Name: sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos
Uploaded: 2019-05-14T13:00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

इस कार्य को NIH अनुदान 5K01OD021419-02 और नेकां राज्य पशु चिकित्सा विश्वविद्यालय कॉलेज द्वारा समर्थित किया गया था.

<ol>
	<li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos.">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li><li>Kogata, N., Howard, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-mount+immunofluorescence+protocol+for+three-dimensional+imaging+of+the+embryonic+mammary+primordium.">A whole-mount immunofluorescence protocol for three-dimensional imaging of the embryonic mammary primordium.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 18 (2), 227-231 (2013).</li><li>Santos, D., Monteiro, S., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Whole-Mount+Immunohistochemistry+of+Zebrafish+(Danio+rerio)+Embryos+and+Larvae+Protocol.">General Whole-Mount Immunohistochemistry of Zebrafish (Danio rerio) Embryos and Larvae Protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li><li>Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Sexton, J. M., Hickstein, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+KRASG12V+in+Zebrafish+Gills+Induces+Hyperplasia+and+CXCL8-Associated+Inflammation.">Expression of KRASG12V in Zebrafish Gills Induces Hyperplasia and CXCL8-Associated Inflammation.</a> Zebrafish. 12 (3), 221-229 (2015).</li><li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transparent+zebrafish:+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development.">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).</li><li>Macdonald, R., Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Immunohistochemistry.">Zebrafish Immunohistochemistry.</a> Molecular Methods in Developmental Biology. , 77-88 (1999).</li><li>Santos, C., Pinto, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Assessment+as+a+Tool+for+Investigating+Developmental+Toxicity+in+Zebrafish+(Danio+rerio).">Immunohistochemical Assessment as a Tool for Investigating Developmental Toxicity in Zebrafish (Danio rerio).</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 461-476 (2018).</li><li>Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Azuma, M., Sood, R., Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=brca2+in+zebrafish+ovarian+development,+spermatogenesis,+and+tumorigenesis.">brca2 in zebrafish ovarian development, spermatogenesis, and tumorigenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19350-19355 (2010).</li><li>Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Golden, C. D., Hickstein, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA2+and+TP53+collaborate+in+tumorigenesis+in+zebrafish.">BRCA2 and TP53 collaborate in tumorigenesis in zebrafish.</a> PLoS One. 9 (1), (2014).</li><li>van der Loos, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Immunoenzyme+Staining:+Methods+and+Visualizations+for+the+Observation+With+Spectral+Imaging.">Multiple Immunoenzyme Staining: Methods and Visualizations for the Observation With Spectral Imaging.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).</li><li>van der Loos, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunoenzyme Multiple Staining Methods. , (1999).</li><li>OCT Embedding For Cryostat Sectioning Of Embryos or Larvae [Internet]. The Zebrafish Book, 5th edition Available from: <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae">https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae</a> (2007)</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Cells+and+Tissues+for+Fluorescence+Microscopy.">Preparation of Cells and Tissues for Fluorescence Microscopy.</a> Basic Methods in Microscopy. , (2006).</li><li>The Lack of Commercial Antibodies for Model Organisms (and How You Can Deal with It) [Internet]. BenchSci Blog Available from: <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018)</li><li>Carmany-Rampey, A., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+mosaic+analysis+in+the+zebrafish.">Modern mosaic analysis in the zebrafish.</a> Methods. 39, 228-238 (2006).</li><li>Da&#8217;as, S. I., Balci, T. B., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+development+and+function+in+the+zebrafish.">Mast cell development and function in the zebrafish.</a> Methods in Molecular Biology. 1220, 29-57 (2015).</li><li>Quan, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+distribution+and+in+vitro+activities+of+the+urotensin+II-related+peptides+URP1+and+URP2+in+zebrafish:+evidence+for+their+colocalization+in+spinal+cerebrospinal+fluid-contacting+neurons.">Comparative distribution and in vitro activities of the urotensin II-related peptides URP1 and URP2 in zebrafish: evidence for their colocalization in spinal cerebrospinal fluid-contacting neurons.</a> PLoS One. 10 (3), (2015).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Sullivan-Brown, J., Bisher, M. E., Burdine, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedding,+serial+sectioning+and+staining+of+zebrafish+embryos+using+JB-4+resin.">Embedding, serial sectioning and staining of zebrafish embryos using JB-4 resin.</a> Nature Protocols. 6 (1), 46-55 (2011).</li></ol>

