Name: an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors
Uploaded: 2019-05-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors at JoVE.com

Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği (hibe numarası 15, 25740035, J.Z.), Ulusal Sağlık Enstitüsü Biyomedikal görüntüleme ve Biyomühendislik (NıBıB) Ulusal sağlığı (Grant numarası EB007507, C.C. tarafından verilir) tarafından destekleniyordu ve Rejeneratif rehabilitasyon araştırmaları & eğitimi (AR3T, Grant numarası 1 P2C HD086843-01, J.Z. ' a verilir) için Ittifak. Prof. Jeanne Stachowiak 'ı (Austin 'deki Texas Üniversitesi) Konfokal mikroskopiye yönelik teknik tavsiyelerini kabul etmek istiyoruz. Biz de Samuel Mihelic (Austin University of Texas), Dr Alicia Allen (Texas University of Austin), Dr Julie Rytlewski (Adaptive Biotech) ve Dr Leon Bellan (Vanderbilt Üniversitesi) ile tartışmalar için minnettarız 3B ağların Hesaplamalı analizi. Son olarak, ISC-EPs içine iPSCs ayrım hakkında onun tavsiyesi için Dr Xiaoping Bao (Kaliforniya Üniversitesi, Berkeley) teşekkür ederiz.

1. Kültür Medya ve kaplama çözümlerinin hazırlanması
<ol><li>Vitronektin kaplama çözeltisi hazırlamak için, Dulbecco fosfat-tampon tuz (DPBS) içinde seyreltmeli vitronektin 1:100. DIKKAT: seyreltilmiş bir kez, bu çözümün gelecekteki kullanım için depolanmasý önerilmez.</li>
	<li>Fenol kırmızı-ücretsiz aldıktan sonra, büyüme faktörü-azaltılmış jelatinli protein karışımı (bkz . malzeme tablosu) üreticiden, buz üzerinde çözülür 4 ° c karışımı şeffaf ve s...

