Name: an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors
Uploaded: 2019-05-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors at JoVE.com

이 작품은 미국 심장 협회 (교부금 번호 15SDG25740035, J.Z.에 수여), 국립 보건원의 생물 의학 영상 및 생명 공학 (NIBIB)의 국립 연구소 (보조금 번호 EB007507, C.C.에 수여), 및 재생 재활 연구 및 훈련을위한 연합 (AR3T, 부여 번호 1 P2C HD086843-01, J.Z.에 수여). 우리는 공초점 현미경 검사법에 대한 그녀의 기술적인 조언을 위해 Jeanne Stachowiak 교수 (오스틴텍사스 대학)를 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 사무엘 미헬릭 (오스틴 텍사스 대학), 알리시아 알렌 박사 (오스틴 텍사스 대학), 줄리 Rytlewski 박사 (적응 생명 공학), 박사 레온 벨란 (밴더빌트 대학)와 의논에 감사드립니다 3D 네트워크의 계산 분석. 마지막으로, 우리는 박사 샤오 핑 바오 (캘리포니아 대학, 버클리) iPSC-EP로 iPSCs를 차별화에 대한 그의 조언에 감사드립니다.

1. 배양 배지 및 코팅 솔루션 의 준비
<ol><li>비트로넥틴 코팅 용액을 준비하려면, 덜베코의 인산완충식염수(DPBS)에서 비트로넥틴 1:100을 희석합니다. 주의: 희석후에는 나중에 사용할 수 있도록 이 솔루션을 보관하지 않는 것이 좋습니다.</li>
	<li>페놀을 적색으로 받으면, 성장 인자 감소 젤라틴 단백질 혼합물(재료 표참조)을 제조업체로부터 받은 후, 혼합물이 투명하고 유체가 될 ?...

<ol>
	<li>Wang, K., Lin, R. -. Z., Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+human+vascular+networks:+trends+and+directions+in+endothelial+and+perivascular+cell+sources.">Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).</li><li>Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+approaches+to+spatiotemporally+directing+angiogenesis+in+host+and+engineered+tissues.">Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues.</a> Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).</li><li>Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+for+therapeutic+angiogenic+materials.">Design principles for therapeutic angiogenic materials.</a> Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).</li><li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+cell+tube+formation+assay+on+basement+membrane+turns+20:+State+of+the+science+and+the+art.">The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art.</a> Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).</li><li>Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+potential+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+form+microvascular+networks+in+3D+cultures.">Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).</li><li>Nakatsu, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF121+and+VEGF165+regulate+blood+vessel+diameter+through+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+in+an+in+vitro+angiogenesis+model.">VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model.</a> Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).</li><li>Shamloo, A., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+density+mediates+polarization+and+lumen+formation+of+endothelial+sprouts+in+VEGF+gradients.">Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients.</a> Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+functional+microvascular+networks+with+human+mesenchymal+stem+cells+in+microfluidic+systems.">Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems.</a> Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+network+formation+of+vascular+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Kusuma, S., Shen, Y. -. I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+vascular+networks+from+human+pluripotent+stem+cells+in+a+synthetic+matrix.">Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).</li><li>Charwat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+limitations+of+microscopy+and+Raman+spectroscopy+for+live-cell+analysis+of+3D+cell+cultures.">Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures.</a> Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).</li><li>Holnthoner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+induce+vascular+tube+formation+of+outgrowth+endothelial+cells+in+a+fibrin+matrix.">Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).</li><li>Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+for+quantifying+angiogenesis+in+the+Matrigel+assay+in+vitro.">A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).</li><li>Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+image+quantification+as+a+new+morphometry+method+for+tissue+engineering.">Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).</li><li>Kerschnitzki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+osteocyte+network+correlates+with+bone+material+quality.">Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).</li><li>Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+endothelial+progenitor+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+Wnt+activation+under+defined+conditions.">Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions.</a> Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).</li><li>Crosby, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+vasculogenic+potential+of+iPSC-derived+endothelial+progenitors+in+collagen+hydrogels.">Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2019).</li><li>Li, C. H., Tam, P. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iterative+algorithm+for+minimum+cross+entropy+thresholding.">An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding.</a> Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).</li><li>Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+world+of+osteocytes:+Connectomics+of+the+lacuno-canalicular+network+in+bone.">The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone.</a> New Journal of Physics. 19 (7), (2017).</li><li>Crosby, C. O., Zoldan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+physical+cues+of+the+ECM+in+angiogenic+biomaterials.">Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials.</a> Regenerative Biomaterials. , (2019).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+extracellular+matrix+density+and+mesenchymal+stem+cells+on+neovascularization+in+vivo.">Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).</li><li>Ghajar, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+matrix+density+on+the+regulation+of+3-D+capillary+morphogenesis.">The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).</li><li>Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+human+microvessels+formed+in+3D+fibrin+gel+by+constraint+of+gel+contraction.">Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction.</a> Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li></ol>

