Name: an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors
Uploaded: 2019-05-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Associação Americana de coração (Grant Number 15SDG25740035, concedido a J.Z.), o Instituto Nacional de imagiologia biomédica e bioengenharia (NIBIB) dos institutos nacionais de saúde (número de subvenção EB007507, concedido a C.C.), e a Aliança para a pesquisa de reabilitação regenerativa & formação (AR3T, concessão número 1 P2C HD086843-01, concedida a J.Z.). Gostaríamos de reconhecer o Prof. Jeanne Stachowiak (a Universidade do Texas em Austin) por seu aconselhamento técnico sobre microscopia confocal. Estamos também gratos por discussões com Samuel Mihelic (a Universidade do Texas em Austin), Dr. Alicia Allen (a Universidade do Texas em Austin), Dr. Julie Rytlewski (Adaptive Biotech), e Dr. Leon Bellan (Universidade Vanderbilt) para a sua visão sobre o análise computacional de redes 3D. Finalmente, agradecemos ao Dr. Xiaoping Bao (Universidade da Califórnia, Berkeley) por seu Conselho sobre diferenciar iPSCs em iPSC-EPs.

1. preparação de meios de cultura e soluções de revestimento
<ol><li>Para preparar a solução de revestimento de vitronectina, diluir a vitronectina 1:100 em soro fisiológico tamponado com tampão fosfato de Dulbecco (DPBS). Cuidado: uma vez diluído, não é recomendável armazenar esta solução para uso futuro.</li>
	<li>Ao receber fenol vermelho-livre, fator de crescimento-mistura de proteína gelatinosa reduzida (ver tabela de materiais) do fabricante, descongelar no gelo a 4 ° c até qu...

<ol>
	<li>Wang, K., Lin, R. -. Z., Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+human+vascular+networks:+trends+and+directions+in+endothelial+and+perivascular+cell+sources.">Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).</li><li>Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+approaches+to+spatiotemporally+directing+angiogenesis+in+host+and+engineered+tissues.">Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues.</a> Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).</li><li>Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+for+therapeutic+angiogenic+materials.">Design principles for therapeutic angiogenic materials.</a> Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).</li><li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+cell+tube+formation+assay+on+basement+membrane+turns+20:+State+of+the+science+and+the+art.">The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art.</a> Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).</li><li>Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+potential+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+form+microvascular+networks+in+3D+cultures.">Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).</li><li>Nakatsu, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF121+and+VEGF165+regulate+blood+vessel+diameter+through+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+in+an+in+vitro+angiogenesis+model.">VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model.</a> Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).</li><li>Shamloo, A., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+density+mediates+polarization+and+lumen+formation+of+endothelial+sprouts+in+VEGF+gradients.">Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients.</a> Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+functional+microvascular+networks+with+human+mesenchymal+stem+cells+in+microfluidic+systems.">Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems.</a> Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+network+formation+of+vascular+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Kusuma, S., Shen, Y. -. I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+vascular+networks+from+human+pluripotent+stem+cells+in+a+synthetic+matrix.">Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).</li><li>Charwat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+limitations+of+microscopy+and+Raman+spectroscopy+for+live-cell+analysis+of+3D+cell+cultures.">Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures.</a> Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).</li><li>Holnthoner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+induce+vascular+tube+formation+of+outgrowth+endothelial+cells+in+a+fibrin+matrix.">Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).</li><li>Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+for+quantifying+angiogenesis+in+the+Matrigel+assay+in+vitro.">A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).</li><li>Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+image+quantification+as+a+new+morphometry+method+for+tissue+engineering.">Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).</li><li>Kerschnitzki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+osteocyte+network+correlates+with+bone+material+quality.">Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).</li><li>Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+endothelial+progenitor+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+Wnt+activation+under+defined+conditions.">Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions.</a> Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).</li><li>Crosby, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+vasculogenic+potential+of+iPSC-derived+endothelial+progenitors+in+collagen+hydrogels.">Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2019).</li><li>Li, C. H., Tam, P. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iterative+algorithm+for+minimum+cross+entropy+thresholding.">An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding.</a> Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).</li><li>Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+world+of+osteocytes:+Connectomics+of+the+lacuno-canalicular+network+in+bone.">The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone.</a> New Journal of Physics. 19 (7), (2017).</li><li>Crosby, C. O., Zoldan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+physical+cues+of+the+ECM+in+angiogenic+biomaterials.">Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials.</a> Regenerative Biomaterials. , (2019).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+extracellular+matrix+density+and+mesenchymal+stem+cells+on+neovascularization+in+vivo.">Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).</li><li>Ghajar, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+matrix+density+on+the+regulation+of+3-D+capillary+morphogenesis.">The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).</li><li>Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+human+microvessels+formed+in+3D+fibrin+gel+by+constraint+of+gel+contraction.">Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction.</a> Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li></ol>