<ol>
	<li>Wang, K., Lin, R. -. Z., Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+human+vascular+networks:+trends+and+directions+in+endothelial+and+perivascular+cell+sources.">Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).</li><li>Kant, R. J., Coulombe, K. L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+approaches+to+spatiotemporally+directing+angiogenesis+in+host+and+engineered+tissues.">Integrated approaches to spatiotemporally directing angiogenesis in host and engineered tissues.</a> Acta Biomaterialia. 69, 42-62 (2018).</li><li>Briquez, P. S., Clegg, L. E., Martino, M. M., Mac Gabhann, F., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+for+therapeutic+angiogenic+materials.">Design principles for therapeutic angiogenic materials.</a> Nature Reviews Materials. 1 (1), 1-15 (2016).</li><li>Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endothelial+cell+tube+formation+assay+on+basement+membrane+turns+20:+State+of+the+science+and+the+art.">The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: State of the science and the art.</a> Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).</li><li>Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+potential+of+endothelial+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+form+microvascular+networks+in+3D+cultures.">Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).</li><li>Nakatsu, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF121+and+VEGF165+regulate+blood+vessel+diameter+through+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+in+an+in+vitro+angiogenesis+model.">VEGF121 and VEGF165 regulate blood vessel diameter through vascular endothelial growth factor receptor 2 in an in vitro angiogenesis model.</a> Laboratory Investigation. 83 (12), 1873-1885 (2003).</li><li>Shamloo, A., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+density+mediates+polarization+and+lumen+formation+of+endothelial+sprouts+in+VEGF+gradients.">Matrix density mediates polarization and lumen formation of endothelial sprouts in VEGF gradients.</a> Lab on a Chip. 10 (22), 3061 (2010).</li><li>Jeon, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+3D+functional+microvascular+networks+with+human+mesenchymal+stem+cells+in+microfluidic+systems.">Generation of 3D functional microvascular networks with human mesenchymal stem cells in microfluidic systems.</a> Integrative Biology. 6 (5), 555-563 (2014).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Kusuma, S., Macklin, B., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+network+formation+of+vascular+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation and network formation of vascular cells from human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1202, 1-9 (2014).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Kusuma, S., Shen, Y. -. I., Hanjaya-Putra, D., Mali, P., Cheng, L., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+vascular+networks+from+human+pluripotent+stem+cells+in+a+synthetic+matrix.">Self-organized vascular networks from human pluripotent stem cells in a synthetic matrix.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12601-12606 (2013).</li><li>Charwat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+limitations+of+microscopy+and+Raman+spectroscopy+for+live-cell+analysis+of+3D+cell+cultures.">Potential and limitations of microscopy and Raman spectroscopy for live-cell analysis of 3D cell cultures.</a> Journal of Biotechnology. 205, 70-81 (2015).</li><li>Holnthoner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+induce+vascular+tube+formation+of+outgrowth+endothelial+cells+in+a+fibrin+matrix.">Adipose-derived stem cells induce vascular tube formation of outgrowth endothelial cells in a fibrin matrix.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 9 (2), 127-136 (2012).</li><li>Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+tool+for+quantitative+analysis+of+vascular+networks.">A computational tool for quantitative analysis of vascular networks.</a> PLoS ONE. 6 (11), 1-12 (2011).</li><li>Khoo, C. P., Micklem, K., Watt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+for+quantifying+angiogenesis+in+the+Matrigel+assay+in+vitro.">A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (9), 895-906 (2011).</li><li>Rytlewski, J. A., Geuss, L. R., Anyaeji, C. I., Lewis, E. W., Suggs, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+image+quantification+as+a+new+morphometry+method+for+tissue+engineering.">Three-dimensional image quantification as a new morphometry method for tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (7), 507-516 (2012).</li><li>Kerschnitzki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+osteocyte+network+correlates+with+bone+material+quality.">Architecture of the osteocyte network correlates with bone material quality.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 28 (8), 1837-1845 (2013).</li><li>Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+endothelial+progenitor+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+Wnt+activation+under+defined+conditions.">Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via Wnt activation under defined conditions.</a> Wnt Signaling: Methods and Protocols. 1481 (1), 183-196 (2016).</li><li>Crosby, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+vasculogenic+potential+of+iPSC-derived+endothelial+progenitors+in+collagen+hydrogels.">Quantifying the vasculogenic potential of iPSC-derived endothelial progenitors in collagen hydrogels.</a> Tissue Engineering Part A. , (2019).</li><li>Li, C. H., Tam, P. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+iterative+algorithm+for+minimum+cross+entropy+thresholding.">An iterative algorithm for minimum cross entropy thresholding.</a> Pattern Recognition Letters. 19 (8), 771-776 (1998).</li><li>Kollmannsberger, P., Kerschnitzki, M., Repp, F., Wagermaier, W., Weinkamer, R., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+world+of+osteocytes:+Connectomics+of+the+lacuno-canalicular+network+in+bone.">The small world of osteocytes: Connectomics of the lacuno-canalicular network in bone.</a> New Journal of Physics. 19 (7), (2017).</li><li>Crosby, C. O., Zoldan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+the+physical+cues+of+the+ECM+in+angiogenic+biomaterials.">Mimicking the physical cues of the ECM in angiogenic biomaterials.</a> Regenerative Biomaterials. , (2019).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J., Ph, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+extracellular+matrix+density+and+mesenchymal+stem+cells+on+neovascularization+in+vivo.">Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 905-914 (2011).</li><li>Ghajar, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+matrix+density+on+the+regulation+of+3-D+capillary+morphogenesis.">The effect of matrix density on the regulation of 3-D capillary morphogenesis.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1930-1941 (2008).</li><li>Morin, K. T., Smith, A. O., Davis, G. E., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligned+human+microvessels+formed+in+3D+fibrin+gel+by+constraint+of+gel+contraction.">Aligned human microvessels formed in 3D fibrin gel by constraint of gel contraction.</a> Microvascular Research. 90, 12-22 (2013).</li><li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+at+a+glance.">The extracellular matrix at a glance.</a> Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).</li></ol>

Bu protokol, üç hücre kültürü ortamındaki hücrelerin uzun vadeli kültürünü içerir: E8, LaSR basal ve EGM-2. Bu nedenle, tüm malzemeleri uygun sterilize etmek için büyük bir özen yapılmalıdır. Laboratuvarın laminar akış kaputunda çalışırken Ayrıca, laboratuar Mont ve etanol temizlenmiş eldiven her zaman giyilmelidir. Sık Mikoplazma kontaminasyonu için test edilmesi tavsiye edilir; IPSC kültürü sırasında büyük miktarda enkaz gözlenirse veya farklılaşma verimliliğinde ani bir düş...