이 프로토콜은 E8, LaSR 기저, 및 EGM-2의 세 가지 유형의 세포 배양 배지에서 세포의 장기 배양을 포함한다. 따라서 모든 물질을 적절하게 살균하기 위해 세심한주의를 기울여야합니다. 또한 실험실 코트와 에탄올 세척 장갑은 실험실의 층류 후드에서 작업할 때 항상 착용해야 합니다. 마이코 플라즈마 오염을 자주 테스트하는 것이 좋습니다. iPSC 배양 중에 다량의 파편이 관찰되는 경우 또는 분화 효...

인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVECs) 및 기타 1차 내피 세포 유형은 2년 동안 시험관내 혈관 발아및 발달을 모델링하기 위해 활용되어 왔다. 이러한 혈관 플랫폼은 심혈관 질환의 분자 및 조직 수준 메커니즘을 조명할 것을 약속하고 원시 혈관네트워크의 발달에 대한 생리학적 통찰력을 제시할 수 있다 2,3. 혈관 모델링 분야는 상당한 발전을 목격했지만 생리학적 혈관 발달을 정량적으로 모델링하고 평가할 수 있는 "금 본위제" 분석은 여전히 애매합니다. 대부분의 출판된 프로토콜은 성숙하고 기능적인 혈관의 형성을 장려하기 위해 혈관 틈새 시장을 적절히 회수하지 못하거나 평가된 세포 유형의 혈관 전위를 3차원으로 정량적으로 비교하는 방법이 없는 경우( 3D).
많은 현재 혈관 모형은 생리적인 혈관 틈새시장을 모방하는 그들의 기능에 있는 제한됩니다. 시험관내 에서 가장 일반적으로 사용되는 것 중 하나는 젤라틴 단백질 혼합물 계 튜브 형성 분석이다. 간략하게, HUVECs는 뮤린 육종 세포 외 매트릭스 (ECM)에서 수확 한 단백질로 구성된 겔의 얇은 층에 단일 세포로 시드된다; 1 ~ 2 일 이내에 HUVECs는 원시 튜브4로자체 조립됩니다. 그러나, 이러한 과정은 2차원(2D)과 이 분석법에서 활용되는 내피 세포(ECs)에서 발생하며, 이러한 연구의 생리학적 중요성을 제한함으로써 동봉된 중공 루멘을 형성하지 않는다. 보다 최근에는, ECs 및 지지 세포(예를 들어, 중간엽 줄기 세포(SC) 및 회구)는 콜라겐 또는 피브린 하이드로겔과 같은 네이티브 ECM의 섬유질 구조를 시뮬레이션하는3D 미세 환경에서 공동 배양되고 있다 5. 이러한 미세 환경의 혈관 발달을 모델링하기 위해, EC로 코팅된 중합체 비드는 전형적으로6을채용한다. 하이드로겔에 간질적으로 내장된 다른 세포에 의해 분비되는 외인성 성장 인자 및/또는 성장 인자의 첨가는 ECs를 유도할 수 있고, 중합체 비드를 코팅하고, 싹트고 단일 루멘을 형성할 수 있다; 그런 다음 새싹과 용기의 수와 직경을 계산할 수 있습니다. 그러나, 이러한 새싹은 단수이며 생리학적 조건에서 볼 수 있듯이 동봉된 연결된 네트워크를 형성하지 않으므로 종양 혈관 구조 모델을 연상시킵니다. 미세유체 장치는 또한 혈관 틈새 시장을 모방하고 EC-라덴 하이드로겔7,8에서혈관 구조의 형성을 촉진하기 위해 활용되었다. 전형적으로, 혈관신생 성장 인자-구배는 순환 세포 배양 배지에 적용되어 EC 이동 및 발아를 유도한다. 개발된 용기의 루멘을 구성하는 ECs는 미세유체 장치를 통한 유체 흐름의 적용에 의해 유도된 전단 응력에 민감하며; 따라서 이러한 미세 유체 장치는 정적 모델에서 액세스할 수 없는 주요 생리학적 매개 변수를 캡처합니다. 그러나 이러한 장치는 비용이 많이 드는 미세 제작 능력이 필요합니다.
가장 중요한 것은, 세 가지 혈관 모델(2D, 3D, 미세유체)이 1차 EC뿐만 아니라 1차 지지 세포 유형을 압도적으로 활용했다는 것입니다. 세포가 이식시 면역 반응을 일으키기 때문에 1 차적인 세포는 효과적인 심장 혈관 치료로 발전될 수 없습니다; 더욱이, HUVECs 및 유사한 1 차적인 세포 모형은 환자 특정하지 않으며 유전 처리 또는 기존 건강 상태, 예를 들면, 당뇨병 mellitus를 가진 환자에서 생기는 혈관 이상을 포착하지 않습니다. 유도된 만능 줄기세포(iPSCs)는 지난 10년간 인체내의 모든 체세포로 분화될 수 있는 환자 특이적, 증식성 세포 공급원으로 나타났다. 특히, iPSC 유래 내피 선조(iPSC-EP)의 생성 및 격리를 설명하는 프로토콜이 10,11; iPSC-EP는 이중성이며, 따라서, 성숙하고 기능적인 혈관구조의 빌딩 블록인 내피 세포와 평활근 세포/회핵세포로 더욱 분화될 수 있다. 단 하나의 연구는 설득력 3D 미세 환경12에서iPSC-EP에서 기본 모세관 신경총의 개발을 상세히했다; 본 연구는 iPSC-EP 어셈블리의 이해와 천연 및 합성 하이드로겔의 분화에 매우 중요하지만, 생성된 혈관구조의 네트워크 와 사과를 정량적으로 비교하지는 않았다. 또 다른 최근 연구는 HUVECs 및 iPSC 유래 ECs5의 발아를 비교하기 위해 폴리머 비드 모델을 사용했다. 따라서 3D 미세 환경에서 iPSC-EP 혈관 발생을 조절하는 물리적 및 화학적 신호 메커니즘을 더 명확히 밝히고 이러한 세포가 허혈성 치료 및 심혈관 질환에 적합한지 여부를 결정할 필요가 있습니다. 모델링.
지난 10년 동안 혈관 네트워크 길이와 연결을 정량화하고 비교하기 위해 다양한 오픈 소스 계산 파이프라인과 스켈레톤 알고리즘이 개발되었습니다. 예를 들어, Charwat 등은 피브린 매트릭스13,14에서지방 유래 줄기 세포 및 아웃성장 EC의 공동 배양으로부터 유래된 혈관 네트워크의 필터링된 이불화 이미지를 추출하는 포토샵 기반 파이프라인을 개발하였다. 아마도 가장 널리 사용되는 토폴로지 비교 도구는 AngioTool, 국립 암 연구소에 의해 온라인으로 출판 된 프로그램입니다15; 프로그램의 광범위한 채택과 잘 문서화 된 충실도에도 불구하고,이 프로그램은 AngioSys 및 Wimasis를 포함한 두 가지 차원의 선박과 같은 구조를 분석하는 것으로 제한되며 동일한 차원 제한16을공유합니다. Imaris, Lucis 및 변형과 같은 강력한 소프트웨어 제품군은 엔지니어링 된 미세 혈관 구조의 네트워크 토폴로지를 분석하기 위해 개발되었습니다. 그러나 이러한 제품군은 대부분의 학술 실습에서 비용이 많이 들며 소스 코드에 대한 액세스를 제한하므로 최종 사용자가 특정 응용 프로그램에 맞게 알고리즘을 사용자 지정하는 데 방해가 될 수 있습니다. 3D 슬라이서, 오픈 소스 자기 공명 영상 / 컴퓨터 단층 촬영 패키지, 효과적으로 3D 혈관 네트워크의 토폴로지를 분석 할 수있는 혈관 모델링 도구 키트를 포함(17; 그러나 분석은 사용자가 네트워크의 끝점을 수동으로 배치하는 데 의존하며, 이는 큰 데이터 집합을 분석할 때 지루해질 수 있으며 사용자의 잠재 의식 편향에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이 원고에서는 3D 혈관 네트워크를 정량화할 수 있는 계산 파이프라인을 자세히 설명합니다. 위에서 설명한 한계를 극복하기 위해 이 오픈 소스 계산 파이프라인은 ImageJ를 활용하여 획득한 공초점 이미지를 사전 처리하여 3D 볼륨을 스켈레톤 분석기로 로드합니다. 상기 골격 분석기는 병렬 내측축 숱이 알고리즘을 사용하며, 원래 Kerschnitzki 등에서 개발하여 골혈구망(18)의 길이 및 연결을 분석한다. 이 알고리즘은 엔지니어링 된 미세 혈관 구조의 길이와 연결을 특성화하기 위해 효과적으로 적용 될 수 있습니다.
