Name: an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors
Uploaded: 2019-05-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי איגוד הלב האמריקני (מענק מספר 15SDG25740035, הוענק J.Z.), המכון הלאומי לדימות ביו-רפואי ו Bioהנדסאים (NIBIB) של המוסדות הלאומיים לבריאות (גרנט מספר EB007507, הוענק סיסי), ו הברית למחקר שיקום משובי & הדרכה (AR3T, גרנט מספר 1 P2C HD086843-01, הוענק J.Z.). ברצוני להכיר בפרופ ' ז'אן סטצ'ויאק (אוניברסיטת טקסס באוסטין) לעצתה הטכנית במיקרוסקופיה. אנחנו גם אסירי תודה על דיונים עם סמואל Mihelic (אוניברסיטת טקסס באוסטין), ד ר אלישיה אלן (אוניברסיטת טקסס באוסטין), ד ר ג ' ולי Rytlewski (ביוטכנולוגיה מסתגלת), וד ר ליאון Bellan (אוניברסיטת ואנדרבילט) על התובנה שלהם על אנליזה חישובית של רשתות תלת-מימד. לבסוף, אנו מודים לדר ' שיאופינג באו (אוניברסיטת קליפורניה בברקלי) על עצתו להבדיל iPSCs לתוך iPSC-EPs.

1. הכנת מדיה תרבותית ופתרונות ציפויים
<ol><li>כדי להכין הפתרון ציפוי vitronectin, לדלל vitronectin 1:100 ב מלוחים פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS). התראה: לאחר דילול, לא מומלץ לאחסן פתרון זה לשימוש עתידי.</li>
	<li>עם קבלת פנול חינם אדום, גורם גדילה-מופחת תערובת חלבון ז'לטין (ראה שולחן חומרים) מהיצרן, להפשיר על...

<ol>
	<li>Wang, K., Lin, R. -. Z., Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+human+vascular+networks:+trends+and+directions+in+endothelial+and+perivascular+cell+sources.">Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).</li><li>Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+approaches+to+spatiotemporally+directing+angiogenesis+in+host+and+engineered+tissues.">Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues.</a> Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).</li><li>Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+for+therapeutic+angiogenic+materials.">Design principles for therapeutic angiogenic materials.</a> Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).</li><li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+cell+tube+formation+assay+on+basement+membrane+turns+20:+State+of+the+science+and+the+art.">The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art.</a> Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).</li><li>Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+potential+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+form+microvascular+networks+in+3D+cultures.">Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).</li><li>Nakatsu, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF121+and+VEGF165+regulate+blood+vessel+diameter+through+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+in+an+in+vitro+angiogenesis+model.">VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model.</a> Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).</li><li>Shamloo, A., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+density+mediates+polarization+and+lumen+formation+of+endothelial+sprouts+in+VEGF+gradients.">Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients.</a> Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+functional+microvascular+networks+with+human+mesenchymal+stem+cells+in+microfluidic+systems.">Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems.</a> Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+network+formation+of+vascular+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Kusuma, S., Shen, Y. -. I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+vascular+networks+from+human+pluripotent+stem+cells+in+a+synthetic+matrix.">Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).</li><li>Charwat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+limitations+of+microscopy+and+Raman+spectroscopy+for+live-cell+analysis+of+3D+cell+cultures.">Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures.</a> Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).</li><li>Holnthoner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+induce+vascular+tube+formation+of+outgrowth+endothelial+cells+in+a+fibrin+matrix.">Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).</li><li>Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+for+quantifying+angiogenesis+in+the+Matrigel+assay+in+vitro.">A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).</li><li>Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+image+quantification+as+a+new+morphometry+method+for+tissue+engineering.">Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).</li><li>Kerschnitzki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+osteocyte+network+correlates+with+bone+material+quality.">Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).</li><li>Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+endothelial+progenitor+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+Wnt+activation+under+defined+conditions.">Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions.</a> Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).</li><li>Crosby, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+vasculogenic+potential+of+iPSC-derived+endothelial+progenitors+in+collagen+hydrogels.">Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2019).</li><li>Li, C. H., Tam, P. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iterative+algorithm+for+minimum+cross+entropy+thresholding.">An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding.</a> Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).</li><li>Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+world+of+osteocytes:+Connectomics+of+the+lacuno-canalicular+network+in+bone.">The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone.</a> New Journal of Physics. 19 (7), (2017).</li><li>Crosby, C. O., Zoldan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+physical+cues+of+the+ECM+in+angiogenic+biomaterials.">Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials.</a> Regenerative Biomaterials. , (2019).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+extracellular+matrix+density+and+mesenchymal+stem+cells+on+neovascularization+in+vivo.">Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).</li><li>Ghajar, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+matrix+density+on+the+regulation+of+3-D+capillary+morphogenesis.">The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).</li><li>Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+human+microvessels+formed+in+3D+fibrin+gel+by+constraint+of+gel+contraction.">Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction.</a> Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li></ol>

