Name: an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors
Uploaded: 2019-05-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors at JoVE.com

यह काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान संख्या 15SDG25740035, जे.जेड.), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के जैव चिकित्सा इमेजिंग और बायोइंजीनियरिंग संस्थान (NIBIB) के लिए सम्मानित किया (अनुदान संख्या EB007507, सी.सी.) को सम्मानित किया गया), और पुनर्योजी पुनर्वास अनुसंधान और प्रशिक्षण के लिए एलायंस (AR3T, अनुदान संख्या 1 P2C HD086843-01, जे जेड को सम्मानित किया). हम प्रो Jeanne Stachowiak स्वीकार करना चाहते हैं (Austin में टेक्सास विश्वविद्यालय) confocal माइक्रोस्कोपी पर उसकी तकनीकी सलाह के लिए. हम भी शमूएल Mihelic के साथ विचार विमर्श के लिए आभारी हैं (आस्टिन में टेक्सास विश्वविद्यालय), डॉ एलिसिया एलन (आस्टिन में टेक्सास विश्वविद्यालय), डॉ जूली Rytlewski (अनुकूल बायोटेक), और डॉ लियोन Bellan (Vanderbilt विश्वविद्यालय) पर उनकी अंतर्दृष्टि के लिए 3 डी नेटवर्क की गणना विश्लेषण. अंत में, हम iPSC-EPs में iPSCs अलग करने पर उनकी सलाह के लिए डॉ Xiaoping Bao (कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, बर्कले) धन्यवाद.

1. संस्कृति मीडिया और कोटिंग समाधान की तैयारी
<ol><li>विट्रोनेक्टिन कोटिंग समाधान तैयार करने के लिए, दुलबिकको के फॉस्फेट-बफर्ड नमकीन (डीपीबीएस) में विट्रोनेक्टिन 1:100 को पतला करें। चेतावनी: एक बार पतला, यह भ?...

<ol>
	<li>Wang, K., Lin, R. -. Z., Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+human+vascular+networks:+trends+and+directions+in+endothelial+and+perivascular+cell+sources.">Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).</li><li>Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+approaches+to+spatiotemporally+directing+angiogenesis+in+host+and+engineered+tissues.">Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues.</a> Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).</li><li>Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+potential+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+form+microvascular+networks+in+3D+cultures.">Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).</li><li>Nakatsu, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF121+and+VEGF165+regulate+blood+vessel+diameter+through+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+in+an+in+vitro+angiogenesis+model.">VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model.</a> Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).</li><li>Shamloo, A., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+density+mediates+polarization+and+lumen+formation+of+endothelial+sprouts+in+VEGF+gradients.">Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients.</a> Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+functional+microvascular+networks+with+human+mesenchymal+stem+cells+in+microfluidic+systems.">Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems.</a> Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+network+formation+of+vascular+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Kusuma, S., Shen, Y. -. I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+vascular+networks+from+human+pluripotent+stem+cells+in+a+synthetic+matrix.">Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).</li><li>Charwat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+limitations+of+microscopy+and+Raman+spectroscopy+for+live-cell+analysis+of+3D+cell+cultures.">Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures.</a> Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).</li><li>Holnthoner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+induce+vascular+tube+formation+of+outgrowth+endothelial+cells+in+a+fibrin+matrix.">Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).</li><li>Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+for+quantifying+angiogenesis+in+the+Matrigel+assay+in+vitro.">A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).</li><li>Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. 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O., Zoldan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+physical+cues+of+the+ECM+in+angiogenic+biomaterials.">Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials.</a> Regenerative Biomaterials. , (2019).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. 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इस प्रोटोकॉल सेल संस्कृति मीडिया के तीन प्रकार में कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृति शामिल है: E8, LaSR बासल, और EGM-2. इसलिए, सभी सामग्रियों को उचित रूप से निष्फल करने के लिए बहुत सावधानी बरती जानी चाहिए। इसके अ?...