İnsan göbek ven endotel hücreleri (huvecs) ve diğer primer endotel hücre tipleri iki yıldır kan damar çimlenme ve geliştirme in vitro1model için kullanılmıştır. Bu tür vasküler platformlar kardiyovasküler hastalığın moleküler ve doku seviyesi mekanizmalarını aydınlatmaya söz verir ve ilkel vasküler ağlar2,3' ün gelişmesine fizyolojik anlayış sunabilir. Vasküler modelleme alanı önemli gelişmeler tanık olmasına rağmen, niceliksel olarak model ve fizyolojik vasküler gelişimi değerlendirmek olabilir bir "altın standart" tahlil zor kalır. En çok yayınlanan protokoller, Olgun, fonksiyonel kan damarlarının oluşumunu teşvik etmek için damar niş veya niceliksel olarak değerlendirilen hücre türlerinin vasculogenik potansiyelini üç boyutta karşılaştırmak için bir yöntem yok yeterli özetlemek yok ( 3D).
Birçok mevcut damar modelleri fizyolojik vasküler niş taklit yeteneğini sınırlıdır. En sık kullanılan in vitro platformlardan biri jelatinli protein karışımı bazlı tüp oluşumu tahlil olduğunu. Kısaca, huvecs, murine sarkomu ekstrellüler matrisinden (ECM) hasat edilen proteinlerden oluşan ince bir jel katmanında tek hücreler olarak toplanır; bir ila iki gün içinde, HUVECs kendi kendine ilkel tüpler içine monte4. Ancak, bu süreç iki boyutlu oluşur (2D) ve endotel hücreleri (ECs) bu tahlil içinde kullanılan kapalı formu yok, boş lümen, böylece bu çalışmaların fizyolojik önemini sınırlandırmak. Daha yakın zamanda, ECS ve destekleyici hücreler (örn., mezenkimal kök hücreler (MSCS) ve perikayt), yerel ECM 'nin fibröz mimarisini simüle eden, kollajen veya fibrin hidrojellerin5gibi 3D mikro ortamlarda ortak kültürlü olmuştur. Bu mikroortamda vasküler gelişimi modellemek için, ECs ile kaplı polimerik boncuk genellikle6istihdam edilmektedir. Eksojen büyüme faktörleri ve/veya büyüme faktörleri interstitially hidrojel gömülü diğer hücreler tarafından salgılanan ek ECS, kaplama polimerik boncuklar, filiz ve tek lümen oluşturmak için; lahanası ve damarların sayısı ve çapı daha sonra hesaplanabilir. Ancak, bu lahanası tekil ve fizyolojik koşullarda görülen ve böylece daha fazla bir tümör damar modeli anımsatan bir kapalı, bağlı ağ oluşturmayın. Mikrofluidik cihazlar da vasküler niş taklit ve ak-yüklü Hidrojeller7,8damar oluşumunu teşvik etmek için kullanılmıştır. Genellikle, bir anjiyojenik büyüme faktörü-gradyan ak göç ve sprouting teşvik etmek için dolaşım hücre kültür ortamına uygulanır. Geliştirilen damarların lümeni oluşturan ECs, mikrofluidik cihazla sıvı akışının uygulanması ile indüklenen kesme stresine duyarlıdır; Bu nedenle, bu mikrofluidik cihazlar statik modellerde erişilmeyen anahtar fizyolojik parametreleri yakalar. Ancak, bu cihazlar pahalı mikroimalat yetenekleri gerektirir.
En önemlisi, üç vasküler model (2D, 3D, microfluidic), birincil ECs 'nin yanı sıra primer destek hücresi tiplerini de ezici bir şekilde kullanır. Hücreler implantasyon üzerine bağışıklık tepkisi doğuracak çünkü Primer hücreler etkili bir kardiyovasküler tedavi haline olamaz; Ayrıca, HUVECs ve benzer primer hücre tipleri hasta spesifik değildir ve genetik bir eğilim veya önceden mevcut sağlık koşulları, örneğin, diabetes mellitus olan hastalarda meydana Vasküler anomaliler yakalamak değil. İndüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) insan vücudunda tüm somatik hücrelere ayırt edilebilir bir hasta spesifik, proliferatif hücre kaynağı olarak son on yıl içinde ortaya çıkmıştır9. Özellikle, protokollerin oluşturulması ve IPSC-türetilen endotel ataları (IPSC-EPS)10,11; IPSC-EPs bipotent ve olabilir, bu nedenle, daha fazla endotel hücreleri ve pürüzsüz Kas hücreleri/perikayt, Olgun, fonksiyonel damar yapı taşları ayırt edilebilir. Sadece bir çalışma, bir 3D mikro12' de IPSC-EPS ' d a k i primer kapiller plekpmanın gelişimini inandırıcı bir şekilde ayrıntılıdır; Bu çalışma, IPSC-EP montajının ve doğal ve sentetik hidrojellerin farklılaşması açısından kritik öneme sahip olsa da, elde edilen damardaki ağ topolojilerini niceliksel olarak karşılaştırmadı. Başka bir son çalışma huvecs ve IPSC-türetilen ECS5çimlenme karşılaştırmak için polimerik boncuk modeli kullandı. Bu nedenle, 3D mikro ortamlarda IPSC-EP vaskülojenez düzenleyen fiziksel ve kimyasal sinyalizasyon mekanizmaları daha fazla aydınlatmak ve bu hücrelerin iskemik tedavi ve kardiyovasküler hastalık için uygun olup olmadığını belirlemek için net bir ihtiyaç vardır Modelleme.
Son on yıl içinde, vasküler ağ uzunluğunu ve bağlantısını ölçmek ve karşılaştırmak için farklı açık kaynaklı Hesaplamalı boru hatları ve çerçeve yapısı çıkarma algoritmaları geliştirilmiştir. Örneğin, charwat et al. bir fibrin matriks13,14, Adipose türetilen kök hücreleri ve büyüme ECS bir Co-kültürü türetilen vasküler ağlar süzülmüş, binarized görüntü ayıklamak için bir Photoshop tabanlı boru hattı geliştirdi. Belki de en yaygın olarak kullanılan topoloji karşılaştırma aracı AngioTool, Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından online yayınlanan bir program15; programın yaygın kabulü ve iyi belgelenmiş sadakat rağmen, program iki boyut ve diğer programlar, AngioSys ve Wimasis de dahil olmak üzere gemi benzeri yapıları analiz sınırlıdır, pay aynı dimensionality sınırlama16. Imaris, Lucis ve MetaMorph gibi güçlü yazılım paketleri, mühendislik microvasculature ağ topolojisini analiz etmek için geliştirilmiştir; Ancak, bu süitler en akademik laboratuvarlar için maliyet-yasaktır ve kaynak koduna erişimi sınırlamak, hangi Son Kullanıcı yeteneğini kendi özel uygulama algoritması özelleştirmek için engel olabilir. 