Name: sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos
Uploaded: 2019-05-14T13:00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантом NIH 5K01OD021419-02 и Колледжем ветеринарной медицины Государственного университета ШТАТА Северная Каролина.

<ol>
	<li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos.">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), (2011).</li><li>Kogata, N., Howard, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-mount+immunofluorescence+protocol+for+three-dimensional+imaging+of+the+embryonic+mammary+primordium.">A whole-mount immunofluorescence protocol for three-dimensional imaging of the embryonic mammary primordium.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 18 (2), 227-231 (2013).</li><li>Santos, D., Monteiro, S., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+Whole-Mount+Immunohistochemistry+of+Zebrafish+(Danio+rerio)+Embryos+and+Larvae+Protocol.">General Whole-Mount Immunohistochemistry of Zebrafish (Danio rerio) Embryos and Larvae Protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li><li>Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Sexton, J. M., Hickstein, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+KRASG12V+in+Zebrafish+Gills+Induces+Hyperplasia+and+CXCL8-Associated+Inflammation.">Expression of KRASG12V in Zebrafish Gills Induces Hyperplasia and CXCL8-Associated Inflammation.</a> Zebrafish. 12 (3), 221-229 (2015).</li><li>Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transparent+zebrafish:+a+refined+method+to+improve+detection+of+gene+expression+during+embryonic+development.">Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development.</a> Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).</li><li>Macdonald, R., Guille, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Immunohistochemistry.">Zebrafish Immunohistochemistry.</a> Molecular Methods in Developmental Biology. , 77-88 (1999).</li><li>Santos, C., Pinto, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Assessment+as+a+Tool+for+Investigating+Developmental+Toxicity+in+Zebrafish+(Danio+rerio).">Immunohistochemical Assessment as a Tool for Investigating Developmental Toxicity in Zebrafish (Danio rerio).</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 461-476 (2018).</li><li>Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Azuma, M., Sood, R., Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=brca2+in+zebrafish+ovarian+development,+spermatogenesis,+and+tumorigenesis.">brca2 in zebrafish ovarian development, spermatogenesis, and tumorigenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19350-19355 (2010).</li><li>Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Golden, C. D., Hickstein, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA2+and+TP53+collaborate+in+tumorigenesis+in+zebrafish.">BRCA2 and TP53 collaborate in tumorigenesis in zebrafish.</a> PLoS One. 9 (1), (2014).</li><li>van der Loos, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Immunoenzyme+Staining:+Methods+and+Visualizations+for+the+Observation+With+Spectral+Imaging.">Multiple Immunoenzyme Staining: Methods and Visualizations for the Observation With Spectral Imaging.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).</li><li>van der Loos, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunoenzyme Multiple Staining Methods. , (1999).</li><li>OCT Embedding For Cryostat Sectioning Of Embryos or Larvae [Internet]. The Zebrafish Book, 5th edition Available from: <a target="_blank" href="https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae">https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae</a> (2007)</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Cells+and+Tissues+for+Fluorescence+Microscopy.">Preparation of Cells and Tissues for Fluorescence Microscopy.</a> Basic Methods in Microscopy. , (2006).</li><li>The Lack of Commercial Antibodies for Model Organisms (and How You Can Deal with It) [Internet]. BenchSci Blog Available from: <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018)</li><li>Carmany-Rampey, A., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+mosaic+analysis+in+the+zebrafish.">Modern mosaic analysis in the zebrafish.</a> Methods. 39, 228-238 (2006).</li><li>Da&#8217;as, S. I., Balci, T. B., Berman, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+development+and+function+in+the+zebrafish.">Mast cell development and function in the zebrafish.</a> Methods in Molecular Biology. 1220, 29-57 (2015).</li><li>Quan, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+distribution+and+in+vitro+activities+of+the+urotensin+II-related+peptides+URP1+and+URP2+in+zebrafish:+evidence+for+their+colocalization+in+spinal+cerebrospinal+fluid-contacting+neurons.">Comparative distribution and in vitro activities of the urotensin II-related peptides URP1 and URP2 in zebrafish: evidence for their colocalization in spinal cerebrospinal fluid-contacting neurons.