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

जेब्राफ़िश एक अत्यंत मजबूत मॉडल जीव है कि वर्तमान में जैव चिकित्सा अनुसंधान में विषयों की एक विस्तृत विविधता भर में प्रयोग किया जाता है. विशेष रूप से, तेजी से बाहरी विकास और ज़ेब्राफ़िश भ्रूण के translucency विवो अध्ययन में के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करते हैं. इसमें, हम अनुक्रमिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (आईएचसी) के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, क्रायोसेक्शन्ड जेब्राफ़िश भ्रूणों का विश्लेषण करते हैं। इस उपन्यास प्रक्रिया एक ही स्लाइड पर दो एंटीबॉडी के अनुक्रमिक आवेदन का उपयोग करता है, सेलुलर स्तर पर colocalized प्रोटीन की सही पहचान को सक्षम करने, जबकि ऊतक वर्गों के संरक्षण. इस प्रोटोकॉल ज़ेबराफ़िश मॉडल के साथ अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, एंटीबॉडी की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या के बाद से माउस मॉडल की तुलना में ज़ेब्राफ़िश में IF और /
intercellular बातचीत के अवलोकन के कई अध्ययनों में एक आवश्यक तत्व है, और आणविक तंत्र सेलुलर स्तर पर काम कर रहा है कि जीव स्तर पर underlie phenotypes में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. इसके अतिरिक्त, प्रोटीन अभिव्यक्ति सेलुलर समारोह के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं, खासकर जब सेल के भीतर एक साथ कई प्रोटीन की अभिव्यक्ति की जांच (सह स्थानीयकरण). हालांकि पूरे-माउंट आईएचसी और आईएफ का उपयोग आमतौर पर जेब्राफ़िश भ्रूणों में प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है1,2,3,4,5, पूरे माउंट प्रक्रियाएं हो सकती हैं सटीक colocalization डेटा प्राप्त करने के लिए समस्याग्रस्त. हमारे अनुभव में, यह ऊतक की परतों के बीच अंतर और पूरे-माउंट नमूनों में एकल सेल स्तर पर प्रोटीन अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम आम तौर पर सतह धुंधला बनाम गहरे धुंधला के बीच भेद करने में असमर्थ हो सकता है. गैर-सतहस्तर प्रोटीन अभिव्यक्ति अधिक चमकदार व्यक्त सतह स्तर अभिव्यक्ति द्वारा अस्पष्ट किया जा सकता है, परिमाणीकरण में inaccuracies के लिए अग्रणी. इसके अतिरिक्त, सबसे पारंपरिक ज़ेब्राफ़िश समाशोधन विधियों काफी विषाक्त कर रहे हैं6 और इस तरह कम उपयोग के लिए वांछनीय.
IF और IHC जैसे एंटीबॉडी-आधारित तकनीकों का उपयोग अक्सर अनुभागीय सामग्री में प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया जाता है, जो जटिल ऊतकों के भीतर एक विशेष प्रोटीन व्यक्त करने वाली असतत कोशिका आबादी की पहचान को सरल बनाते हैं। IHC आमतौर पर colocalization के लिए प्रयोग किया जाता है, सबसे अधिक बार विभिन्न मेजबान प्रजातियों में संयुग्मी दो अलग एंटीबॉडी का उपयोग करके और अलग अलग रंग क्रोमोजेन4,7,8,9के साथ कल्पना , 10. हालांकि, कई क्रोमोजेन का उपयोग करने से गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला या रंग11,12की असंगति हो सकती है।
हमने क्रायोसेक्शन्ड प्रारंभिक चरण जेब्राफ़िश भ्रूणों पर अनुक्रमिक आईएफ और आईएचसी द्वारा अनेक प्रोटीनों का पता लगाने के लिए एक नया प्रोटोकॉल विकसित किया है। क्रायोसेक्शनिंग विशेष रूप से जेब्राफ़िश भ्रूण जैसे नाजुक ऊतकों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, और क्रायोसेक्शन फ्लोरोसेंट आधारित परख13,14के लिए पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों से बेहतर हैं। हम संयुक्त IF और IHC के बजाय दोहरे रंग IF या IHC का अनुकूलन करने के लिए चुना है, एक भी परख प्रकार के लिए एंटीबॉडी असंगति की समस्या को दरकिनार करने के लिए. इन समस्याओं को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी है कि ज़ेबराफ़िश में उपयोग के लिए मान्य कर रहे हैं की सीमित संख्या के कारण जेब्राफ़िश से जुड़े अनुसंधान के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हैं. वास्तव में, चार बड़ी कंपनियों के एक अध्ययन से पता चला है कि माउस में उपयोग के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के बारे में 112,000 बनाम के बारे में 5,300 ज़ेब्राफ़िश में उपयोग के लिए15था . अंत में, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक ही cryosection पर किया जा सकता है विकसित करने के लिए चुना है, जो आवश्यक है जब छोटे या सीमित ऊतक के नमूने के साथ काम कर के रूप में इस तरह के जेब्राफ़िश भ्रूण से प्राप्त कर रहे हैं.
इस प्रोटोकॉल को 48 एच के बाद निषेचन चिमेरिक जेब्राफ़िश भ्रूणों में दाता कोशिकाओं के प्रोजीवनात्मक व्यवहार का आकलन करने के लिए डिजाइन किया गया था जो ब्लास्टुला-टू-ब्लास्टुला प्रत्यारोपण द्वारा उत्पन्न किए गए थे जैसा कि कार्मनी-रैमपे और मोन्स16द्वारा वर्णित किया गया था। दाता भ्रूण प्राप्तकर्ता भ्रूण में दाता कोशिकाओं के प्रत्यारोपण से पहले एक फ्लोरोसेंट लेबल डेक्सट्रान संयुग्मी के साथ एक सेल चरण में इंजेक्ट किया गया. हम सेर के लिए इम्यूनोफ्लोरेसिस का इस्तेमाल किया 10 फॉस्फोरीलेटिड हिस्टोन एच 3 (पीएच 3) के लिए बढ़ते कोशिकाओं का पता लगाने के लिए लेबल dextran के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा पीछा करने के लिए चिमेरिक ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में दाता कोशिकाओं का पता लगाने के लिए. pH3 का अनुक्रमिक पता लगाने और एक ही cryosection के भीतर लेबल डेक्सट्रान हमें पहचान करने के लिए सक्षम बनाने और व्यक्तिगत कोशिकाओं है कि दोनों मार्करों व्यक्त की मात्रा.
cryosectioned ज़ेब्राफ़िश के लिए यह अनुक्रमिक IF/IHC प्रोटोकॉल जेब्राफ़िश शोधकर्ताओं के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करेगा जो प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक सहस्थानीकरण प्रोटोकॉल की इच्छा रखते हैं। समस्याओं है कि इस प्रोटोकॉल को संबोधित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जैसे छोटे ऊतक नमूनों और सीमित एंटीबॉडी उपलब्धता, ज़ेब्राफ़िश मॉडल के लिए अद्वितीय नहीं हैं. अतः यह विधि अनुक्रमिक आईएफ/आईएचसी करने के इच्छुक किसी भी शोधकर्ता के लिए उपयोगी हो सकती है।
एथेंिक्स स्टेटमेंट:
सभी पशु अध्ययन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति, उत्तरी कैरोलिना राज्य विश्वविद्यालय, Raleigh, उत्तरी केरोलिना, संयुक्त राज्य अमेरिका द्वारा अनुमोदित किया गया.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1312px;" width="1312">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">15/25</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:140px;">N/A</td>