3D dilimleyici, bir açık kaynak manyetik rezonans görüntüleme/bilgisayarlı tomografi paketi, etkili 3D vasküler ağlar topolojisi analiz edebilir bir vasküler modelleme Toolkit içerir17; Ancak, analiz Kullanıcı el ile büyük bir veri kümesi analiz ederken sıkıcı hale gelebilir ve kullanıcının bilinçaltı önyargıları tarafından etkilenebilir ağın son noktaları yerleştirerek bağlıdır. Bu yazıda, 3D vasküler ağları ölçebilir bir hesaplama boru hattı ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Yukarıdaki özetlenen sınırlamaları aşmak için, bu açık kaynak hesaplama boru hattı, 3B hacmi bir iskelet analizörüne yüklemek için elde edilen Konfokal görüntüleri önceden işlemek için ımagej kullanır. İskelet analizörü, paralel bir medial eksen inceltme algoritması kullanır ve aslen Kerschnitzki ve Al tarafından geliştirilmiştir. osteosit ağlarının uzunluğunu ve bağlantısını analiz etmek18; Bu algoritma, mühendislik microvasculature uzunluğu ve bağlantı karakterize etmek için etkili bir şekilde uygulanabilir.
Tamamen, bu protokol 3D mikroortamlarda mikrovasküler ağlar oluşturulmasını özetliyor ve kolayca IPSC-EPs vasculogenik potansiyelini karşılaştırmak için bir açık kaynak ve Kullanıcı-önyargı ücretsiz hesaplama boru hattı sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Angiogenesis</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>N/A</td>
			<td>A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td>Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td>Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12634010</td>
			<td>The base media for iPSC-EP differentiation.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barnstead GenPure xCAD Plus&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50136165</td>
			<td>Water purification system; others can be readily substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A8412</td>
			<td>To preserve cell viability when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34-PE, human (clone: AC136)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-140</td>
			<td>Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>LC Laboratories</td>
			<td>C-6556</td>
			<td>Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg</td>
			<td>VWR</td>
			<td>354249</td>
			<td>Main component of the 3D microenvironment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical centrifuge tubes (15/50 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-959-49D/A</td>
			<td>Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D1306</td>
			<td>To counterstain and visualize cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320-082</td>
			<td>For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>To wash monolayer cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8008</td>
			<td>For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>PromoCell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td>Promotes endothelial cell viability and proliferation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1517001&#160;&#160;</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine,BioUltra, for molecular biology, &#62;=99.0% (NT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>50046</td>
			<td>Neutralizes remaining detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,&#62;=95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td>Component of iPSC-EP differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>1.8.0_152</td>
			<td>Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>356231</td>
			<td>Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-199 10X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1825015</td>
			<td>Used to balance final hydrogel osmolarity and pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (1.7 mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-294</td>
			<td>Stores small volumes of reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3813</td>
			<td>The main ingredient of the immunostaining solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165 Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>293-VE</td>
			<td>Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine phalloidin</td>
			<td>Themo Fisher Scientific</td>
			<td>R415</td>
			<td>To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100 (nonionic surfactant)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td>Detergent used to gently permeabilize cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20 (emulsifying reagent)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337</td>
			<td>Increases the binding specificity of the added antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VE-Cadherin (F-8)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9989&#160;</td>
			<td>To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitronectin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A14700</td>
			<td>For maintenance of pluripotent stem cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1049</td>
			<td>Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro 3d model and computational pipeline to quantify the vasculogenic potential of ipsc-derived endothelial progenitors