</a> PLoS One. 10 (3), (2015).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Sullivan-Brown, J., Bisher, M. E., Burdine, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embedding,+serial+sectioning+and+staining+of+zebrafish+embryos+using+JB-4+resin.">Embedding, serial sectioning and staining of zebrafish embryos using JB-4 resin.</a> Nature Protocols. 6 (1), 46-55 (2011).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Мы представили новый метод комбинированной иммунофлуоресценции и иммуногистохимии, который представляет собой важный шаг вперед в проведении экспериментов по колокализации криосекционированных эмбрионов зебры. Существует критическое отсутствие существующих протоколов солокализации, которые оптимизированы для использования с небольшими эмбрионами и криосекционным материалом17,18, оба из которых в противном случае широко используются в молекулярных исследованиях14. Существующие протоколы солокализации в основном сосредоточены на одновременной визуализации двух фторофоров17,18. Хотя эти протоколы могут хорошо работать, их полезность ограничена наличием антител, которые (i) могут быть использованы в зебрафишах и (ii) совместимы с IF.
Мы считаем, что использование криосекции для эмбрионов зебры обеспечивает значительное преимущество с точки зрения сохранившейся морфологии тканей. Как IHC чаще выполняется на парафиновых секций, чем криосекции7,8, дальнейшее исследование криосекционных на основе методов IHC для обнаружения экспрессии белка является оправданным. Использование всего маунт IF является распространенным методом визуализации уровней экспрессии в эмбрионах зебры, и чаще описывается в литературе, чем ЕСЛИ с помощью криосекций1,2,3,4, 19. Тем не менее, целые протоколы крепления имеют ограничения, в том числе отсутствие точной локализации белков, выраженных в глубоких тканях, и потенциал для экспрессии уровня поверхности, чтобы скрыть экспрессию белка в более глубоких тканях. Мы постоянно наблюдали отличное поддержание клеточной морфологии после криоконсервации, секционирования и последовательного IF и IHC. Для приложений, требующих точной локализации экспрессии белка на одноклеточном уровне, есть значительное преимущество в секционных процедурах, как мы описали в этом протоколе. Встраивание мелины обеспечивает альтернативный вариант для выполнения анализов IF или IHC на участках с эмбрионов зебры на ранней стадии20. Разделы рецина обеспечивают превосходное сохранение морфологии тканей по сравнению с криосекциями, и относительно более тонкие участки тканей могут быть подготовлены. Тем не менее, производители, как правило, не рекомендуют использовать разделы с ыранжерства для иммуно-анализов, так как некоторые компоненты мисена не могут быть удалены из разделов и могут маскировать сайты связывания антител21.
Хотя весь протокол имеет важное значение для точного и успешного анализа шаблонов выражений, несколько конкретных шагов имеют решающее значение для экспериментального успеха. Первым важным шагом является обработка эмбрионов во время встраивания в OCT13,14. Это может быть сложной задачей, чтобы сориентировать каждый эмбрион в той же поперечной плоскости, так что разделы вырезаны примерно из той же области для всех эмбрионов. Мы обнаружили, что использование малых калибровочных игл для выполнения небольших, преднамеренных движений через вязкую среду OCT для ориентации эмбриона превосходит использование щипцы, которые являются слишком большими и вытесняют слишком много OCT среды. Второй критический шаг происходит во время секционирования замороженных блоков, так как это может быть трудно получить высококачественные разделы, которые содержат желаемую ткань (ы) без значительной подготовки и опыта. Поэтому мы рекомендуем использовать тестовые образцы до тех пор, пока техника не будет освоена. Третьим важным шагом является удаление coverslip, который имеет потенциал, чтобы нарушить или сдирать образцы тканей. Мы обнаружили, что сочетание нежного возбуждения, чтобы ослабить coverslip и медленное удаление слайда из контейнера PBS является наиболее эффективным подходом для удаления крышки. Нежная и устойчивая рука лучше; Исследователи могут обнаружить, что некоторые методы проб и ошибок необходимо, чтобы узнать, как удалить coverslips эффективно.