मानव नाभि शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) और अन्य प्राथमिक endothelial सेल प्रकार के लिए दो दशकों के लिए उपयोग किया गया है रक्त वाहिका अंकुरित और इन विट्रो1में विकास मॉडल . इस तरह के संवहनी प्लेटफार्मों हृदय रोग के आणविक और ऊतक स्तर के तंत्र रोशन करने के लिए वादा करता हूँ और आदिम संवहनी नेटवर्क2,3 के विकास में शारीरिक अंतर्दृष्टि पेश कर सकतेहैं. हालांकि संवहनी मॉडलिंग के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रगति देखी गई है, एक "सोने के मानक" परख कि मात्रात्मक मॉडल और शारीरिक संवहनी विकास का आकलन कर सकते हैं मायावी बनी हुई है. सबसे प्रकाशित प्रोटोकॉल पर्याप्त रूप से संवहनी आला rerecapulate परिपक्व के गठन को प्रोत्साहित नहीं करते, कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं या मात्र तीन आयामों में मूल्यांकन सेल प्रकार के vasculogenic क्षमता की तुलना करने के लिए एक विधि नहीं है ( 3 डी)।
कई वर्तमान संवहनी मॉडल शारीरिक संवहनी आला नकल करने की क्षमता में सीमित हैं. इनविट्रो प्लेटफार्मों में सबसे अधिक कार्यरत में से एक जिलेटिन प्रोटीन मिश्रण आधारित ट्यूब गठन परख है। संक्षेप में, HUVECs जेल की एक पतली परत पर एकल कोशिकाओं के रूप में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं कि murine सार्कोमा extracellular मैट्रिक्स (ECM) से काटा प्रोटीन के होते हैं; एक से दो दिनों के भीतर, HUVECs स्वयं आदिम ट्यूबों में इकट्ठा4. हालांकि, इस प्रक्रिया को दो-आयामों (2 डी) में होता है और इस परख में उपयोग किए गए एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) संलग्न, खोखले लुमेन नहीं बनाते हैं, जिससे इन अध्ययनों के शारीरिक महत्व को सीमित किया जा सकता है। हाल ही में, ईसी और सहायक कोशिकाओं (जैसे, mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) और pericytes) सह 3 डी microenvironments कि देशी ECM के रेशेदार वास्तुकला अनुकरण में संस्कृति है, ऐसे कोलेजन या फाइब्रिन hydrogels के रूप में5. इस सूक्ष्म पर्यावरण में संवहनी विकास को मॉडल करने के लिए, ईसी के साथ लेपित बहुलक मोती आमतौर पर6कार्यरत हैं। exogenous विकास कारकों और / या वृद्धि कारकों के अलावा अन्य कोशिकाओं interstitially hydrogel में एम्बेडेड द्वारा स्रावित ECs प्रेरित कर सकते हैं, बहुलक मोती कोटिंग, अंकुरित और एकल लुमेन फार्म; अंकुरित और जहाजों की संख्या और व्यास तो गणना की जा सकती है. हालांकि, इन अंकुरित विलक्षण हैं और एक संलग्न, जुड़े नेटवर्क के रूप में शारीरिक स्थितियों में देखा जाता है और इस तरह एक ट्यूमर vasculature मॉडल की अधिक याद ताजा करती है फार्म नहीं है. माइक्रोफ्लूइडी उपकरणों का उपयोग संवहनी आला की नकल करने और ईसी-ललित हाइड्रोजेल्स7,8 में वास्कुलचर के गठन को बढ़ावा देने के लिए भी किया गयाहै। आमतौर पर, ईसी प्रवास और अंकुरित करने के लिए घूम सेल संस्कृति माध्यम पर एक एंजियोजेनिक विकास कारक-ग्रेडिएंट लागू किया जाता है। विकसित जहाजों के लुमेन का गठन करने वाले ईसी माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस के माध्यम से तरल प्रवाह के आवेदन से प्रेरित कतरनी तनाव के प्रति संवेदनशील होते हैं; इस प्रकार, इन microfluidic उपकरणों महत्वपूर्ण शारीरिक पैरामीटर है कि स्थिर मॉडल में सुलभ नहीं हैं पर कब्जा. हालांकि, इन उपकरणों महंगा microfabrication क्षमताओं की आवश्यकता होती है.
सबसे महत्वपूर्ण बात, सभी तीन संवहनी मॉडल (2 डी, 3 डी, microfluidic) भारी प्राथमिक ईसी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्राथमिक समर्थन सेल प्रकार का उपयोग. प्राथमिक कोशिकाओं को एक प्रभावी हृदय चिकित्सा में विकसित नहीं किया जा सकता है क्योंकि कोशिकाओं प्रत्यारोपण पर एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा होता है; इसके अलावा, HUVECs और इसी तरह के प्राथमिक सेल प्रकार रोगी-विशिष्ट नहीं हैं और संवहनी असामान्यताओं है कि एक आनुवंशिक स्वभाव या पूर्व मौजूदा स्वास्थ्य स्थितियों के साथ रोगियों में पाए जाते हैं पर कब्जा नहीं है, उदा. प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) एक रोगी विशेष, proliferative सेल स्रोत है कि मानव शरीर9में सभी दैहिक कोशिकाओं में विभेदित किया जा सकता है के रूप में पिछले एक दशक में उभरा है. विशेष रूप से, प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गए हैं जो iPSC व्युत्पन्न एंडोथेलियल संतति (iPSC-EPs)10,11के उत्पादन और अलगाव की रूपरेखा प्रस्तुत करते हैं; iPSC-EPs द्वि-शक्तिमान हैं और इसलिए, एंडोथेलियल कोशिकाओं और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में और अधिक विभेदित किया जा सकता है/ केवल एक अध्ययन में 3 डी माइक्रोएमेंट 12 में आईपीएससी-ईपीएससे प्राथमिक केशिका जाल के विकास का विस्तृत विवरण दिया गया है; हालांकि यह अध्ययन iPSC-ईपी विधानसभा और प्राकृतिक और सिंथेटिक hydrogels में भेदभाव की समझ के लिए महत्वपूर्ण है, यह मात्रात्मक परिणामी vasculature के नेटवर्क topologies की तुलना नहीं किया. एक और हाल ही में एक अध्ययन polymeric मनका मॉडल का इस्तेमाल किया गया है HUVECs और iPSC व्युत्पन्न ईसी5के अंकुरित तुलना . इसलिए, भौतिक और रासायनिक संकेतन तंत्र को और अधिक स्पष्ट करने की आवश्यकता है जो 3 डी माइक्रोन्यूमेंशन में आईपीएससी-ईपी वास्कुलोजेनेसिस को विनियमित करता है और यह निर्धारित करने के लिए कि क्या ये कोशिकाएं इस्कीमिक थेरेपी और हृदय रोग के लिए उपयुक्त हैं या नहीं। मॉडलिंग.