İndüklenen pluripotent kök hücreleri (iPSCs), herhangi bir somatik hücre tipine ayırt edilebilir bir hastaya özgü, proliferatif hücre kaynağıdır. Olgun, fonksiyonel damar montajı için gerekli hücre türlerine ayırt edilebilir bipotent endotel ataları (EPS), embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücrelerden elde edilmiştir. Ancak bu hücreler, üç boyutlu ortamlarda titizlikle değerlendirilmemiştir ve vasculogenik potansiyelinin nicel bir ölçüsüdür zor kalır. Burada, floresan-aktif hücre sıralama yoluyla IPSC-EPs üretimi ve yalıtım ilk özetlenmiştir, kollajen Hidrojeller içinde IPSC-EPs kapsülleme ve kültürün bir açıklamasını izledi. Bu hücre dışı matris (ECM)-mikroortamı taklit etmek, sağlam bir vasculogenik tepkisi teşvik eder; Kültür bir hafta sonra vasküler ağlar formu. Bu vasculogenik yanıtı ölçmek için açık kaynaklı yazılım kullanan bir hesaplama boru hattı oluşturulması belirlendi. Bu boru hattı özellikle dalların sayısını, dallanma noktalarını ve minimum kullanıcı girişine sahip toplam ağ uzunluğunu belirlemek için kılcal plekpların 3D mimarisini korumak için tasarlanmıştır.

