Name: crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

تلقى هذا المشروع تمويلاً من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحث والابتكار في أفق 2020 بموجب اتفاق المنحة رقم 686070 (DD-DeCaf) و764591 (SynCrop)، ومن برنامج البحث "لبنات الحياة" الذي يحتوي على رقم المشروع 737.016.005 من قبل المنظمة الهولندية للبحث العلمي. وقد حظيت هذه الوظيفة بدعم من الجمعية الملكية (منحة UF160357) وشركة BrisSynBio، وهي مركز بحوث البيولوجيا التركيبية التابع لـ BBSRC/EPSRC (grant BB/L01386X/1). نشكر زي دي وجيفري فان فيك على مساهمتهما في تجارب اكتشاف الخميرة لخلق الفن بكسل الخميرة.

<ol>
	<li>Knott, G. J., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+guides+the+future+of+genetic+engineering.">CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering.</a> Science. 361 (6405), 866-869 (2018).</li><li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+metabolic+engineering+using+an+orthogonal+tri-functional+CRISPR+system.">Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system.</a> Nature Communications. 8 (1), 1688 (2017).</li><li>Li, Z. -. H., Liu, M., Lyu, X. -. M., Wang, F. -. Q., Wei, D. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+facilitated+large+fragment+deletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).</li><li>Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+facilitated+multiple-chromosome+fusion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).</li><li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Abudayyeh, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector.">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Makarova, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+evolutionary+classification+of+CRISPR-Cas+systems.">An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).</li><li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovi&#269;, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA.">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae.+using+the+CRISPR/Cas+System.">Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601 (2018).</li><li>Ferreira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+CRISPR/Cas9+genome+editing+and+gene+regulation+using+Csy4+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).</li><li>Swarts, D. C., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+versus+Cas12a/Cpf1:+Structure&#8211;function+comparisons+and+implications+for+genome+editing.">Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure&#8211;function comparisons and implications for genome editing.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481 (2018).</li><li>Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Basis+for+DNA+Target+Specificity+of+CRISPR-Cas12a.">Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a.</a> Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).</li><li>Verwaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+beta-carotene+in+Saccharomyces+cerevisiae.+by+successive+transformation+with+carotenogenic+genes+from+Xanthophyllomyces+dendrorhous.">High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).</li><li>Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+enables+fast+and+simple+genome+editing+of+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).</li><li>Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+advances+engineering+of+microbial+cell+factories.">CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories.</a> Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).</li><li>Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3 (11), 3647 (2008).</li><li>Franklin, R. E., Gosling, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+configuration+in+sodium+thymonucleate.">Molecular configuration in sodium thymonucleate.</a> Nature. 171, 740-741 (1953).</li><li>Watson, J. D., Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structure+for+deoxyribose+nucleic+acid.">A structure for deoxyribose nucleic acid.</a> Nature. 171, 737-738 (1953).</li><li>Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+deoxypentose+nucleic+acids.">Molecular structure of deoxypentose nucleic acids.</a> Nature. 171, 738-740 (1953).</li><li>Young, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+algorithm-guided+design+of+massive+strain+libraries,+applied+to+itaconic+acid+production+in+yeast.">Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast.</a> Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).</li><li>Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cloning Method. , (2013).</li><li>Mandel, M., Higa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+bacteriophage+DNA+infection.">Calcium-dependent bacteriophage DNA infection.</a> Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).</li><li>Van Dijken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interlaboratory+comparison+of+physiological+and+genetic+properties+of+four+Saccharomyces+cerevisiae+strains.">An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains.</a> Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Acids Research. 19 (20), 5791 (1991).</li><li>Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+genomic+DNA+from+yeasts+for+PCR-based+applications.">Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications.</a> Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).</li><li>Tak, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+multiplex+gene+regulation+using+CRISPR-Cpf1-based+transcription+factors.">Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors.</a> Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+editing+by+CRISPR-Cpf1+using+a+single+crRNA+array.">Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array.</a> Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).</li><li>Swiat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FnCpf1:+a+novel+and+efficient+genome+editing+tool+for+Saccharomyces+cerevisiae.">FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cpf1-Assisted+Multiplex+Genome+Editing+and+Transcriptional+Repression+in+Streptomyces.">CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces.</a> Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1.">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell Discovery. 3, 17018 (2017).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).</li><li>Perez, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GuideScan+software+for+improved+single+and+paired+CRISPR+guide+RNA+design.">GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).</li><li>Cox, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Biology+Open+Language+Visual+(SBOL+Visual)+Version+2.0.">Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0.</a> Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).</li></ol>

ويعلن صاحبا البلاغ وجود تضارب في المصالح. وقد أودع المؤلفون الملكية الفكرية المتعلقة بالأساليب المقدمة.