पिछले दशक में, विभिन्न खुला स्रोत कम्प्यूटेशनल पाइपलाइनों और कंकाल एल्गोरिदम मात्रा और संवहनी नेटवर्क लंबाई और कनेक्टिविटी की तुलना करने के लिए विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए, Charwat एट अल एक फ़ोटोशॉप आधारित पाइप लाइन विकसित करने के लिए एक फ़िल्टर्ड, संवहनी नेटवर्क के binarized छवि वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं और एक फाइब्रिन मैट्रिक्स13,14में वृद्धि ECs के सह संस्कृति से व्युत्पन्न निकालने के लिए . शायद सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया टोपोलॉजी तुलना उपकरण AngioTool, एक राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा ऑनलाइन प्रकाशित कार्यक्रम15है; कार्यक्रम के व्यापक गोद लेने और अच्छी तरह से प्रलेखित निष्ठा के बावजूद, कार्यक्रम दो आयामों और AngioSys और Wimasis सहित अन्य कार्यक्रमों में पोत की तरह संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए सीमित है, एक ही आयामीता सीमा16का हिस्सा है. ऐसे Imaris, Lucis, और Metamorph के रूप में शक्तिशाली सॉफ्टवेयर सुइट्स इंजीनियर microvasculature के नेटवर्क टोपोलॉजी का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है; हालांकि, इन सुइट्स सबसे शैक्षिक प्रयोगशालाओं के लिए लागत-प्रतिषेधात्मक हैं और स्रोत कोड तक पहुंच को सीमित करते हैं, जो अंत-उपयोगकर्ता की क्षमता को अपने विशिष्ट आवेदन के लिए एल्गोरिथ्म को अनुकूलित करने में बाधा डाल सकते हैं। 3 डी स्लाइसर, एक खुला स्रोत चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग / computed टोमोग्राफी पैकेज, एक संवहनी मॉडलिंग टूलकिट है कि प्रभावी ढंग से 3 डी संवहनी नेटवर्क17के टोपोलॉजी का विश्लेषण कर सकते हैं शामिल हैं; हालांकि, विश्लेषण उपयोगकर्ता मैन्युअल रूप से नेटवर्क के अंत अंक रखने पर निर्भर है, जो थकाऊ हो सकता है जब एक बड़े डेटासेट का विश्लेषण और उपयोगकर्ता के अवचेतन पूर्वाग्रहों से प्रभावित किया जा सकता है. इस पांडुलिपि में, एक कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन है कि 3 डी संवहनी नेटवर्क मात्रा कर सकते हैं विस्तार से वर्णित है. ऊपर से बाहर की सीमाओं को दूर करने के लिए, इस खुला स्रोत कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन एक कंकाल विश्लेषक में 3 डी मात्रा लोड करने के लिए confocal छवियों का अधिग्रहण पूर्व प्रक्रिया के लिए ImageJ का इस्तेमाल करता है. कंकाल विश्लेषक एक समानांतर मध्यस्थ अक्ष thinning एल्गोरिथ्म का उपयोग करता है, और मूल रूप से Kerschnitzki एट अल द्वारा विकसित किया गया था. की लंबाई और ऑस्टियोसाइट नेटवर्क की कनेक्टिविटी का विश्लेषण करने के लिए18; इस एल्गोरिथ्म को प्रभावी ढंग से इंजीनियर microvasculature की लंबाई और कनेक्टिविटी की विशेषता के लिए लागू किया जा सकता है.
कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल 3 डी microenvironments में microvascular नेटवर्क के निर्माण की रूपरेखा और एक खुला स्रोत और उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह मुक्त कम्प्यूटेशनल पाइप लाइन प्रदान करता है आसानी से iPSC-EPs के vasculogenic क्षमता की तुलना.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td>Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>The base media for iPSC-EP differentiation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50136165</td>
			<td>Water purification system; others can be readily substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A8412</td>
			<td>To preserve cell viability when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE, human (clone: AC136)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-140</td>
			<td>Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>C-6556</td>
			<td>Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg</td>
			<td>VWR</td>
			<td>354249</td>
			<td>Main component of the 3D microenvironment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes (15/50 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D/A</td>
			<td>Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>To counterstain and visualize cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320-082</td>
			<td>For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>To wash monolayer cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008</td>
			<td>For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td>Promotes endothelial cell viability and proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001&#160;&#160;</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,BioUltra, for molecular biology, &#62;=99.0% (NT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>Neutralizes remaining detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,&#62;=95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>Component of iPSC-EP differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>1.8.0_152</td>
			<td>Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>356231</td>
			<td>Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1825015</td>
			<td>Used to balance final hydrogel osmolarity and pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Stores small volumes of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>The main ingredient of the immunostaining solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td>Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine phalloidin</td>
			<td>Themo Fisher Scientific</td>
			<td>R415</td>
			<td>To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (nonionic surfactant)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td>Detergent used to gently permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (emulsifying reagent)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Increases the binding specificity of the added antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin (F-8)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9989&#160;</td>
			<td>To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14700</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td>Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors

प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) एक रोगी विशेष, proliferative सेल स्रोत है कि किसी भी दैहिक सेल प्रकार में अंतर कर सकते हैं. द्विशक्तिशाली endothelial संतति (ईपीएस), जो सेल प्रकार परिपक्व इकट्ठा करने के लिए आवश्यक में अंतर कर सकते हैं, कार्यात्मक vascualture, दोनों भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त किया गया है. हालांकि, इन कोशिकाओं को कड़ाई से तीन आयामी वातावरण में मूल्यांकन नहीं किया गया है, और उनके vasculogenic क्षमता का एक मात्रात्मक उपाय मायावी बनी हुई है. यहाँ, फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई के माध्यम से iPSC-EPs की पीढ़ी और अलगाव पहले रेखांकित कर रहे हैं, कोलेजन hydrogels में iPSC-EPs के encapsulation और संस्कृति का वर्णन द्वारा पीछा किया. यह extracellular मैट्रिक्स (ECM)-mimicking microenvironment एक मजबूत vasculogenic प्रतिक्रिया को प्रोत्साहित करती है; संवहनी नेटवर्क संस्कृति के एक सप्ताह के बाद फार्म. इस vasculogenic प्रतिक्रिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करता है कि एक कम्प्यूटेशनल पाइप लाइन का निर्माण रेखांकित किया है. इस पाइप लाइन को विशेष रूप से केशिका जाल के 3 डी वास्तुकला को मजबूत शाखाओं की संख्या, शाखाओं अंक, और न्यूनतम उपयोगकर्ता इनपुट के साथ कुल नेटवर्क लंबाई की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।