이 프로토콜은 3D 미세 환경에서 미세 혈관 네트워크의 생성을 간략하게 설명하고 iPSC-EP의 혈관 전위를 쉽게 비교할 수 있는 오픈 소스 및 사용자 편향 없는 계산 파이프라인을 제공합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td>Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>The base media for iPSC-EP differentiation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50136165</td>
			<td>Water purification system; others can be readily substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A8412</td>
			<td>To preserve cell viability when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE, human (clone: AC136)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-140</td>
			<td>Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>C-6556</td>
			<td>Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg</td>
			<td>VWR</td>
			<td>354249</td>
			<td>Main component of the 3D microenvironment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes (15/50 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D/A</td>
			<td>Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>To counterstain and visualize cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320-082</td>
			<td>For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>To wash monolayer cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008</td>
			<td>For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td>Promotes endothelial cell viability and proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001&#160;&#160;</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,BioUltra, for molecular biology, &#62;=99.0% (NT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>Neutralizes remaining detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,&#62;=95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>Component of iPSC-EP differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>1.8.0_152</td>
			<td>Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>356231</td>
			<td>Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1825015</td>
			<td>Used to balance final hydrogel osmolarity and pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Stores small volumes of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>The main ingredient of the immunostaining solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td>Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine phalloidin</td>
			<td>Themo Fisher Scientific</td>
			<td>R415</td>
			<td>To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (nonionic surfactant)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td>Detergent used to gently permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (emulsifying reagent)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Increases the binding specificity of the added antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin (F-8)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9989&#160;</td>
			<td>To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14700</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td>Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors

유도된 만능 줄기 세포(iPSCs)는 임의의 체세포 유형으로 분화할 수 있는 환자 특이적, 증식성 세포 공급원이다. 성숙하고 기능적인 혈관을 조립하는 데 필요한 세포 유형으로 분화할 수 있는 이중내피 전구체(EP)는 배아 및 유도 만능 줄기 세포 모두에서 유래되었습니다. 그러나, 이 세포는 3차원 환경에서 엄격하게 평가되지 않았고, 그들의 혈관 전위도의 양적 측정은 애매하게 남아 있습니다. 여기서, 형광 활성화 세포 선별을 통한 iPSC-EP의 생성 및 격리가 먼저 설명되고, 그 다음에 콜라겐 하이드로겔에서 iPSC-EP의 캡슐화 및 배양에 대한 설명이 뒤따랐다. 이 세포외 매트릭스 (ECM)모방 미세 환경은 강력한 혈관 반응을 장려합니다. 혈관 네트워크는 배양의 주 후에 형성됩니다. 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 이러한 혈관 반응을 정량화하는 계산 파이프라인의 생성이 설명됩니다. 이 파이프라인은 모세관 신경총의 3D 아키텍처를 보존하여 최소한의 사용자 입력으로 분기, 분기 점 및 전체 네트워크 길이를 강력하게 식별하도록 설계되었습니다.