Farklılaşma sonra (Şekil 1), FACS ve kollajen Hidrojeller Içinde IPSC-EPS kapsülleme, hücreler genellikle yuvarlanacak kalır 24 saat önce göç ve form ilk lümen başlamak için. Yaklaşık 6 gün sonra kültür, ilkel bir kılcal plekbe görünür olacak hidrojel aydınlık alan mikroskobu ile görünürken (Şekil 2). Bir Konfokal mikroskop üzerinde sabit, lekeli hücre yüklü hidrojellerin görüntüleme sonra (<str...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors at JoVE.com

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

İndüklenen pluripotent kök hücrelerinden (IPSC-EPs) elde edilen endotel progenatörler, kardiyovasküler hastalık tedavilerinin devrimleştirilmesi ve daha sadık kardiyovasküler hastalık modellerinin oluşturulmasını sağlamak için potansiyele sahiptir. Burada, üç boyutlu (3D) kollajen mikroortamlarda IPSC-EPs kapsülleme ve bu hücrelerin vasculogenik potansiyelinin nicel Analizi açıklanmıştır.

Bir In vitro 3D model ve hesaplamalı boru hattı PSC-türetilen endotel progenitors Vazculogenik potansiyelini ölçmek için

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Protokolümüz, modellemede kardiyovasküler hastalık tedavisi için mühendislik fonksiyonel vaskülatür yardımcı olabilecek vaskülogenezmoleküler ve toplu doku düzeyi mekanizmaları benzersiz anlayışlar sağlar. Bu protokol, çeşitli platformların vaskülojenik potansiyelini değerlendirmek için sağlam, üç boyutlu vasküler ağların oluşturulmasına olanak sağlar ve aynı zamanda nihai ağ topolojisini analiz etmek için ücretsiz, açık kaynak hesaplamalı bir boru hattı sağlar. D5D6 farklılaşmış hücre kültürünün kuyubaşına 250 mikrolitre hücre ayırma çözeltisi ekleyerek 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca başlayın.Kuluçka sonunda, hücreleri tek hücresüspansiyonlarına ayırmak için P1000 pipet ucu kullanın. Santrifüj için hücre çözümlerini tek bir 15 mililitrelik konik tüpte birleştirin. Biz buz soğuk sıralama tampon 200 mikrolitre pelet askıya ve konsantre floresan beş mikrolitre ile hücreleri etiket CD34 antikor 10 dakika boyunca dört derece santigrat.Kuluçka sonunda, hücreleri beş mililitre buz gibi soğuk sıralama tamponu içinde yıkayın. Filtre süspansiyon 40 mikrometre ile beş mililitre floresan aktif hücre sıralama içine süzgeç dökün, veya FACS, tüp. Örneği çalıştırmadan önce, negatif denetim olarak hizmet vermek için etiketlenmemiş hücrelerin hiçbirini içermeyen yüksek floresan yoğunluğunda bir bölgeyi gating, dördüncü etiketlenmemiş hücrelerin 10'da birini sıralayın.Daha sonra etiketli örneği yüksek CD34 ekspresyonuna göre indüklenen pluripotent kök hücrelerden elde edilen endotel ataları içerir. Sıralamanın sonunda, endotel atahücreleri santrifüj için bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Projen hücrelerinkolajen hidrojel kapsüllemesi için, 200 mikrolitre Endotelyal Büyüme Orta 2, ROCK Inhibitörü Y-27632 10 mikromiliter ile desteklenen sıralanmış hücre pelet askıya.Hücreleri buz üzerinde 1,8 mililitrelik mikrosentrifüge tüp içinde tohumlama orta 400 mikrolitre ekleyin. Hücre süspansiyon içine kollajen 350 mikrolitre karıştırın. Çözüm soluk sarı olacak.Sonra, kollajen ve hücre çözeltisi içine 1-Muller sodyum hidroksit on mikrolitre karıştırın. Çözüm şimdi parlak pembe olacak. Pipet 56 mikrolitre bu nötralize kollajen hücre çözeltisi bireysel kuyular içine 96 iyi ultra-düşük eki U-alt hücre kültür plakası 37 