विभेद (चित्र1), FACS और कोलेजन hydrogels में iPSC-EPs के encapsulation के बाद, कोशिकाओं को आम तौर पर माइग्रेट करने के लिए शुरू करने और प्रारंभिक lumens फार्म से पहले 24 एच के लिए गोल रहेगा. संस्कृति के बारे में 6 ?...

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An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC-EPs) से व्युत्पन्न Endothelial संतान हृदय रोग उपचार में क्रांति लाने के लिए और अधिक वफादार हृदय रोग मॉडल के निर्माण को सक्षम करने की क्षमता है. इसमें, तीन आयामी (3 डी) कोलेजन microenvironments में iPSC-EPs के encapsulation और इन कोशिकाओं के vasculogenic क्षमता का एक मात्रात्मक विश्लेषण वर्णित हैं.

एक In Vitro 3 D मॉडल और गणनात्मक पाइपलाइन iPSC-Derived Endothelial संतति के Vasculogenic क्षमता को परिमाणित करने के लिए

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

हमारा प्रोटोकॉल वैक्यूनोजेनेसिस के आणविक और थोक ऊतक स्तर तंत्र में अद्वितीय अंतर्दृष्टि सक्षम बनाता है जो मॉडलिंग में हृदय रोग चिकित्सा के लिए इंजीनियरिंग कार्यात्मक वैक्यूलेचर में सहायता कर सकता है। यह प्रोटोकॉल विभिन्न प्लेटफार्मों की वैस्कुलोजेनिक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए मजबूत, त्रि-आयामी संवहनी नेटवर्क के निर्माण की अनुमति देता है, और अंतिम नेटवर्क टोपोलॉजी का विश्लेषण करने के लिए एक मुफ्त, ओपन सोर्स कंप्यूटेशनल पाइपलाइन भी प्रदान करता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए D5D6 विभेदित सेल संस्कृति के प्रति अच्छी तरह से सेल टुकड़ी समाधान के 250 माइक्रोलीटर जोड़कर शुरू करें।इनक्यूबेशन के अंत में, कोशिकाओं को एकल कोशिका निलंबन में अलग करने के लिए P1000 पिपेट टिप का उपयोग करें। अपकेंद्रित्र के लिए एक 15 मिलीलीटर शंकु नली में सेल समाधान पूल। हम बर्फ ठंड छंटाई बफर के २०० माइक्रोलीटर में गोली निलंबित और केंद्रित फ्लोरेसेंस के पांच माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं लेबल चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए CD34 एंटीबॉडी संयुग्मित ।इनक्यूबेशन के अंत में, बर्फ ठंड छंटाई बफर के पांच mililitres में कोशिकाओं को धो लें। एक 40 माइक्रोमीटर के माध्यम से निलंबन को फ़िल्टर करें पांच मिलीलीटर फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई, या FACS, ट्यूब में छलनी डालना। नमूना चलाने से पहले, फ्लोरोसाइटोमीटर पर चौथी अवेलेबल कोशिकाओं में से एक बार 10 वीं सॉर्ट करें, एक उच्च फ्लोरेसेंस तीव्रता पर एक क्षेत्र को गेटिंग करें जिसमें नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए किसी भी अवेलेबल कोशिकाओं को शामिल नहीं किया जाता है।फिर लेबल किए गए नमूने को सॉर्ट करें जिसमें उनके उच्च सीडी 34 अभिव्यक्ति के आधार पर प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल से प्राप्त एंडोथेलियल प्रोजेनिटर होते हैं। तरह के अंत में, एंडोथेलियल प्रोजेनिटर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र के लिए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। जनक कोशिकाओं के कोलेजन हाइड्रोजेल एनकैप्सुलेशन के लिए, हम एंडोथेलियल ग्रोथ मीडियम 2 के 200 माइक्रोलीटर में सॉर्ट सेल पेलेट को निलंबित करते हैं, जो रॉक अवरोधक वाई-27632 के 10 माइक्रोमिलिटर के साथ पूरक होता है।बर्फ पर 1.8 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में सीडिंग माध्यम के 400 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को जोड़ें। कोलेजन के 350 माइक्रोलीटर को सेल सस्पेंशन में मिलाएं। समाधान पीला पीला हो जाएगा।इसके बाद, कोलेजन और सेल समाधान में 1-मुलर सोडियम हाइड्रोक्साइड के दस माइक्रोलीटर मिलाएं। समाधान अब चमकीला गुलाबी हो जाएगा। एक 96 अच्छी तरह से अल्ट्रा-कम अटैचमेंट यू-बॉटम सेल कल्चर प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में इस निष्प्रभावी कोलेजन सेल समाधान के 56 माइक्रोलीटर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट की इनक्यूबेशन के लिए।