פרוטוקול זה כולל את התרבות הארוכת טווח של תאים בשלושה סוגים של מדיית תרבות התא: E8, LaSR בסיס ו-EGM-2. לכן יש לנקוט בזהירות רבה כדי לעקר את כל החומרים. בנוסף, מעילי מעבדה וכפפות שעברו ניקוי אתנול צריכים תמיד להיות שחוקים כשעובדים במכסה הזרימה המבינארי של המעבדה. מומלץ לבדוק לעתים קרובות לזיהום mycop...

וריד הטבור האנושי בתאי הטבורי (HUVECs) וסוגים אחרים של תאים אנדותל הראשי כבר מנוצל במשך שני עשורים לדגמן כלי דם לבלוב ופיתוח בתוך מבחנה1. פלטפורמות כלי דם כאלה להבטיח להאיר מולקולרית ברמת רקמות מנגנונים של מחלות לב וכלי דם והוא עשוי להציג תובנה פיזיולוגית לתוך פיתוח של רשתות כלי דם פרימיטיביים2,3. למרות שהשדה של מידול כלי הדם הגיע עד להתקדמות משמעותית, שיטת "תקן זהב" שיכולה לכמת את המודל ולהעריך את ההתפתחות הפיזיולוגית של כלי הדם, נותרה חמקנית. רוב הפרוטוקולים שפורסמו אינם מתפקדים כראוי את הנישה של כלי הדם כדי לעודד היווצרות של כלי דם בוגרים ופונקציונליים או שיטה להשוות את הפוטנציאל הגלום בסוגי התאים המוערך בשלושה מימדים ( 3D).
מודלים רבים של כלי הדם הנוכחיים מוגבלים ביכולתם לחקות את הנישה הפיזיולוגית של כלי הדם. אחד הנפוצים ביותר בפלטפורמות מבחנה הוא חלבון ז'לטין מבוססי תערובת היווצרות שפופרת. בקצרה, HUVECs הם הזרע כמו תאים בודדים על שכבה דקה של ג'ל המורכב של חלבונים שנקטפו מתוך מיטין סרקומה מורתתאי (ECM); בתוך אחד עד יומיים, HUVECs להרכיב את עצמו לתוך צינורות פרימיטיביים4. עם זאת, תהליך זה מתרחש בשני מימדים (2D) ובתאי האנדותל (ECs) הנמצאים בשימוש באותו שיטת הפעולה אינם יוצרים מוקפים, חלולים לומן, ובכך מגבילים את המשמעות הפיזיולוגית של מחקרים אלה. לאחרונה, ECs ותאים תומכים (g., תאי גזע mesenchymal (MSCs) ו קרום הלב) כבר שיתוף תרבותי במיקרו מיקרוסביבות 3D המדמים את הארכיטקטורה הסיבי של ECS יליד, כגון קולגן או פיברוב הידרוג'ל5. כדי לדגמן פיתוח כלי דם מיקרוסביבה זו, חרוזים פולימריים מצופה ECs מועסקים בדרך כלל6. התוספת של גורמי צמיחה אקסוגני ו/או גורמי גדילה מופרש על ידי תאים אחרים interstitially מוטבע הידרוג'ל יכול לגרום ECs, ציפוי חרוזים פולימריים, כדי נבט וטופס לומן יחיד; המספר והקוטר של נבטים והכלים יכולים להיות מחושבים. עם זאת, נבטים אלה הם באופן ייחודי ולא יוצרים רשת סגורה, מחובר כפי שהוא נראה בתנאים פיסיולוגיים ולכן הוא מזכיר יותר מודל הגידול של המודל. התקנים מיקרופלואידים מנוצלים גם כדי לחקות את נישה כלי הדם ולקדם את היווצרות ואצלב ב-EC-לאדן הידרוג'ל7,8. בדרך כלל, גורם גידול אנגיוגנטי-מעבר הדרגתי מוחל על בינונית תרבות התא מחזורי כדי לגרום הגירה EC ולבלוב. ECs המהווים לומן של כלי מפותח רגישים למתח ההטיה הנגרמת על ידי יישום של זרימת הנוזלים דרך המכשיר microfluidic; לכן, מכשירים אלה microflu, התקנים מיקרופלואידים ללכוד פרמטרים פיזיולוגיים מפתח כי הם לא נגישים במודלים סטטיים. עם זאת, התקנים אלה דורשים יכולות מיקרו-ייצור יקרות.
והכי חשוב, כל שלושת מודלים כלי הדם (2D, 3D, microfluidic) להשתמש באופן גורף ECs הראשי, כמו גם הראשי התומך בסוגי תאים. לא ניתן לפתח תאים ראשוניים לטיפול קרדיווסקולרי אפקטיבי, כי התאים היו לעורר תגובה חיסונית על השרשה; יתר על כן, HUVECs וסוג התאים הראשוניים דומים אינם מסוימים המטופל ולא ללכוד חריגות כלי הדם המתרחשים בחולים עם מתכונת גנטית או מראש קיים תנאי הבריאות, למשל, סוכרת. המושרה בתאי גזע פלאוריטי (iPSCs) התפתחה בעשור האחרון כמו מקור מטופל ספציפי, המקור התא מתרבים כי ניתן לבדיל את כל התאים הסומטיים בגוף האדם9. בפרט, הפרוטוקולים פורסמו כי המתאר את הדור והבידוד של iPSC הנגזר ושלתי (iPSC-EPs)10,11; iPSC-EPs הם בעלי עוצמה והוא יכול, ולכן, להיות מובחנת עוד לתוך תאים אנדותל ותאי שריר חלקה/קרום הלב, אבני הבניין של בוגרת, פונקציונלי תפקודית. רק מחקר אחד יש מפורט משכנעת את הפיתוח של מקלעת נימי העיקרי מ-iPSC-EPs ב מיקרוסביבה 3D12; למרות שמחקר זה הוא קריטי להבנת ההרכבה iPSC-EP ובידול טבעי וסינתטי הידרוג, זה לא להשוות את טופולוגיות הרשת של המערכת המתקבלת. עוד מחקר שנערך לאחרונה השתמש במודל חרוז פולימרי כדי להשוות את הנביטה של HUVECs ו-iPSC-נגזר ECs5. לכן, יש צורך ברור נוסף להבהיר את מנגנוני האיתות הפיזיים והכימיים לווסת iPSC-EP vasculogenesis בסביבות מיקרו 3D וכדי לקבוע אם תאים אלה מתאימים לטיפול איסכמי ומחלות לב וכלי דם דוגמנות.