Дополнительные важные шаги в протоколе включают оптимизацию антител (первичные и вторичные антитела как для анализов IF, так и IHC) и воздействие слайдов на хромогенный субстрат и противопоказания. Тщательное исследование в отношении первичной специфичности антител и целевой концентрации имеет важное значение; как правило, лучше всего собрать достаточное количество недрагоценных образцов, по крайней мере, для двух отдельных экспериментов для ИФ и IHC, которые будут проводиться для оптимизации концентраций первичных антител до начала комбинации IF/IHC. Включение известного положительного и отрицательного контроля для каждого первичного антитела имеет важное значение в каждом эксперименте, чтобы гарантировать, что как IF и IHC анализы работают надлежащим образом. Также могут потребоваться корректировки вторичной концентрации антител. Требуется оптимизация воздействия секций тканей на хромогенный субстрат и противопят для анализа IHC, так как руководящие принципы производителя часто описывают широкий диапазон возможных сроков воздействия. Не все хромогены могут быть совместимы с контрпятнами и эндогенной пигментацией тканей, требующими тщательного планирования в отношении выбора хромогенов.
Есть множество потенциальных изменений, которые могут быть применены к описанному протоколу, и мы успешно выполнили этот протокол с другими комбинациями антител, которые не могут быть использованы как для IF. Как упоминалось выше, хромогенные вещества имеют различную совместимость с конкретными контрпятнами. Мы обнаружили, что эти компоненты легко изменяются в протоколе. Кроме того, параметры для инкубации антител достаточно гибкие, и могут быть увеличены или уменьшены в зависимости от желаемой интенсивности окрашивания. Процесс встраивания также может быть изменен. В то время как мы сосредоточились на поперечных секциях, эмбрионы могут быть легко ориентированы в любом направлении для решения конкретных тканей, представляющих интерес. Наконец, в этом протоколе есть несколько возможных точек паузы. Обезвоженые эмбрионы могут храниться в 100% MeOH при -20 градусах по Цельсию в течение нескольких месяцев; замороженные блоки могут храниться при -80 градусов по Цельсию в течение трех месяцев; и подготовленные слайды могут храниться при -80 градусов по Цельсию в течение девяти месяцев в слайд-поле.
Из-за относительной сложности этого комбинированного протокола IF/IHC существует множество возможных источников вариаций или ошибок, которые могут потребовать устранения неполадок, начиная от качества ткани и кончающего опыта и кикс-обработки. Большинство критических шагов, описанных выше, считаются критическими, поскольку они либо требуют оптимизации на индивидуальном уровне пользователя, либо требуют определенной ловкости, навыков и опыта. Тем не менее, мы обнаружили, что неспецифические фоновые окрашивания и низкой интенсивности сигнала являются наиболее важными вопросами, требующими оптимизации. Как и в любом протоколе IF или IHC, решение этих вопросов может занять много времени и трудоемким, и может быть усугублено этим методом, так как эти два метода объединены. По этой причине мы настоятельно рекомендуем оптимизировать IF и IHC отдельно, прежде чем приступить к комбинированному протоколу.
Хотя мы прогнозируем, что этот метод будет полезен для широкого спектра экспериментов, существуют потенциальные ограничения. Успешное выполнение этой процедуры зависит от поддержания нетронутых образцов тканей через два последовательных экспериментов, которые включают многочисленные шаги мытья. По этой причине любые проблемы, возникающие во время секционирования или обработки тканей, включая использование старых слайдов, которые, возможно, деградировали по качеству, значительно ограничат способность исследователей успешно выполнять этот протокол. Хотя слайды потенциально могут храниться при -80 градусов по Цельсию в течение девяти месяцев, присоединение тканей к слайдам снижается с течением времени, и мы имели лучший успех со слайдами, которые используются в течение месяца подготовки или в идеале, на следующий день. Вторым ограничением является небольшой след эмбрионов зебры. Хотя мы обнаружили, что этот эксперимент будет полезным в визуализации белков, которые относительно обильно выражены в эмбрионах на ранних стадиях, белки, которые выражаются непоследовательно или на низких уровнях, может быть очень трудно захватить в разделе. Наконец, поскольку в протоколе используются криосекции 10-х u201222м, он лучше всего подходит для оценки экспрессии белка в более крупных структурах, таких как ядра, а не меньше субклеточных компонентов.
Таким образом, наш комбинированный протокол IF/IHC будет выгоднее для широкого спектра исследований эмбрионов зебры на ранних стадиях и представляет собой важное новшество в точном анализе экспрессии белка в таких образцах. Наш метод, успешно показанный на рисунке 5, позволит исследователям сохранить деликатную морфологию эмбрионов зебры на ранней стадии в криосекциях при работе с несколько ограниченным диапазоном имеющихся в настоящее время первичных антител, которые проверены для использования в IF или IHC в этом виде. Этот протокол, вероятно, будет полезен для исследований в других видов рыб и земноводных (например, Медака и Xenopus spp.), которые препятствуют аналогичным ограничениям на доступность антител, и могут быть применимы к традиционным моделям млекопитающих как Хорошо.