Este protocolo envolve a cultura a longo prazo das pilhas em três tipos de meios da cultura de pilha: E8, LaSR basal, e EGM-2. Portanto, grande cuidado deve ser tomado para esterilizar adequadamente todos os materiais. Adicionalmente, os revestimentos do laboratório e as luvas etanol-limpas devem sempre ser desgastados ao trabalhar na capa do fluxo laminar do laboratório. Recomenda-se freqüentemente testar para a contaminação do Mycoplasma; se uma grande quantidade de detritos é observada durante a cultura iPSC ou...

Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e outros tipos de células endoteliais primárias têm sido utilizadas há duas décadas para modelar a germinação e o desenvolvimento de vasos sanguíneos in vitro1. Tais plataformas vasculares prometem iluminar mecanismos de nível molecular e tecidual de doenças cardiovasculares e podem apresentar uma visão fisiológica do desenvolvimento de redes vasculares primitivas2,3. Embora o campo da modelagem vascular tenha testemunhado avanços significativos, um ensaio "padrão-ouro" que pode modelar quantitativamente e avaliar o desenvolvimento vascular fisiológico permanece elusivo. A maioria dos protocolos publicados não recapitulam adequadamente o nicho vascular para incentivar a formação de vasos sanguíneos maduros e funcionais ou não têm um método para comparar quantitativamente o potencial vasculogênico dos tipos de células avaliados em três dimensões ( 3D).
Muitos modelos vasculares atuais são limitados em sua capacidade de imitar o nicho vascular fisiológico. Uma das plataformas mais comumente empregadas in vitro é o ensaio de formação de tubos com base em misturas de proteínas gelatinosas. Resumidamente, os HUVECs são semeados como células únicas em uma fina camada de gel que consiste de proteínas colhidas da matriz extracelular de sarcoma murino (ECM); dentro de um a dois dias, o HUVECs Self-montam em tubos primitivos4. Entretanto, esse processo ocorre em duas dimensões (2D) e as células endoteliais (ECs) utilizadas neste ensaio não formam lúmens fechados e ocos, limitando assim o significado fisiológico desses estudos. Mais recentemente, as ECs e as células de suporte (por exemplo, células-tronco mesenquimais (MSCs) e pericytes) foram cocultivadas em microambientes 3D que simulam a arquitetura fibrosa do ECM nativo, como colágeno ou hidrogéis de fibrina5. Para modelar o desenvolvimento vascular neste microambiente, os grânulos poliméricos revestidos com ECs são tipicamente empregados6. A adição de fatores de crescimento exógenos e/ou fatores de crescimento secretados por outras células interstitialmente encaixadas no hidrogel pode induzir o ECs, revestindo as esferas poliméricos, para brotar e formar lúmen único; o número e o diâmetro dos rebentos e das embarcações podem então ser computados. No entanto, estes rebentos são singulares e não formam uma rede fechada, conectada como é visto em condições fisiológicas e, portanto, é mais uma reminiscência de um modelo de vasculatura tumoral. Dispositivos microfluílicos também têm sido utilizados para imitar o nicho vascular e promover a formação de vasculatura em hidrogéis EC-Laden7,8. Tipicamente, um gradiente de fator de crescimento angiogênico é aplicado ao meio de cultura celular circulante para induzir a migração e brotação da CE. Os ECs que constituem o lúmen dos vasos desenvolvidos são sensíveis à tensão de cisalhamento induzida pela aplicação do fluxo de fluido através do dispositivo microfluídico; assim, estes dispositivos microfluídicos capturam os parâmetros fisiológicos chaves que não são acessíveis nos modelos estáticos. No entanto, esses dispositivos exigem habilidades de microfabricação dispendiosas.
Mais importante ainda, todos os três modelos vasculares (2D, 3D, microfluídico) utilizam predominantemente ECs primários, bem como tipos de células de suporte primários. As células primárias não podem ser desenvolvidas em uma terapia cardiovascular efetiva, pois as células engendram uma resposta imune na implantação; Além disso, HUVECs e tipos preliminares similares da pilha não são paciente-específicos e não capturam as anomalias vasculares que ocorrem nos pacientes com uma disposição genética ou em condições de saúde pre-existing, por exemplo, mellitus de diabetes. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) surgiram na última década como uma fonte de células proliferativa, específica do paciente, que pode ser diferenciada em todas as células somáticas do corpo humano9. Em particular, foram publicados protocolos que descrevem a geração e o isolamento de progenitores endoteliais derivados do iPSC (iPSC-EPs)10,11; iPSC-EPs são bipotentes e podem, portanto, ser mais diferenciados em células endoteliais e células musculares lisas/pericytes, os blocos de construção de vasculatura madura, funcional. Somente um estudo detalhou forma convincente o desenvolvimento de um plexo capilar preliminar de IPSC-EPS em um microambiente 3D12; Embora este estudo seja crítico a uma compreensão da montagem do iPSC-EP e da diferenciação em hydrogels naturais e sintéticos, não compara quantitativamente as topologias da rede da vasculatura resultante. Outro estudo recente utilizou o modelo de cordão polimérico para comparar a brotação de HUVECs e ECs5derivado do IPSC. Portanto, há uma clara necessidade de elucidar ainda mais os mecanismos de sinalização física e química que regulam a vasculogênese de iPSC-EP em microambientes 3D e determinar se essas células são adequadas para terapia isquêmica e doença cardiovascular Modelagem.