santigrat derece de 30 dakikalık kuluçka için.Kuluçka sonunda, hücrelerin eşit olarak dağıtıldığını kontrol etmek için parlak bir alan mikroskobu altında kuyuları inceleyin. Sonra taze hazırlanmış Endotel Büyüme Orta 100 mikrolitre ekleyin 2, ROCK Inhibitörü ve Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü ile desteklenen her iyi ve 37 derece Santigrat inkübatör plaka dönmek. Kültür bir hafta sonra, hidrojel başına 48 kuyu plaka bir kuyuya% 4 paraformaldehit 250 mikrolitre ekleyin ve hidrojeller orta kaldırın.Sonra kuyular içeren paraformaldehit hidrojelleri aktarmak için ince uçlu cımbız kullanın. Oda sıcaklığında 10 dakika sonra hidrojelleri PBS ile hızla yıkayın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca %0,5 iyonik olmayan yüzey aktif maddenin 250 mikrolitresi ile 3-B kültürleri permeabilize edin. Hidrojelleri oda sıcaklığında 250 mikrolitre PBS ile iki beş dakikalık yıkama ile yıkayın, yıkama başına 300 mililitre glisin ile desteklenir, ardından her hidrojelin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 250 mikrolitre bloke tamponunun daldırmasını takip edin.Hücreleri, tamponu bir gecede dört santigrat derece yle seyrelterek seyreltilmiş uygun birincil antikorlarla etiketle, bunu %0,5 emülsifiye reaktifinde ve Dulbecco'nun PBS'sinde iki yıkAma takip edin. İkinci yıkamadan sonra, 3-B kültürleri %0,5 emülsifiye reaktif ve Dulbecco'nun PBS'inde iki kez yıkamadan önce, hücreleri ışıktan korunan oda sıcaklığında iki saat boyunca uygun türlere özgü ikincil antikorla etiketlayın. Hücre çekirdeklerini görselleştirmek için, ODA sıcaklığında iki dakikalık kuluçka için PBS'de 1 ila 10000 konsantrasyonda seyreltilmiş DAPI'yi ekleyin, ardından %0,5 emülsifiye reaktifve Dulbecco'nun PBS'sinde iki yıkar.Daha sonra her numuneyi uygun bir izleme kabına aktarmak için ince uçlu cımbız kullanın. Kollajen hidrojellerde farklılaşma, sıralama ve kapsüllemeden sonra, hücreler genellikle 24 saat boyunca yuvarlak kalır, göç ve ilk lümenler oluşturmadan önce. Kültür yaklaşık altı gün sonra, ilkel bir kılcal pleksus parlak alan mikroskobu ile bakıldığında hidrojel görünür olacaktır.Bir konfokal mikroskop üzerinde sabit, lekeli, hücre yüklü hidrojeller görüntülendikten sonra, önceden işlenmiş görüntüler, ağın toplam uzunluğu ve bağlantısının analizini sağlayan bir iskelete dönüştürülür. Bu cihazın iç sterilizasyon zordur gibi, FACS sonra antibiyotik eklemek için zorunludur, ve hücre kapsülleme sonra antibiyotikler kaldırmak için 24 saat. Bu tekniği kullanarak, iPSC kaynaklı endotel atalarının vaskülojenik potansiyelini biyomateryalleri taklit eden hücre dışı matriksin hangi fiziksel ve kimyasal özelliklerini yönettiğini belirleyebildik.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Bir Gelişimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Vitro ve in vivo Modelleri Kornea Endotel-mezenkimal Geçiş Çalışması için

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Aort yüzük ortak kültür tahlil: Mezenkimal Stromal hücre Vitro anjiogenik potansiyelini değerlendirmek için uygun bir araç

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Kornea doku Mühendisliği: İnsan kornea sinir Stromal etkileşimlerin bir Vitro modeli

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Perisitlerden tahlil filizlenen bir endotel hücre boncuk birleşmeyle

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...