Зебрафиш является чрезвычайно надежной моделью организма, которая в настоящее время используется в самых различных дисциплинах в биомедицинских исследованиях. В частности, быстрое внешнее развитие и прозрачность эмбрионов зебры являются отличным инструментом для исследований in vivo. Здесь мы описываем метод последовательного иммунофлуоресценции (ИФ) и иммуногистохимический (IHC) анализ криосекционных эмбрионов зебры. Эта новая процедура использует последовательное применение двух антител на одном слайде, что позволяет точно идентифицировать colocalized белки на клеточном уровне при сохранении секций тканей. Этот протокол особенно полезен для исследований с моделью зебры, так как относительно небольшое количество антител было проверено для использования в приложениях IF and/or IHC в зебрафишах по сравнению с моделями мыши.
Наблюдение межклеточных взаимодействий является важным элементом во многих исследованиях, и может обеспечить ключевое понимание молекулярных механизмов, функционирующих на клеточном уровне, которые лежат в основе фенотипов на уровне организма. Кроме того, экспрессия белка может дать информацию о клеточной функции, особенно при изучении экспрессии нескольких белков одновременно внутри клетки (колокализация). Хотя цельномонтаж IHC и ЕСЛИ являются широко используемыми методамидля анализа экспрессии белка в эмбрионах зебры 1,2,3,5,целые процедуры крепления могут быть проблематичным для получения точных данных о колокализации. По нашему опыту, может быть трудно различать слои ткани и визуализировать экспрессию белка на одноклеточном уровне в цельномонтажных образцах. Воображение программ ных программ, как правило, не в состоянии различать поверхности окрашивания по сравнению с глубоким окрашивание. Неповерхностные протеиновые выражения могут быть скрыты более ярко выраженным выражением уровня поверхности, что приводит к неточностям в количественной оценке. Кроме того, большинство традиционных методов очистки зебры являются довольно токсичными6 и, таким образом, менее желательныдля для использования.
Методы на основе антител, такие как IF и IHC, часто используются для обнаружения экспрессии белка в секционированном материале, упрощая идентификацию популяций дискретных клеток, которые выражают определенный белок в сложных тканях. IHC обычно используется для колокализации, чаще всего с помощью двух различных антител, спряженныху разных видов хозяев и визуализированных с различными цветными хромогенами 4,7,8,9 , 10. Однако, использование нескольких хромогенов может привести к неспецифическим фоновым окрашиванием или несовместимости цветов11,12.
Мы разработали новый протокол для обнаружения нескольких белков последовательными IF и IHC на криосекционных эмбрионах зебры на ранней стадии. Криосекция особенно хорошо подходит для деликатных тканей, таких как эмбрионы зебры, и криосекции превосходят парафин встроенных разделов для флуоресценции на основе анализов13,14. Мы решили оптимизировать комбинированные IF и IHC, а не двухцветный IF или IHC, чтобы обойти проблему несовместимости антител для одного типа асссе. Эти проблемы особенно актуальны для исследований с участием зебры из-за ограниченного количества коммерчески доступных антител, которые проверяются для использования в зебрафиш. В самом деле, исследование четырех крупных компаний показали, что коммерчески доступные антитела для использования в мыши было около 112000 против около 5300 для использования в зебрафиш15. Наконец, мы решили разработать протокол, который может быть выполнен на одном криосекции, что имеет важное значение при работе с небольшими или ограниченными образцами тканей, такими как полученные из эмбрионов зебры.
Этот протокол был разработан для оценки пролиферативного поведения донорских клеток в 48 ч после оплодотворения эмбрионов химерных зебры, которые были созданы путем пересадки бластулы до бластулы, как описано Кармани-Рампе и Moens16. Эмбрионы доноров вводились на одноклеточной стадии с флуоресцентно помечены dextran конъюгировать до трансплантации донорских клеток в эмбрионы реципиента. Мы использовали иммунофлуоресценцию для S 10 фосфорилированных Histone H3 (pH3) для обнаружения размножающихся клеток, а затем иммуногистохимии для помечены dextran для обнаружения донорских клеток в химерных эмбрионов зебрафиш. Последовательное обнаружение pH3 и помеченного декеспна в пределах одной криосекции позволило нам определить и количественно определить отдельные клетки, которые выражали оба маркера.
Этот последовательный протокол IF/IHC для криосекционных зебр ыбры станет полезным инструментом для исследователей зебры, которые желают протокола колокализации для экспрессии белка. Проблемы, которые этот протокол был разработан для решения, такие как небольшие образцы тканей и ограниченной доступности антител, не являются уникальными для модели зебры. Таким образом, этот метод может быть поймем любому исследователю, желая выполнить последовательный IF/IHC.
ЗАЯВЛЕНИЕ ОБ ЭТИКЕ:
Все исследования на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию, Университетом штата Северная Каролина, Роли, Северная Каролина, США.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1312px;" width="1312">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">15/25</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:140px;">N/A</td>
			<td style="width:813px;">15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alexa 555 secondary antibody</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:140px;">A21429</td>