בעשור האחרון, קווים שונים של מקור פתוח ואלגוריתמים השלד הינם מפותחים לכמת ולהשוות את אורך הרשת והקישוריות של כלי הדם. לדוגמה, charwat ואח ' פיתח צינור מבוסס פוטושופ כדי לחלץ תמונה מסוננת, בינארית של רשתות כלי דם נגזר תרבות שיתוף של תאי גזע נגזר של אדיפוז ו-ecs הצמיחה של מטריצה הפיטין13,14. אולי הכלי הנפוץ ביותר להשוואת הטופולוגיה הוא אנגיוtool, תוכנית שפורסמה באינטרנט על ידי המכון הלאומי לסרטן15; למרות אימוץ נרחב של התוכנית נאמנות מתועדת היטב, התוכנית מוגבלת לניתוח מבנים כמו כלי בשני ממדים ותוכניות אחרות, כולל AngioSys ו Wimasis, לשתף את אותה הגבלה מימדי16. חבילות תוכנה רבות עוצמה כגון Imaris אריס, לוסיא והתמרה פותחו כדי לנתח את טופולוגיית הרשת של מיקרובילטורה מהונדסים; עם זאת, סוויטות אלה הן מעלות עבור מעבדות אקדמיות ביותר ולהגביל את הגישה לקוד המקור, אשר עשוי לעכב את היכולת של משתמש הקצה להתאים את האלגוריתם ליישום הספציפי שלהם. 3D מבצעה, מקור פתוח דימות תהודה מגנטית/חבילת טומוגרפיה ממוחשבת, מכיל ערכת מידול כלי דם שיכול לנתח ביעילות את הטופולוגיה של רשתות 3D כלי דם17; עם זאת, הניתוח תלוי במשתמש מציב ידנית את נקודות הקצה של הרשת, דבר העלול להיות מייגע בעת ניתוח ערכת נתונים גדולה ויכול להיות מושפע מהטיות התת-מודע של המשתמש. בכתב יד זה, צינור חישובית שיכול לכמת רשתות כלי דם 3D מתואר בפרוטרוט. כדי להתגבר על מגבלות הנ ל, זה צינור בחישוב מקור פתוח מנצל ImageJ כדי לעבד מראש התמונות מיקוד רכשה לטעון את נפח 3D לתוך מנתח שלד. מנתח השלד משתמש באלגוריתם מקביל של ציר דליל, והוא פותח במקור על ידי קרשניצקי ואח '. כדי לנתח את האורך והקישוריות של רשתות אוסטאופציט18; אלגוריתם זה ניתן להחיל באופן יעיל כדי לאפיין את האורך ואת הקישוריות של מיקרוקולטורה הנדסה.
בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר את היצירה של רשתות microvascular מיקרונימי בסביבות תלת-ממד, ומספק צינור חישוב מקור פתוח ומשתמש-הטיה בחינם כדי להשוות את הפוטנציאל vasculogenic של iPSC-EPs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td>Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>The base media for iPSC-EP differentiation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50136165</td>
			<td>Water purification system; others can be readily substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A8412</td>
			<td>To preserve cell viability when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE, human (clone: AC136)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-140</td>
			<td>Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>C-6556</td>
			<td>Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg</td>
			<td>VWR</td>
			<td>354249</td>
			<td>Main component of the 3D microenvironment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes (15/50 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D/A</td>
			<td>Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>To counterstain and visualize cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320-082</td>
			<td>For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>To wash monolayer cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008</td>
			<td>For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td>Promotes endothelial cell viability and proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001&#160;&#160;</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,BioUltra, for molecular biology, &#62;=99.0% (NT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>Neutralizes remaining detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,&#62;=95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>Component of iPSC-EP differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>1.8.0_152</td>
			<td>Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>356231</td>
			<td>Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1825015</td>
			<td>Used to balance final hydrogel osmolarity and pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Stores small volumes of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>The main ingredient of the immunostaining solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td>Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine phalloidin</td>
			<td>Themo Fisher Scientific</td>
			<td>R415</td>
			<td>To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (nonionic surfactant)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td>Detergent used to gently permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (emulsifying reagent)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Increases the binding specificity of the added antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin (F-8)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9989&#160;</td>
			<td>To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14700</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td>Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors

המושרה בתאי גזע פלוריטי (iPSCs) הם מקור ספציפי למטופל, תא שהתרבות שיכול להבדיל לכל סוג תא הסומטית. ביופוטנאל ושלתי (EPs), אשר יכול להבדיל בין סוגי התאים הדרושים כדי להרכיב בוגרת, פונקציונלית ולבלטורה, נגזר הן העובריים והמושרה תאים גזע pluripotent עם זאת, תאים אלה לא הוערכו בקפדנות בסביבות תלת ממדיות, ואת המדד הכמותי של הפוטנציאל הvas, שלהם נשאר חמקמק. כאן, הדור והבידוד של iPSC-EPs באמצעות מיון התא מופעל פלורסנט מתוארים תחילה, ואחריו תיאור של עטיפת ותרבות של iPSC-EPs ב קולגן הידרוג. מטריצה זו (ECM)-מחקה המיקרו-סביבה מעודדת תגובה חזקה ומרכזית; ליצור רשתות כלי דם לאחר שבוע של תרבות. יצירת צינור חישובית העושה שהוא משתמש בתוכנה מקור פתוח כדי לכמת את התגובה הזאת הוא התחום. צינור זה נועד במיוחד כדי לשמר את ארכיטקטורת 3d של מקלעת נימי כדי מכבש לזהות את מספר הענפים, נקודות הסתעפות, ואת אורך הרשת הכולל עם קלט משתמש מינימלי.