इनक्यूबेशन के अंत में, एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के नीचे कुओं की जांच करने के लिए जांच है कि कोशिकाओं को समान रूप से वितरित किया गया है । फिर ताजा तैयार एंडोथेलियल ग्रोथ मीडियम 2 के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, जो रॉक अवरोधक और वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर के साथ प्रत्येक कुएं में पूरक हो और प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस करें। संस्कृति के एक सप्ताह के बाद, 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 250 माइक्रोलीटर को 48 अच्छी प्लेट प्रति हाइड्रोगेल के एक कुएं में जोड़ें और हाइड्रोगेल से माध्यम को हटा दें।फिर कुओं वाले पैराफॉर्मेल्डिहाइड में हाइड्रोगेल्स को स्थानांतरित करने के लिए ठीक-इत्तला दी चिमटी का उपयोग करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के बाद, तेजी से पीबीएस के साथ हाइड्रोगेल धोएं और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 0.5% गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट के 250 माइक्रोलीटर के साथ 3-डी संस्कृतियों को पार करें। पीबीएस के 250 माइक्रोलीटर के साथ कमरे के तापमान पर दो पांच मिनट की धोता के साथ हाइड्रोगेल धोएं, प्रति वॉश 300 मिलीलीटर ग्लाइसिन के साथ पूरक, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए बफर अवरुद्ध के 250 माइक्रोलीटर में प्रत्येक हाइड्रोगेल के विसर्जन के बाद।चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर बफर अवरुद्ध करने में पतला उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं लेबल, ०.५% में दो धोता के बाद अभिकर्ण और Dulbecco PBS पायस । दूसरे धोने के बाद, 0.5% में दो बार 3-डी संस्कृतियों को धोने से पहले, प्रकाश से संरक्षित कमरे के तापमान पर दो घंटे के लिए उपयुक्त प्रजातियों विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को लेबल करें, जैसा कि प्रदर्शन किया गया है। सेल नाभिक की कल्पना करने के लिए, कमरे के तापमान पर दो मिनट के इनक्यूबेशन के लिए नमूनों के लिए पीबीएस में एक से 10000 एकाग्रता पर डीएपीआई जोड़ें, इसके बाद 0.5% में दो वॉश हैं जो रीएजेंट और डल्बेको के पीबीएस को जोड़ते हैं।फिर प्रत्येक नमूने को उचित देखने वाले पोत में स्थानांतरित करने के लिए ठीक-इत्तला दी चिमटी का उपयोग करें। कोलेजन हाइड्रोगेल में भेदभाव, छंटाई और एनकैप्सुलेशन के बाद, कोशिकाएं आम तौर पर 24 घंटे तक गोल रहेंगी, शुरुआती ल्यूमेंस को माइग्रेट करने और बनाने से पहले। संस्कृति के बारे में छह दिनों के बाद, एक आदिम केशिका जाल हाइड्रोगेल में दिखाई देगा जब उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी के साथ देखा जाएगा ।एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर फिक्स्ड, सना हुआ, सेल लादेन हाइड्रोगेल इमेजिंग के बाद, पूर्व प्रसंस्कृत छवियों को कंकाल में परिवर्तित किया जाता है जो नेटवर्क की समग्र लंबाई और कनेक्टिविटी का विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है। FACS के बाद एंटीबायोटिक दवाओं को जोड़ना अनिवार्य है, क्योंकि इस उपकरण के इंटीरियर को स्टरलाइज करना मुश्किल है, और सेल एनकैप्सुलेशन के 24 घंटे बाद एंटीबायोटिक्स को हटाना। इस तकनीक का उपयोग करके, हम यह निर्धारित करने में सक्षम थे कि कौन सी भौतिक और रासायनिक विशेषताएं एक्सेसेलुलर मैट्रिक्स नकल उतारती हैं बायोमैटेरियल्स आईपीएससी-व्युत्पन्न व्युत्पन्न एंडोथेलियल जनकों की वैकुलोजेनिक क्षमता को नियंत्रित करते हैं।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Thymic की विशेषता का उपयोग कर माउस भ्रूण में progenitors निपटाने<em&gt; Vivo</em&gt; और<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