			<td>used at 1:2000 dilution in block buffer for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Antibody Diluent</td>
			<td style="width:143px;">Dako</td>
			<td style="width:140px;">S3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Background Buster</td>
			<td style="width:143px;">Innovex</td>
			<td style="width:140px;">NB306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">block buffer (IF)</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:140px;">N/A</td>
			<td>5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cellSens imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens</td>
			<td>imaging software used with compound light microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">chimeric zebrafish embryos</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:140px;">N/A</td>
			<td>AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Compound light microscope</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:140px;">BX51</td>
			<td>used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Confocal fluorescence microscope</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:140px;">DM 2500</td>
			<td>used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td>
			<td style="width:143px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:140px;">27147-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Digital camera, light microscope</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:140px;">DP27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Digital camera, fluorescence microscope</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:140px;">TCS SPE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td>Koptec</td>
			<td>V1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fish gelatin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">G7041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass slides</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:140px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>H325-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ImmPRESS HRP Polymer detection kit</td>
			<td style="width:143px;">Vector</td>
			<td style="width:140px;">MP-7401</td>
			<td>anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LAS AF 2.3.6</td>
			<td>imaging software used with confocal fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Modified Meyer&#39;s Hematoxylin</td>
			<td style="width:143px;">Thermo</td>
			<td align="right" style="width:140px;">72804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:143px;">MP Biomedical</td>
			<td align="right" style="width:140px;">191356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OCT medium</td>
			<td style="width:143px;">Tissue-Tek/Fisher</td>
			<td style="width:140px;">4583/4585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">anti-Oregon Green antibody</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Probes/Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">A889</td>
			<td>used at 1:7500 dilution for IHC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oregon Green Dextran</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7171</td>
			<td>used at 2.5% in 0.2M KCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde, 4%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td align="right">416780030</td>
			<td>made in lab in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Permount</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:140px;">SP15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">1X phosphate-buffered saline</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10X phoshpate-buffered saline</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>use Cold Spring Harbor protocol</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">1X PBSt</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody</td>
			<td style="width:143px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:140px;">sc-8656-R</td>
			<td>used at 1:500 dilution for IF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Scott&#39;s Tap Water</td>
			<td style="width:143px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:140px;">26070-06</td>
			<td>have used other brands successfully in addition to EMS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sucrose</td>
			<td style="width:143px;">Amresco</td>
			<td align="right" style="width:140px;">335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TO-PRO3</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:140px;">T3605</td>
			<td>used at 1:1000 in 1x PBS for IF</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">1X Tris-buffered saline</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">10x Tris-buffered saline</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">1X TBSt</td>
			<td>made in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td align="right">327371000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vectashield</td>
			<td style="width:143px;">Vector</td>
			<td style="width:140px;">H-1000</td>
			<td>non-hardening mounting media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vector NovaRed substrate</td>
			<td style="width:143px;">Vector</td>
			<td style="width:140px;">SK-4800</td>
			<td>HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos

Исследование межклеточных взаимодействий часто требует дискретной маркировки конкретных популяций клеток и точной локализации белка. Эмбрион зебры является отличным инструментом для изучения таких взаимодействий с моделью in vivo. Цельно-монтажные иммуногистохимические и иммунофлуоресцентные анализы часто применяются в эмбрионах зебры для оценки экспрессии белка. Однако в трехмерном пространстве может быть трудно получить точное отображение колокализованных белков. Кроме того, некоторые исследования могут потребовать использования двух антител, которые не совместимы с той же техникой (например, антитела 1 подходит только для иммуногистохимии и антитела 2 подходит только для иммунофлюоресценции). Целью описанного в настоящем году метода является проведение последовательной иммунофлуоресценции и/или иммуногистохимии на отдельных криосекциях, полученных из эмбрионов зебры на ранних стадиях. Здесь мы описываем использование последовательных раундов иммунофлуоресценции, визуализации, иммуногистохимии, визуализации для одного криосекции для достижения точной идентификации экспрессии белка на одноклеточном уровне. Эта методология подходит для любого исследования эмбрионов зебры на ранних стадиях, что требует точного определения нескольких белковых целей в отдельных клетках.

Мы разработали этот протокол для того, чтобы определить и проанализировать экспрессию белка в отдельных донорских клетках в 48 h после оплодотворения эмбрионов химерных зебры, которые были получены в результате пересадки бластулы до бластрула между эмбрионами зебры AB дикого типа. Успешный анализ экспрессии белка на одноклеточном уровне требовал подготовки криосекций с соответствующим ориентированными эмбрионами(рисунок 1 и рисунок2) и тщательного, последовательного применения методов IF и IHC к этим криосекции(рисунок 3 и рисунок4). Использование специфических антител для одновременного обнаружения размножающихся клеток (анти-pH3, Рисунок 5A, B) и донорских клеток (анти-маркированный декстран, Рисунок 5D)может быть использован для выявления и количественной оценки донорских клеток, которые активно размножаются ( Рисунок 5E). Для точной идентификации отдельных ячеек необходимо создавать высококачественные изображения как по if(рисунок 2A,B) и IHC (рисунок2D). Программа анализа изображений должна использоваться для выполнения наложения изображений(рисунок 5E). В зависимости от используемой программы анализа изображений, можно будет выполнять автоматизированные подсчеты помеченных ячеек, если будет желательна количественная оценка.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59344/59344fig1.jpg"> Рисунок 1: Приготовление замороженных блоков OCT. (A) 50x микроскопический вид эмбрионов в OCT в криогенной формы, подготовленной для замораживания. Красная стрелка указывает на положение эмбриона зебры на нижней поверхности плесени; черная стрелка указывает на хвост, указывающий на пользователя. (B) Пластиковые формы с эмбрионами и OCT размещены на охлажденной металлической платформе. (C) Пена льда ведро размещены над пластиковыми плесенью для создания замораживания камеры. (D) OCT становится белым от прозрачного, как только блок полностью заморожен. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59344/59344fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59344/59344fig2.jpg"> Рисунок 2: Криосекция замороженных блоков OCT. (A), Применение свежего OCT на криостатный диск и размещение замороженного блока на OCT, вращается на 180 градусов от замораживания ориентации блока. (B) Вид смота блока, замороженного на секционный диск. (C) Вид разделительного блока с рулонной пластиной в положении. (D) Пикап секций с помощью заряженного слайда с металлической платформы криостата. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59344/59344fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59344/59344fig3.jpg"> Рисунок 3: Просмотр подготовленных разделов после размещения на слайде. Стрелка указывает на гидрофобный барьер, а пунктирная линия разграничает зону, содержащую участки внутри барьерного периметра. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59344/59344fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59344/59344fig4.jpg"> Рисунок 4: Подготовка к применению хромогенного субстрата во время IHC. Слайд помещается на плоскую поверхность, покрытую полиэтиленовой пленкой, чтобы обеспечить равномерное применение хромогенного субстрата при одновременном содержании любого разлива опасного материала. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59344/59344fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59344/59344fig5.jpg"> Рисунок 5: Представитель IF и IHC маркировки криосекционных 48 л.с. химерных эмбрионов зебры, порожденных бластулой-к-бластулальной трансплантации между AB дикого типа эмбрионов зебры. (A) ЕСЛИ для обнаружения Ser 10 фосфорилированных Histone H3 (анти-pH3, 1:200) выражение в 48 л.с. химерных эмбрионов зебры. Красные и рН3-положительные клетки; синие и ядра. Желтые стрелки указывают на примеры положительных клеток. (B) Вычитание синего ядерного пятна в цифровом изображении (программное обеспечение ImageJ) повышает визуализацию pH3-положительных ячеек для количественной оценки и наложения изображения. (C) Отрицательный контроль (только вторичные антитела) для IF-исследования в криосекционном 48 л.с. химерного эмбриона зебры. Шкала бар представляет 50 мкм (применяется ко всем панелям). (D) IHC обнаружить помечены dextran (анти-маркированные dextran, 1:7,500) в химерных 48 л.с. зебрафиш эмбриона, порожденных бластулой-к-бластула трансплантации между AB дикого типа эмбрионов зебры. Эмбрионы доноров были введены с флуоресцентно помечены dextran конъюгировать на одноклеточной стадии до использования для blastula-к-blastula трансплантации. Красный цвет указывает на клетки, помеченные dextran conjugate; синий указывает на ядра. Желтые стрелки указывают на примеры положительных клеток. (E) Наложение панели B (IF для pH3) и панели C (IHC для помеченных dextran) показаны colocalization выражения pH3 и dextran маркировки в отдельных клетках. Желтые стрелки указывают на примеры двойных положительных клеток. (F) Отрицательный контроль (только вторичные антитела) для IHC асссев в криосекционном 48 л.с. химерного эмбриона зебры. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59344/59344fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos at JoVE.com