לאחר בידול (איור 1), facs ו כימוס של ipsc-EPs ב קולגן הידרוג'לים, התאים יישארו בדרך כלל מעוגל עבור 24 שעות לפני תחילת להגר וטופס הראשונית לומן. לאחר כשישה ימי תרבות, מקלעת נימי-המים הפרימיטיבית תהיה גלויה בהידרוג'ל כאשר היא מוצגת במיקרוסקופ ברייטפילד (אי...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors at JoVE.com

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

הושלתי האנדותל שנגזר מתאי גזע המושרה ביותר (iPSC-EPs) יש את הפוטנציאל לחולל מהפכה לטיפולי מחלות לב וכלי דם ולאפשר יצירת מודלים נאמנים יותר של מחלות לב וכלי דם. בזאת, כימוס של iPSC-EPs בתלת מימדי (3D) קולגן מיקרוסביבה וניתוח כמותי של הפוטנציאל הגלום בתאים אלה מתוארים.

מודל תלת מימד וצינור חישוב מתורבת לכמת את הפוטנציאל הוושלתי של iPSC-נגזר של התגובה האנטי-מגנטית

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר תובנות ייחודיות על מנגנוני רמת הרקמה המולקולרית והתפזורת של vasculogenesis שעשויים לסייע בכלי הדם התפקודיים ההנדסיים לטיפול במחלות לב וכלי דם במודלים. פרוטוקול זה מאפשר יצירת רשתות כלי דם תלת מימדיות חזקות להערכת הפוטנציאל האגרטלוגני של פלטפורמות שונות, וגם מספק צינור חישובי חופשי בקוד פתוח לניתוח טופולוגיית הרשת הסופית. התחל על ידי הוספת 250 microlitres של פתרון ניתוק תאים ל הבאר של תרבות התאים המובחנים D5D6 במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, השתמש בקצה פיפטה P1000 כדי לנתק את התאים לתוך מתלים של תא יחיד. בריכת פתרונות התא בצינור חרוט אחד 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה. אנחנו להשעות את גלולה ב 200 microliters של חיץ מיון קר קרח ולתייג את התאים עם חמישה microliters של נוגדן CD34 פלואורסצנטי מרוכז במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, לשטוף את התאים בחמישה mililitres של חיץ מיון קר קרח. לסנן את ההשעיה דרך 40 מיקרומטר לשפוך מסננת לתוך חמש מיליליטר פלואורסצנטיות מופעל מיון תאים, או FACS, צינור. לפני הפעלת המדגם, מיין פי 10 מהתאים הבלתי-חגורים הרביעיים על הפלוציטמטר, וגודר אזור בעוצמת פלואורסצנטיות גבוהה שאינה מכילה אף אחד מהתאים הבלתי מרוסנים שישמשו כשליטה שלילית.לאחר מכן מיין את המדגם שכותרתו מכילים אביהם אנדותל נגזר תאי גזע pluripotent המושרה בהתבסס על ביטוי CD34 הגבוה שלהם. בסוף המיון, להעביר את התאים הקדמונים progenitor לצינור microcentrifuge עבור צנטריפוגה. עבור אנקפסולציה הידרוג'ל קולגן של התאים הצאצאים, אנו להשעות את גלולת התא ממוין ב 200 microliters של צמיחה אנדותל בינוני 2, בתוספת 10 מיקרומיליטר של מעכבי רוק Y-27632.מוסיפים את התאים ל-400 מיקרוליטרים של מדיום זריעה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.8 מיליליטר על קרח. מערבבים 350 מיקרוליטרים של קולגן לתוך ההשעיה התא. הפתרון יהפוך לצהוב חיוור.לאחר מכן, מערבבים עשרה מיקרוליטרים של 1-מולר נתרן הידרוקסיד לתוך קולגן ותא פתרון. הפתרון יהפוך כעת לוורוד בוהק. פיפטה 56 microliters של פתרון זה תא קולגן מנוטרל לתוך בארות בודדות של 96 גם אולטרה נמוך מצורף U-התחתון תא תרבות צלחת עבור דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, לבחון את בארות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר כדי לבדוק כי התאים חולקו באופן שווה. לאחר מכן להוסיף 100 microliters של צמיחה אנדותל טרי מוכן בינוני 2, בתוספת מעכבי רוק וגורם גדילה אנדותל כלי דם לכל באר ולהחזיר את הצלחת אינקובטור 37 מעלות צלזיוס. לאחר שבוע של תרבות, הוסיפו 250 מיקרוליטרים של 4% פרפורמלדהיד ל הבאר אחת של צלחת של 48 בארות להידרוגל והסירו את המדיום מההידרוגלים.