			<td style="width:813px;">15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alexa 555 secondary antibody</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:140px;">A21429</td>
			<td>used at 1:2000 dilution in block buffer for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibody Diluent</td>
			<td style="width:143px;">Dako</td>
			<td style="width:140px;">S3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Background Buster</td>
			<td style="width:143px;">Innovex</td>
			<td style="width:140px;">NB306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">block buffer (IF)</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:140px;">N/A</td>
			<td>5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cellSens imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens</td>
			<td>imaging software used with compound light microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">chimeric zebrafish embryos</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:140px;">N/A</td>
			<td>AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Compound light microscope</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:140px;">BX51</td>
			<td>used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Confocal fluorescence microscope</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:140px;">DM 2500</td>
			<td>used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td>
			<td style="width:143px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:140px;">27147-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Digital camera, light microscope</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:140px;">DP27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Digital camera, fluorescence microscope</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:140px;">TCS SPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fish gelatin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">G7041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass slides</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:140px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H325-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ImmPRESS HRP Polymer detection kit</td>
			<td style="width:143px;">Vector</td>
			<td style="width:140px;">MP-7401</td>
			<td>anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS AF 2.3.6</td>
			<td>imaging software used with confocal fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Modified Meyer&#39;s Hematoxylin</td>
			<td style="width:143px;">Thermo</td>
			<td align="right" style="width:140px;">72804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:143px;">MP Biomedical</td>
			<td align="right" style="width:140px;">191356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OCT medium</td>
			<td style="width:143px;">Tissue-Tek/Fisher</td>
			<td style="width:140px;">4583/4585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">anti-Oregon Green antibody</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Probes/Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">A889</td>
			<td>used at 1:7500 dilution for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oregon Green Dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7171</td>
			<td>used at 2.5% in 0.2M KCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde, 4%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td align="right">416780030</td>
			<td>made in lab in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Permount</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:140px;">SP15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">1X phosphate-buffered saline</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10X phoshpate-buffered saline</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>use Cold Spring Harbor protocol</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">1X PBSt</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody</td>
			<td style="width:143px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:140px;">sc-8656-R</td>
			<td>used at 1:500 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scott&#39;s Tap Water</td>
			<td style="width:143px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:140px;">26070-06</td>
			<td>have used other brands successfully in addition to EMS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sucrose</td>
			<td style="width:143px;">Amresco</td>
			<td align="right" style="width:140px;">335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TO-PRO3</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:140px;">T3605</td>
			<td>used at 1:1000 in 1x PBS for IF</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">1X Tris-buffered saline</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">10x Tris-buffered saline</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">1X TBSt</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td align="right">327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield</td>
			<td style="width:143px;">Vector</td>
			<td style="width:140px;">H-1000</td>
			<td>non-hardening mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vector NovaRed substrate</td>
			<td style="width:143px;">Vector</td>
			<td style="width:140px;">SK-4800</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos

intercellular बातचीत की जांच अक्सर विशिष्ट सेल आबादी और सटीक प्रोटीन स्थानीयकरण के असतत लेबलिंग की आवश्यकता है. जेब्राफ़िश भ्रूण एक में विवो मॉडल के साथ इस तरह की बातचीत की जांच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है। प्रोटीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए पूरे-माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख अक्सर जेब्राफ़िश भ्रूण में लागू किए जाते हैं। हालांकि, तीन आयामी अंतरिक्ष में सह-स्थानीयकृत प्रोटीन की सटीक मानचित्रण प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, कुछ अध्ययनों में दो एंटीबॉडी के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है जो एक ही तकनीक के साथ संगत नहीं हैं (उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी 1 इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए ही उपयुक्त है और एंटीबॉडी 2 इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए ही उपयुक्त है)। यहाँ वर्णित विधि का उद्देश्य प्रारंभिक चरण जेब्राफ़िश भ्रूण से व्युत्पन्न व्यक्तिगत क्रायोसेक्शन पर अनुक्रमिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस और/या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करना है। यहाँ हम एक एकल सेल स्तर पर प्रोटीन अभिव्यक्ति की सटीक पहचान प्राप्त करने के क्रम में एक ही क्रायोसेक्शन के लिए इमेजिंग इम्यूनोफ्लोरेसी, इमेजिंग, इम्यूनोफ्लोरेसीकेमिया के अनुक्रमिक दौर के उपयोग का वर्णन करते हैं। इस पद्धति के प्रारंभिक चरण ज़ेब्राफ़िश भ्रूण है कि व्यक्तिगत कोशिकाओं में कई प्रोटीन लक्ष्यों की सही पहचान की आवश्यकता में किसी भी अध्ययन के लिए उपयुक्त है.