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Последовательная иммунофлуоресценция и иммуногистохимия на криосекционированных эмбрионах зебры

Этот протокол демонстрирует последовательную иммунофлуоресценцию и иммуногистохимию на криосекциях эмбрионов зебры на ранних стадиях, что позволяет проводить точные анализы колокализации в конкретных популяциях клеток.

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...

Этот протокол демонстрирует новую процедуру последовательного иммунофторесценции и иммуногистохимии на криосекциях с ранней стадии эмбройс-зебры, которая позволяет проводить точные анализы совместной локализации в конкретных популяциях клеток. Основным преимуществом этого протокола является гибкость. Он сочетает в себе иммунофторесценцию и иммуногистохимию методов с использованием одной криозации для максимизации морфологии тканей, совместной локализации экспрессии и совместимости антител.Этот протокол может быть применен к другим рыбам или амфибии модели, как эти исследователи часто сталкиваются с аналогичными осложнениями с наличием антител и часто выполняют аналогичные типы экспериментов. Работа с ранней стадии криозирования эмбрионов может быть сложно, поскольку они малы и криозирование может быть сложной задачей, но передовая подготовка и практика поможет облегчить любую борьбу в этом методе. Есть несколько шагов в нашем протоколе, которые требуют особой обработки и ухода и может быть трудно освоить, не видя, кто-то продемонстрировать методы.Для начала, передача предыдущих фиксированных и подготовленных сорок восемь часов после оплодотворения химерных эмбрионов зебры из трубки с 15 25 OCT смеси пластиковой формы с использованием тибры минимизации любой передачи смеси. Заполните форму примерно наполовину со средой OCT и аккуратно смешайте эмбрионы в ней. Подготовка помечены пластиковые формы и передачи желаемых эмбрионов в пустые помечены пластиковые формы, сводя к минимуму перенос OCT среды.Затем аккуратно заполните ОКТ среды в верхней части формы с эмбрионами. Работая под световым стерео микроскопом для визуализации, используйте иглы для организации эмбрионов в нужной ориентации. Затем поместите подготовленные формы в изолированный контейнер с металлической платформой и заморозьте их на сухом льду.Поместите ведро со льдом мягко над металлической платформой, чтобы создать холодную камеру и заморозить в течение примерно 30 минут. Используя криостат, установленный при температуре минус 20 градусов по Цельсию, вырезать встроенные эмбрионы в 10 до 12 микрометров толщиной cryosections при проверке глубины раздела периодически на микроскоп для мониторинга местоположения и ткани. Поместите секции на заряженные стеклянные горки и высушите их при комнатной температуре на ночь.Вымойте слайды три раза в течение пяти минут в 1X PBS в соответствующем контейнере. Положите горки на плоскую поверхность во влажной камере. Используйте барьерную ручку, чтобы наметить разделы, чтобы сохранить жидкость на слайдах.Pipette 200 микролитров блока буфера на секцию и инкубировать в буфере блока в течение двух часов при комнатной температуре. Подготовка первичного разбавления антител и блокировать буфер и хорошо перемешать с помощью пипетки. Аккуратно наконечник слайды слить буфер блока и вернуться во влажную камеру.Pipette 200 микролитров первичного раствора антител на секцию на слайдах и 200 микролитров буфера блока на соответствующие разделы в качестве контроля. Инкубировать слайды при четырех градусах по Цельсию на ночь во влажной камере, наполненной деионизированной водой убедившись, чтобы запечатать края камеры, чтобы помочь сохранить влагу. Вымойте слайды три раза в течение пяти минут в 1X PBS и в соответствующем контейнере.Подготовка вторичного разбавления антител во время стирки и блок буфера и хорошо перемешать путем пипетки. После укладки слайдов на плоскую поверхность во влажную камеру добавьте 200 микролитров вторичного раствора антител на секцию. Инкубировать слайды в вторичном растворе антител при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.Вымойте слайды три раза в течение пяти минут в 1X PBS в соответствующем контейнере. После размещения слайдов на плоской поверхности, добавить ядерный раствор окрашивания на каждой секции и инкубировать покрыты в течение 10 минут. После слива ядерного раствора окрашивания, смонтировать слайды с не-затвердевания флуоресцентных монтажных средств и стеклянной крышкой скольжения.Убедившись, чтобы держать их в темноте при четырех градусах по Цельсию до визуализации. Поместите слайды в отдельных контейнерах с 1X PBS и хранить плоские при четырех градусах по Цельсию на ночь, в то время как осторожно агитирует, чтобы ослабить крышку скользит достаточно, чтобы они будут отключаться, когда взволнован. Убедитесь в том, чтобы не давить на крышку скольжения или попытаться удалить крышку скольжения вручную, но ждать, пока они отходят с минимальными принудительного движения.После того, как крышка скользит были удалены, осторожно передать слайды в контейнер со свежим 1X PBS. Удалите 1X PBS и инкубировать слайды в 1X три-буферный солевой раствор с 0,1% неионных сурфактант три раза в течение пяти минут при комнатной температуре. Инкубировать слайды в 3%перекиси водорода раствор при комнатной температуре в течение 15 минут.