एक का विकास<em&gt; इन विट्रो</em&gt; परख mesenchymal कोशिकाओं कि कराना पड़ा उपकला-mesenchymal संक्रमण की सिकुड़ा समारोह का मूल्यांकन करने के लिए

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

इन विट्रो में और vivo मॉडल में अध्ययन करने के कॉर्नियल Endothelial-mesenchymal संक्रमण

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

मानव Pluripotent स्टेम सेल से आदिम और निश्चित टेम Progenitors के विभेद का निर्देशन

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

IPSC व्युत्पन्न मानव मस्तिष्क Organoids की पीढ़ी जल्दी neurodevelopmental विकार मॉडल

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

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महाधमनी अंगूठी सह संस्कृति परख: एक सुविधाजनक उपकरण में Mesenchymal Stromal कोशिकाओं की Angiogenic क्षमता का आकलन करने के लिए इन विट्रो

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

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Corneal टिशू इंजीनियरिंग: एक इन विट्रो मॉडल के Stromal-तंत्रिका बातचीत के मानव कॉर्निया

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

एक Endothelial सेल मनका अंकुरण परख में Pericytes शामिल

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

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पाड़-मुक्त, तीन आयामी इंसुलिन व्यक्त Pancreatoids से माउस अग्नाशय Progenitors इन विट्रो में की पीढ़ी

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

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नाभिक, प्रोटीन, और Cytoskeleton के वितरण का अध्ययन करने के लिए Caenorhabditis एलिगेंस Germline का अभिकलनी विश्लेषण

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...