हमने इस प्रोटोकॉल को 48 एच पोस्ट-फर्टिलाइजेशन के बाद जेब्राफ़िश भ्रूणों में व्यक्तिगत दाता कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति की पहचान और विश्लेषण करने के लिए विकसित किया है जो एबी वाइल्ड-टाइप जेब्राफ़िश भ्रूणों के बीच ब्लास्टुला-टू-ब्लास्टुला प्रत्यारोपण द्वारा उत्पन्न किए गए थे। एक-सेल स्तर पर प्रोटीन अभिव्यक्ति के सफल विश्लेषण के लिए उचित रूप से उन्मुख भ्रूणों के साथ क्रायोसेक्शन तैयार करने की आवश्यकता थी (चित्र 1 और चित्र 2) और इन के लिए आईएफ और आईएचसी तकनीकों के सावधान, अनुक्रमिक अनुप्रयोग क्राइओ सेक्शन्स (चित्र 3 और चित्र 4)। एक साथ बढ़ते कोशिकाओं का पता लगाने के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग (एंटी-पीएच3, चित्रा 5ए, बी) और दाता कोशिकाओं (एंटी-लेबल डेक्सट्रन, चित्रा 5डी) का उपयोग दाता कोशिकाओं की पहचान करने और उन्हें परिमाणित करने के लिए किया जा सकता है जो सक्रिय रूप से बढ़ रहे हैं ( चित्र 5E) अलग-अलग कोशिकाओं की सही पहचान करने के लिए IF (चित्र 2A, B) और IHC ( चित्र2D) दोनों के बाद उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को उत्पन्न करना आवश्यक है। छवि ओवरले करने के लिए एक छवि विश्लेषण प्रोग्राम का उपयोग किया जाना चाहिए (चित्र 5E)। उपयोग किए गए छवि विश्लेषण प्रोग्राम के आधार पर, लेबल किए गए कक्षों की स्वचालित गणना करना संभव हो सकता है, परिमाणीकरण वांछित होना चाहिए.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59344/59344fig1.jpg"> चित्र 1: जमे हुए ओसीटी ब्लॉक की तैयारी। (ए) ठंड के लिए तैयार क्रायोजेनिक मोल्ड में ओसीटी में भ्रूणों का 50x सूक्ष्म दृश्य। लाल तीर मोल्ड के नीचे की सतह के खिलाफ ज़ेब्राफ़िश भ्रूण की स्थिति के सिर को इंगित करता है; काला तीर उपयोगकर्ता की ओर इंगित करने वाला पूंछ इंगित करता है। (बी) भ्रूण के साथ प्लास्टिक के मोल्ड और ठंडा धातु मंच पर रखा OCT. (ग) फोम बर्फ बाल्टी ठंड कक्ष बनाने के लिए प्लास्टिक के मोल्ड ों पर रखा. (घ) ब्लॉक पूरी तरह से जमजाने के बाद ओसीटी पारदर्शी से सफेद हो जाता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59344/59344fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59344/59344fig2.jpg"> चित्र 2: जमे हुए ओसीटी ब्लॉक का क्रायोसेक्शनिंग। (क) क्रोओस्टैट डिस्क पर ताजा ओसीटी का अनुप्रयोग और ओसीटी पर जमे हुए ब्लॉक की नियुक्ति, ब्लॉक के हिम अभिविन्यास से 180 डिग्री घुमाया गया। (B) अनुभागी डिस्क पर जमे हुए ब्लॉक का साइड व्यू. (C) स्थिति में रोल प्लेट के साथ अनुभागिंग ब्लॉक का दृश्य। (घ) क्रायओस्टैट के धातु मंच से आवेशित स्लाइड का उपयोग करके अनुभागों का पिक-अप। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59344/59344fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59344/59344fig3.jpg"> चित्र 3: स्लाइड पर प्लेसमेंट के बाद तैयार अनुभागों का दृश्य. तीर हाइड्रोफोबिक बाधा इंगित करता है, और डॉटेड लाइन बाधा परिधि के भीतर वर्गों युक्त क्षेत्र delineates. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59344/59344fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59344/59344fig4.jpg"> चित्र 4: IHC के दौरान क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट आवेदन के लिए तैयारी। स्लाइड को प्लास्टिक की चादर के साथ कवर एक सपाट सतह पर रखा गया है ताकि क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट के समान आवेदन की अनुमति दी जा सके, जबकि खतरनाक सामग्री के किसी भी spillage युक्त। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59344/59344fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59344/59344fig5.jpg"> चित्र 5: क्रायोसेक्शन्ड 48 एच.पी.एफ. के प्रतिनिधि आईएफ और आईएचसी लेबलिंग 48 एच.पी.एफ. (क) यदि सेर 10 फॉस्फोरिलेट हिस्टोन एच 3 (एंटी-पीएच3, 1:200) अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए 48 एचएफ की चिमेरिक जेब्राफ़िश भ्रूण में। लाल ] pH3-सकारात्मक कोशिकाओं; नीला ] नाभिक. पीला तीर धनात्मक कोशिकाओं के उदाहरण दर्शाते हैं। (ख) डिजिटल छवि (ImageJ सॉफ्टवेयर) में नीले परमाणु दाग के घटाव परिमाणीकरण और छवि ओवरले के लिए pH3 सकारात्मक कोशिकाओं के दृश्य को बढ़ाता है. (ग) नकारात्मक नियंत्रण (माध्यमिक एंटीबॉडी केवल) के लिए यदि क्रायोसेक्शन्ड 48 एच.एफ.एफ. स्केल बार 50 डिग्री (सभी पैनलों के लिए लागू) का प्रतिनिधित्व करता है। (घ) आईएचसी एबी वाइल्ड-टाइप जेब्राफ़िश भ्रूणों के बीच ब्लास्टुला-टू-ब्लास्टुला प्रत्यारोपण द्वारा उत्पन्न चिमेरिक 48 एचपीएफ जेब्राफ़िश भ्रूण में लेबल ्डएक्स्ट्रान (एंटी-लेबल डेक्सट्रान, 1:7,500) का पता लगाने के लिए। ब्लास्टुला-टू-ब्लास्टुला प्रत्यारोपण के लिए उपयोग करने से पहले दाता भ्रूण को एक सेल चरण में एक फ्लोरोसेंट लेबल वाले डेक्सट्रान संयुग्मी के साथ इंजेक्ट किया गया था। लाल एक डेक्सट्रन संयुग्मी के साथ लेबल कोशिकाओं को इंगित करता है; नीले रंग नाभिक इंगित करता है. पीला तीर धनात्मक कोशिकाओं के उदाहरण दर्शाते हैं। (ई) पैनल बी (पीएच 3 के लिए आईएफ) और पैनल सी (लेबल ्ड्ट्रान के लिए आईएचसी) का ओवरले जिसमें अलग-अलग कोशिकाओं में पीएच3 अभिव्यक्ति और डेक्सट्रन लेबलिंग का सहस्थानीकरण दिखाया गया है। पीला तीर दोहरे-धनात्मक कोशिकाओं के उदाहरण दर्शाते हैं। (च) नकारात्मक नियंत्रण (माध्यमिक एंटीबॉडी केवल) के लिए IHC परख cryosectioned 48 hpf chimeric ज़ेब्राफ़िश भ्रूण. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59344/59344fig5large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