Затем положите слайд плоским и добавить блок буфера падение мудрым на поверхность. Аккуратно наконечник слайдов слейте буфер блока. Высушите область вокруг секций и поместите горки во влажную камеру.Добавьте 200 микролитров раствора первичного антитела на секцию на слайды и инкубировать во влажной камере при четырех градусах Цельсия за одну ночь. Аккуратно наконечник слайды слить первичный раствор антитела и мыть два раза в течение пяти минут в 1X TBST. Затем нанесите готовый к использованию фон снижения блокирующих реагентов падение мудрым для каждого раздела, и инкубировать во влажной камере при комнатной температуре в течение 20 минут.Аккуратно наконечник слайдов слейте буфер блока. Тщательно высушите область вокруг секций и поместите горки плоскими во влажную камеру. Применить готовый к использованию вторичный раствор антитела для каждого раздела падение мудрым и инкубировать во влажной камере при комнатной температуре в течение 30 минут.Аккуратно наконечник слайды слить вторичного раствора антитела и мыть два раза в течение пяти минут в 1X TBST. После высыхания области вокруг секций, поместите слайды на плоскую поверхность и добавить 200 микролитров хромогенного субстрата HRP к каждому разделу. Запустите таймер, когда субстрат был применен к первому слайду и инкубировать при комнатной температуре в течение трех минут.Слейте с субстрата раствор. Промыть горки кратко в соответствующем контейнере с 1X PBS и мыть их в деионизированной воде дважды в течение пяти минут с нежным возбуждением. Counterstain слайды, поместив их в гематоксилин окрашивания раствора на срок до 30 секунд и мыть три раза в течение пяти минут каждый в деионизированной воде.Инкубировать горки в контейнере, содержащем Tapwater Скотта в течение одной минуты, а затем мыть снова три раза в течение пяти минут в деионизированной воде. Обезвоживать слайды через ряд сортов этанола, разбавленных в деионизированной воде и ксилена в химическом капюшоне. После удаления слайдов из ксилена сразу же добавить толуол на основе монтажа среды и место крышки скольжения.Для обеспечения успеха при скольжении крышки, важно работать с одной стороны слайда на другую, медленно опуская крышку скольжения для предотвращения пузырьков, которые бы скрыть ткани. Наконец, визуализировать и изображение слайдов с помощью соединения световой микроскоп и цифровая камера на 100X увеличение. Специфические антитела, используемые здесь для одновременного выявления размножающихся клеток и донорских клеток, идентифицируют и количественно идентифицируют донорские клетки, которые активно размножаются.После иммунофторесценции и иммуногистохимии необходимо создавать высококачественные изображения, чтобы точно идентифицировать отдельные клетки. Для выполнения наложения изображений использовалась программа анализа изображений. При попытке этой процедуры наиболее важно адекватно пятно и счетчик пятно слайды во время иммуногистохимии.После этой процедуры дополнительные методы могут быть выполнены в качестве модификаций к первоначальному протоколу, таких как использование различных комбинаций антител, типов тканей или видов. Изображения также могут быть проанализированы различными способами для получения соответствующих данных. Этот метод позволил нам взглянуть на колокализации и несколько генетических фонов, как способ исследования клеток к клеткам взаимодействия и могут быть применены аналогично другим методам, требующим детального анализа совместной локализации.Многие из реагентов в иммуногистохимии являются опасными и должны рассматриваться соответствующим образом. Работа с этанолом, ксиленом и монтажной жесткой должна выполняться в капюшоне. Dab отходы должны быть утилизированы в качестве опасных отходов и после DAB моет должны быть отбеленные.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Visualizing Cells, Tissues, and Molecules

SCIENTISTS IN ACTION

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

Иммуногистохимии на парафиновых срезах Мыши Эпидермис Использование флуоресцентных антител

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

Микроинъекция мРНК и Олигонуклеотиды морфолино антисмысловых в данио рерио эмбрионов.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Микроинъекции данио рерио Эмбрионы для анализа функции гена

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Двухфотонное axotomy и покадровой конфокальной микроскопии в живых эмбрионов данио рерио

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation

Создание химерных эмбрионов данио рерио по трансплантации

One of the most powerful tools used to gain insight into complex developmental processes is the analysis of chimeric embryos. A chimera is defined as an ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Два-Фотон основе Фотоактивация в Живом данио рерио Эмбрионы

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Внутрибрюшинного введения в взрослых данио рерио

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Изображений гликанов в данио рерио Эмбрионы от метаболического Маркировка и Bioorthogonal химии нажмите

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Электричество-Free, последовательное нуклеиновых кислот и белков изоляции

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

Метаболический Анализ профиля эмбрионов данио рерио

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...