Na última década, foram desenvolvidos diferentes pipelines computacionais de código aberto e algoritmos de esqueletização para quantificar e comparar o comprimento e a conectividade da rede vascular. Por exemplo, charwat et al. desenvolveram um pipeline baseado em Photoshop para extrair uma imagem filtrada e binarizada de redes vasculares derivadas de uma cocultura de células-tronco derivadas de Adipose e conseqüência ECS em uma matriz de fibrina13,14. Talvez a ferramenta de comparação de topologia mais amplamente utilizada seja a AngioTool, um programa publicado on-line pelo National Cancer Institute15; Apesar da adoção generalizada do programa e da fidelidade bem documentada, o programa se limita a analisar estruturas semelhantes a vasos em duas dimensões e outros programas, incluindo AngioSys e Wimasis, compartilham a mesma limitação de dimensionalidade16. Poderosas suítes de software como Imaris, Lucis e Metamorph foram desenvolvidas para analisar a topologia de rede de microvasculatura projetada; no entanto, essas suítes são proibitivas de custo para a maioria dos laboratórios acadêmicos e limitam o acesso ao código-fonte, o que pode dificultar a capacidade do usuário final de personalizar o algoritmo para sua aplicação específica. o slicer 3D, um pacote da imagem latente de ressonância magnética da abrir-fonte/tomography computado, contem um toolkit de modelagem vascular que possa eficazmente analisar a topologia de redes vasculares 3D17; no entanto, a análise é dependente do usuário colocando manualmente os pontos finais da rede, o que pode se tornar tedioso ao analisar um grande conjunto de dados e pode ser influenciado pelos preconceitos subconscientes do usuário. Neste manuscrito, um pipeline computacional que pode quantificar redes vasculares 3D é descrito detalhadamente. Para superar as limitações acima descritas, este pipeline computacional de código aberto utiliza o ImageJ para pré-processar imagens confocais adquiridas para carregar o volume 3D em um analisador de esqueleto. O analisador de esqueleto usa um algoritmo de desbaste de eixo medial paralelo, e foi originalmente desenvolvido por Kerschnitzki et al. para analisar o comprimento e a conectividade das redes de osteócitos18; Este algoritmo pode ser aplicado eficazmente para caracterizar o comprimento e a conectividade da microvasculatura projetada.
Completamente, este protocolo esboça a criação de redes microvascular em microambientes 3D e fornece um encanamento computacional livre do aberto-fonte e do usuário-polarização para comparar prontamente o potencial vasculogenic de iPSC-EPs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td>Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>The base media for iPSC-EP differentiation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50136165</td>
			<td>Water purification system; others can be readily substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A8412</td>
			<td>To preserve cell viability when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE, human (clone: AC136)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-140</td>
			<td>Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>C-6556</td>
			<td>Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg</td>
			<td>VWR</td>
			<td>354249</td>
			<td>Main component of the 3D microenvironment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes (15/50 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D/A</td>
			<td>Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>To counterstain and visualize cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320-082</td>
			<td>For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>To wash monolayer cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008</td>
			<td>For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td>Promotes endothelial cell viability and proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001&#160;&#160;</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,BioUltra, for molecular biology, &#62;=99.0% (NT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>Neutralizes remaining detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,&#62;=95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>Component of iPSC-EP differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>1.8.0_152</td>
			<td>Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>356231</td>
			<td>Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1825015</td>
			<td>Used to balance final hydrogel osmolarity and pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Stores small volumes of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>The main ingredient of the immunostaining solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td>Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine phalloidin</td>
			<td>Themo Fisher Scientific</td>
			<td>R415</td>
			<td>To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (nonionic surfactant)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td>Detergent used to gently permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (emulsifying reagent)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Increases the binding specificity of the added antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin (F-8)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9989&#160;</td>
			<td>To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14700</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td>Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são uma fonte de células proliferativa, específica do paciente, que pode se diferenciar em qualquer tipo de célula somática. Os progenitores endothelial bipotentes (EPs), que podem diferenciar-se nos tipos da pilha necessários para montar o vasculature maduro, funcional, foram derivados das pilhas de haste pluripotentes embrionárias e induzidas. Entretanto, estas pilhas não foram avaliadas rigorosa em ambientes tridimensionais, e uma medida quantitativa de seu potencial vasculogenic permanece indescritível. Aqui, a geração e a isolação de iPSC-EPs através da classificação fluorescente-ativada da pilha são esboçadas primeiramente, seguidas por uma descrição do encapsulamento e da cultura de iPSC-EPs em hydrogels do colagénio. Esta matriz extracelular (ECM)-mimicking microambiente incentiva uma resposta vasculogênica robusta; redes vasculares formam-se após uma semana de cultura. A criação de um pipeline computacional que utiliza software de código aberto para quantificar essa resposta vasculogênica é delineada. Este pipeline é projetado especificamente para preservar a arquitetura 3D do plexo capilar para identificar de forma robusta o número de ramificações, pontos de ramificação e o comprimento total da rede com a entrada mínima do usuário.

