht. Es ist zwingend notwendig, Antibiotika nach FACS hinzuzufügen, da die Sterilisation des Inneren dieses Instruments schwierig ist, und die Antibiotika 24 Stunden nach der Zellverkapselung zu entfernen. Mit dieser Technik konnten wir bestimmen, welche physikalischen und chemischen Eigenschaften extrazelluläre Matrix imitiert Biomaterialien das vaskulogene Potenzial von iPSC-abgeleiteten endotheliale Vorläufern iPSC-abgeleiteten Vorläufern steuern.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Assay Kontraktionsfunktion von mesenchymalen Zellen, die Unterzog Epithelial-mesenchymale Transition zur Bewertung

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

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In vitro und in vivo Modelle Corneal Endothelial-mesenchymale Transition zu studieren

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Die Erzeugung von iPS-derived Human Brain Organoide auf Modell Frühe Störungen der neurologischen Entwicklung

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Die Aorta Ring Kokultur Assay: Ein komfortables Werkzeug, um angiogenen Potenzial des mesenchymaler Stromazellen Zellen In Vitro zu bewerten

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Hornhautgewebe Engineering: Eine In-vitro- Modell der Stromazellen Nerv Interaktionen der menschlichen Hornhaut

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Einbeziehung der Perizyten in einem Endothelzellen Korn sprießen Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...