לאחר מכן השתמשו בטוונצ'רים עדינים כדי להעביר את ההידרוגלים לפרפורמלדהיד המכיל בארות. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, שטפו במהירות את ההידרוגלים עם PBS וחלחלו לתרבויות תלת-מיתיות עם 250 מיקרוליטרים של חומר שטח לא יוני של 0.5% למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הידרוג'ל עם שתי שטיפות חמש דקות בטמפרטורת החדר עם 250 microliters של PBS, בתוספת 300 גליצין מיליליטר לכל לשטוף, ואחריו טבילה של כל הידרוג'ל ב 250 microliters של חיץ חסימה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.סמן את התאים עם הנוגדנים העיקריים המתאימים מדוללים במאגר חסימה לילה בארבע מעלות צלזיוס, ואחריו שתי שטיפות ב 0.5% אמולסיה ריאגנט PBS של Dulbecco. לאחר הכביסה השנייה, סמן את התאים עם הנוגדן המשני הספציפי למין המתאים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור, לפני שטיפת התרבויות תלת-מיתיות פעמיים ב-0.5% אמולסיה של ריאגנט ו- PBS של Dulbecco, כפי שהוכח. כדי לדמיין את גרעיני התא, להוסיף DAPI, מדולל בריכוז של 1 עד 10000 PBS לדגימות לדגירה של שתי דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו שתי שטיפות ב 0.5% אמולסיה ריאגנט PBS של Dulbecco.לאחר מכן השתמשו בצופים עדינים כדי להעביר כל דגימה לכלי צפייה מתאים. לאחר התביור, המיון והאנקפסולציה בהידרוגלים של קולגן, התאים יישארו מעוגלים בדרך כלל למשך 24 שעות, לפני שיתחילו לנדוד ויתווצרי לומן ראשוני. לאחר כשישה ימים של תרבות, מקלעת נימי פרימיטיבי יהיה גלוי הידרוג'ל כאשר צפו עם מיקרוסקופ שדה בהיר.לאחר הדמיית הידרוג'לים קבועים, מוכתמים ועמוסי תאים במיקרוסקופ קונפוקלי, התמונות המעובדות מראש מומרות לשלד המאפשר ניתוח של האורך והקישוריות הכוללים של הרשת. זה הכרחי להוסיף אנטיביוטיקה לאחר FACS, כמו עיקור הפנים של מכשיר זה קשה, ולהסיר את האנטיביוטיקה 24 שעות לאחר אנקפסולציה התא. באמצעות טכניקה זו, הצלחנו לקבוע אילו מאפיינים פיזיקליים וכימיים מטריצה חוץ-תאית מחקה ביו-חומרים שולטים בפוטנציאל הווסקולוגני של שאבות אנדותל נגזרים שמקורם ב- iPSC.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

פיתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay לאבחון תפקוד התכווצות של תאי mesenchymal שעבר אפיתל-mesenchymal מעבר

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

הדור של Organoids Human Brain iPSC הנגזרות למודל הפרעה נוירו-התפתחותית מוקדמת

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

וזמינותו תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים: כלי נוח כדי להעריך את הפוטנציאל אנגיוגנזה של תאי סטרומה Mesenchymal במבחנה

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

הנדסת רקמות הקרנית: במבחנה מודל של אינטראקציות סטרומה-עצב של הקרנית האנושית

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

שילוב Pericytes חרוז תא אנדותל הלבלוב Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...