Após a diferenciação (Figura 1), FACS e encapsulamento de IPSC-EPS em hidrogéis de colágeno, as células geralmente permanecem arredondadas por 24 h antes de começar a migrar e formar Lúmens iniciais. Após cerca de 6 dias de cultura, um plexo capilar primitivo será visível no hidrogel quando visualizado com microscopia brightfield (Figura 2). Após a imagem os hidrogéis fixados, manchados pilha-carregados em um microsc...

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An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Os progenitores endoteliais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC-EPs) têm potencial para revolucionar os tratamentos de doenças cardiovasculares e possibilitar a criação de modelos de doenças cardiovasculares mais fiéis. Nisto, o encapsulamento de iPSC-EPs em microambientes tridimensionais do colagénio (3D) e uma análise quantitativa do potencial vasculogenic destas pilhas são descritos.

Modelo in vitro 3D e pipeline computacional para quantificar o potencial Vasculogênico de progenitores endoteliais derivados de iPSC

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Nosso protocolo permite insights únicos sobre os mecanismos de nível de tecido molecular e a granel da vasculogênese que podem ajudar na vasculatura funcional de engenharia para a terapia de doenças cardiovasculares na modelagem. Este protocolo permite a criação de redes vasculares robustas e tridimensionais para avaliar o potencial vasculogênico de várias plataformas, e também fornece um pipeline computacional de código aberto gratuito para análise da topologia final da rede. Comece adicionando 250 microlitres de solução de descolamento celular por poço da cultura celular diferenciada D5D6 por 10 minutos a 37 graus Celsius.No final da incubação, use uma ponta de pipeta P1000 para dissociar as células em suspensões de células únicas. Acumule as soluções celulares em um único tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Suspendemos a pelota em 200 microliters de tampão de classificação gelada e rotulamos as células com cinco microliters de fluorescência concentrada conjugado anticorpo CD34 por 10 minutos a quatro graus Celsius.No final da incubação, lave as células em cinco mililitros de tampão de classificação gelada. Filtre a suspensão através de um filtro de 40 micrômetros em um tubo de célula ativada por fluorescência de cinco milímetros, ou FACS, tubo. Antes de executar a amostra, classifique uma vez 10 das quartas células não rotuladas no fluocitômetro, gating uma região com alta intensidade de fluorescência que não contém nenhuma das células não rotuladas para servir como controle negativo.Em seguida, classifique a amostra rotulada contendo progenitores endoteliais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas com base em sua alta expressão CD34. No final do tipo, transfira as células progenitoras endoteliais para um tubo de microcentrifuuge para centrifugação. Para o encapsulamento de hidrogel de colágeno das células progenitoras, suspendemos a pelota de célula classificada em 200 microliters de Endotelial Growth Medium 2, suplementado com 10 micromiliter do Inibidor rock Y-27632.Adicione as células a 400 microliters de meio de semeadura em um tubo de microcentrifus de microcentrilha de 1,8 mililiter no gelo. Misture 350 microliters de colágeno na suspensão celular. A solução ficará amarela pálida.Em seguida, misture dez microlitadores de hidróxido de sódio 1-Muller na solução de colágeno e célula. A solução agora se tornará rosa brilhante. Pipeta 56 microliters desta solução de célula de colágeno neutralizada em poços individuais de uma placa de cultura de célula u de apego ultra-baixo de 96 para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius.No final da incubação, examine os poços sob um microscópio de campo brilhante para verificar se as células foram distribuídas uniformemente. Em seguida, adicione 100 microliters de endotelial médio 2 recém-preparado, complementado com inibidor de ROCHA e Fator de Crescimento Endotelial Vascular para cada poço e devolva a placa à