क्रायोसेक्शन्ड ज़ेब्राफ़िश भ्रूण पर अनुक्रमिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

यह प्रोटोकॉल विशिष्ट कोशिका आबादी में सटीक सहस्थानीकरण विश्लेषण को सक्षम करने के प्रारंभिक चरण ज़ेब्राफ़िश भ्रूण से क्रायोसेक्शन पर अनुक्रमिक इम्यूनोफ्लोरेसी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री को दर्शाता है।

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Visualizing Cells, Tissues, and Molecules

SCIENTISTS IN ACTION

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

माउस epidermis के आयल धारा पर immunohistochemistry प्रतिदीप्त एंटीबॉडी का उपयोग

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Zebrafish भ्रूण में mRNA और morpholino antisense oligonucleotides Microinjection.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Zebrafish भ्रूण के Microinjection जीन समारोह का विश्लेषण

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

दो photon axotomy और लाइव zebrafish भ्रूण में समय चूक confocal इमेजिंग

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

ट्रांसप्लांटेशन द्वारा chimeric Zebrafish भ्रूण उत्पन्न

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

दो फोटॉन आधारित लाइव Zebrafish भ्रूण में photoactivation

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

वयस्क Zebrafish में Intraperitoneal इंजेक्शन

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Zebrafish भ्रूण में मेटाबोलिक लेबल और Bioorthogonal क्लिक करें रसायन विज्ञान के द्वारा इमेजिंग glycans

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

बिजली नि: शुल्क, अनुक्रमिक न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन अलगाव

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Zebrafish भ्रूण के चयापचय प्रोफ़ाइल विश्लेषण

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...