분화 후(그림1), FACS 및 콜라겐 하이드로겔에서 iPSC-EP의 캡슐화 후, 세포는 전형적으로 초기 루멘을 마이그레이션하고 형성하기 시작하기 전에 24 시간 동안 반올림된 상태로 유지됩니다. 배양의 대략 6 일 후에, 원시 모세관 신경총은 밝은 필드 현미경 검사법으로 볼때 하이드로겔에서 볼 수 있을 것입니다 (그림 2). 공초점 현미?...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors at JoVE.com

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

유도 된 만능 줄기 세포에서 파생 된 내피 전구체 (iPSC-EP)는 심혈관 질환 치료에 혁명을 일으킬 잠재력을 가지고 있으며 보다 충실한 심혈관 질환 모델을 생성 할 수 있습니다. 본 명세서에서, 3차원(3D) 콜라겐 미세환경에서 iPSC-EP의 캡슐화 및 이들 세포의 혈관전위액의 정량적 분석이 기재되어 있다.

iPSC 유래 내피 선조의 혈관 전위를 정량화하는 체외 3D 모델 및 전산 파이프라인

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

우리의 프로토콜은 모델링에서 심혈관 질환 치료를 위한 엔지니어링 기능적 혈관치료에 도움이 될 수 있는 혈관 신생의 분자 및 벌크 조직 수준 메커니즘에 대한 독특한 통찰력을 가능하게 합니다. 이 프로토콜을 사용하면 다양한 플랫폼의 혈관 전위평가를 위한 강력한 3차원 혈관 네트워크를 생성할 수 있으며 최종 네트워크 토폴로지 분석을 위한 무료 오픈 소스 계산 파이프라인도 제공합니다. D5D6 분화 세포 배양의 웰 당 250 마이크로 리터의 세포 분리 용액을 섭씨 37도에서 10 분 동안 첨가하여 시작합니다.인큐베이션의 끝에서 P1000 파이펫 팁을 사용하여 세포를 단일 셀 현탁액으로 해리시합니다. 원심분리를 위해 단일 15 밀리리터 원판 튜브에 셀 솔루션을 풀. 우리는 얼음 냉기 선별 완충제 200 마이크로 리터에서 펠릿을 중단하고 4섭씨에서 10 분 동안 농축 형광 컨쥬게이징 CD34 항체의 5 마이크로 리터로 세포를 라벨.인큐베이션이 끝나면 얼음 냉기 선별 버퍼의 5 밀리리터로 세포를 씻으라. 40 마이크로미터를 통해 서스펜션을 5밀리리터 형광 활성화 셀 정렬 또는 FACS 튜브에 붓는다. 시료를 실행하기 전에, 플루오시토미터에 네 번째 레이블이 없는 세포의 10배를 정렬하고, 음의 대조군으로 작용하기 위해 표지되지 않은 세포를 포함하지 않는 높은 형광 강도로 영역을 게이팅한다.그런 다음 표지된 시료를 정렬하여 높은 CD34 발현에 기초하여 유도된 다능성 줄기 세포로부터 유래된 내피 전구체를 함유한다. 종류의 끝에서, 원심 분리를 위한 미세원심분리기 관으로 내피 전구 세포를 이송한다. 전구 세포의 콜라겐 하이드로겔 캡슐화의 경우, 우리는 내피 성장 중간 2의 200 마이크로 리터에서 정렬 된 세포 펠릿을 일시 중단, 로크 억제제 Y-27632의 10 마이크로 밀리터로 보충.얼음 위에 1.8 밀리터 미세 원심 분리기 튜브에 파종 배지의 400 마이크로 리터에 세포를 추가합니다. 콜라겐 350마이크로리터를 세포 현탁액에 섞는다. 용액은 옅은 노란색이 될 것입니다.다음으로, 1-뮬러 나트륨의 10 마이크로리터를 콜라겐 과 세포 용액에 섞는다. 이제 솔루션이 밝은 분홍색이 됩니다. 파이펫 56 마이크로리터는 이 중화 콜라겐 세포 용액을 96°C의 개별 우물로 미세화하여 섭씨 37도에서 30분 동안 배양할 수 있도록 매우 낮은 부착 U-바닥 세포 배양 플레이트를 제공합니다.