incubadora Celsius de 37 graus. Após uma semana de cultura, adicione 250 microlitadores de 4%paraformaldeído a um poço de 48 placas de poço por hidrogel e remova o meio dos hidrogéis.Em seguida, use pinças de ponta fina para transferir os hidrogéis para o paraformaldeído contendo poços. Após 10 minutos em temperatura ambiente, lave rapidamente os hidrogéis com PBS e permeabilize as culturas 3D com 250 microliters de um surfactante não iônico de 0,5% por cinco minutos à temperatura ambiente. Lave os hidrogéis com duas lavagens de cinco minutos à temperatura ambiente com 250 microliters de PBS, complementados com 300 mililitros de glicina por lavagem, seguido pela imersão de cada hidrogel em 250 microliters de tampão de bloqueio por 30 minutos à temperatura ambiente.Rotule as células com os anticorpos primários apropriados diluídos no bloqueio durante a noite a quatro graus Celsius, seguido por duas lavagens em reagente 0,5% emulsionante e PBS de Dulbecco. Após a segunda lavagem, rotule as células com o anticorpo secundário específico da espécie apropriada por duas horas à temperatura ambiente protegida da luz, antes de lavar as culturas 3D duas vezes em reagente emulsionante de 0,5% e pbs de Dulbecco, como demonstrado. Para visualizar os núcleos celulares, adicione DAPI, diluído a uma concentração de 1 a 10000 em PBS às amostras para uma incubação de dois minutos à temperatura ambiente, seguido por duas lavagens em reagente 0,5% emulsificante e PBS de Dulbecco.Em seguida, use pinças de ponta fina para transferir cada amostra para um vaso de visualização apropriado. Após a diferenciação, classificação e encapsulamento em hidrogéis de colágeno, as células normalmente permanecerão arredondadas por 24 horas, antes de começar a migrar e formar lúmens iniciais. Após cerca de seis dias de cultura, um plexo capilar primitivo será visível no hidrogel quando visto com microscopia de campo brilhante.Após a imagem dos hidrogéis fixos, manchados e carregados de células em um microscópio confocal, as imagens pré-processadas são convertidas em um esqueleto que permite uma análise do comprimento geral e conectividade da rede. É imprescindível adicionar antibióticos após o FACS, pois a esterilização do interior deste instrumento é difícil, e remover os antibióticos 24 horas após o encapsulamento celular. Utilizando esta técnica, pudemos determinar quais características físicas e químicas a matriz extracelular imitando biomateriais regem o potencial vasculogênico dos progenitores endoteliais derivados derivados do iPSC.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

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Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Biologia do Desenvolvimento

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

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Desenvolvimento de um<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensaio para avaliar contrátil Função de células mesenquimais que a transição epitelial-mesenquimal Sofreu

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

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In vitro e in vivo em modelos para o Estudo de Transição da córnea endotelial-mesenquimal

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas

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Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

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The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

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O ensaio de co-cultura anel aórtico: Uma ferramenta conveniente para avaliar o potencial angiogênico das células estromais mesenquimais em Vitro

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Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

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Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Incorporando um grânulo de célula endotelial brotando ensaio pericitos

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Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...