인큐베이션의 끝에서, 세포가 균등하게 분포되었는지 확인하기 위해 밝은 필드 현미경의 밑에 우물을 검사합니다. 그런 다음 새로 준비된 내피 성장 매체 2의 100 마이크로리터를 추가하여 ROCK 억제제와 혈관 내피 성장 인자로 보충하여 각 웰에 접시를 37도 섭씨 인큐베이터로 되돌릴 수 있습니다. 문화의 1 주일 후, 하이드로겔 당 48 웰 플레이트의 한 우물에 4 %의 파라 포름알데히드의 250 마이크로 리터를 추가하고 하이드로 겔에서 매체를 제거합니다.그런 다음 미세 기울어진 핀셋을 사용하여 하이드로겔을 우물을 포함하는 파라포름데히드로 옮기습니다. 실온에서 10분 후, PBS로 하이드로겔을 빠르게 세척하고 실온에서 5분 동안 250마이크로리터의 이온성 계면활성제를 250마이크로리터로 투과화한다. 실온에서 25분 세척으로 하이드로겔을 250마이크로리터의 PBS로 세척하고, 각 하이드로겔을 실온에서 30분 동안 블로킹 버퍼 250마이크로리터에 담그게 됩니다.적절한 1 차 항체가 하룻밤 동안 완충액을 차단하는 데 희석된 적절한 1차 항체로 세포에 라벨을 붙이고, 그 다음으로 0.5%의 유화 시약및 덜벡코의 PBS에서 2개의 세차체가 뒤따릅니다. 두 번째 세척 후, 3D 배양을 0.5%에 2회 세척하기 전에, 빛으로부터 보호되는 실온에서 2시간 동안 적절한 종 특이적 이차 항체로 세포를 라벨로 표시한 후, 입증된 바와 같이, 0.5%의 유화제 시약및 덜벡코의 PBS에서 두 번 세척한다. 세포 핵을 시각화하려면, 실온에서 2분 동안 PBS에 1~10000 농도로 희석된 DAPI를 추가한 다음 0.5%에 달하는 시약과 덜벡코의 PBS에 2개의 세척을 한다.그런 다음 미세 기울어진 핀셋을 사용하여 각 샘플을 적절한 보기 용기로 옮기습니다. 콜라겐 하이드로겔에서 분화, 정렬 및 캡슐화 후, 세포는 일반적으로 24시간 동안 반올림된 상태로 유지되며, 초기 루멘을 형성하기 시작한다. 문화의 약 6 일 후에, 밝은 필드 현미경으로 볼 때 원시 모세관 신경총은 하이드로겔에서 볼 수 있을 것입니다.공초점 현미경에 고정, 염색된, 세포 라덴 하이드로겔을 이미징한 후, 미리 처리된 이미지는 네트워크의 전체 길이 및 연결을 분석할 수 있는 골격으로 변환됩니다. 이 기구의 내부를 살균하는 것은 어렵기 때문에 FACS 후에 항생제를 추가하고 세포 캡슐화 후에 24 시간 항생제를 제거하는 것이 필수적입니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 생체 물질을 모방하는 세포외 매트릭스가 iPSC 유래 내피 세포 전구체의 혈관 수막 전위를 지배하는 물리적 및 화학적 특성을 결정할 수 있었습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

연구

발생학

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

대동맥 반지 공동 문화 분석 결과: Mesenchymal Stromal 세포에 생체 외에서 의 신생 잠재력을 평가 하는 편리한 도구

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

각 막 조직 공학:는 생체 외에서 의 모델 인간 각 막의 실질 신경 상호 작용

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

분석 결과 돋 아 내 피 세포 구슬 Pericytes 통합

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...