يصف البروتوكول المقدم تحرير الجينوم المتعدد من S. cerevisiae باستخدام Cas12a من بكتيريا Lachnospiraceae ND2006 في تركيبة مع صفيف crRNA واحد والحمض النووي المانح. يتم شرح تصميم مجموعة crRNA واحدة والحمض النووي للجهة المانحة بالتفصيل. على النقيض من نظام كريسبر / Cas9 الراسخة، وCRISPR / Cas12a لديه قدرة إضافية فريدة من نوعها لمعالجة crRNAs متعددة أعرب عنها من مجموعة crRNA واحدة13،33. ونظرًا لهذه الميزة، يكون من الأسهل إعداد التحرير المتزامن لأهداف متعددة ويمكن تحقيقه في تحويل واحد. وقد أظهر هذا النهج صفيف crRNA واحد من قبل Zetsche وآخرون. 34 الذين حرروا في وقت واحد ما يصل إلى أربعة جينات في خلايا الثدييات باستخدام AsCas12a، وسويات وآخرون. 35 الذين أدخلوا أربع شظايا الحمض النووي في جينوم الخميرة باستخدام FnCas12a. على حد علمنا، لم يتم الإبلاغ عن عدد أكبر من التعديلات الجينية المتزامنة باستخدام نظام Cas12a ولم يتم بعد تحديد الحد الأقصى للأهداف لكل صفيف واحد لCas12a. مزيد من البحوث باستخدام صفائف crRNA واحدة في تركيبة مع Cas12a يتضمن تنظيم النسخ متعددة في مجموعة واسعة من الكائنات الحية33،36،37.
هناك بعض الخطوات الهامة في البروتوكول المعروض. تصميم بعناية جميع تسلسلات الحمض النووي التي تشارك في تجربة تحرير الجينوم Cas12a، وخاصة في حالة إدخال تسلسل الحمض النووي الجديد. تحديد وظيفة تسلسلات فاصلة جديدة جزء من crRNA، على سبيل المثال من خلال تجربة تحرير الجينوم singleplex كما هو موضح من قبل Verwaal وآخرون. 19 قبل الجمع بينهما في مجموعة crRNA واحدة. اتبع التوصيات لإعداد حلول التحول العازلة المستخدمة في تجربة تحرير Cas12a لتحقيق كفاءة تحويل جيدة من الخميرة.
هناك بعض التعديلات الاختيارية لهذه التقنية. من المستحسن استخدام 1 ميكروغرام من كل DNA المانح، الخطيpRN1120 أو واحد crRNA صفيف التعبير كاسيت في التحول، على الرغم من أن استخدام كمية الحمض النووي أقل من المتوقع أيضا أن يؤدي إلى كفاءة التحول مرضية. إجراء تحويل اختبار لتحديد ما إذا كان يمكن استخدام كميات الحمض النووي أقل. يمكن إجراء تحويل S. cerevisiae باستخدام طريقة مختلفة عن الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول، على سبيل المثال البروتوكول الذي وصفه Gietz وآخرون. (2007) 38.دليل RNA المتلقي بلازميد pRN1120 هو مناسبة للتعبير عن crRNA واحد ومجموعة crRNA واحدة من مختلف المتغيرات Cas12a (علىسبيل المثال، من Acidaminococcus spp. BV3L6 أو فرانسيسيلا novicida U112) وكذلك للتعبير عن sgRNA في تركيبة مع Cas919. ولا يلزم أن يقتصر الحمض النووي للجهة المانحة على أشرطة التعبير الجيني الكاروتينية والمناطق المحيطة التي تستهدف الحمض النووي للجهات المانحة إلى مواقع INT1 وINT2 وINT3 الموصوفة في الحمض النووي الجيني. ويمكن إدخال أي حمض نووي ذي أهمية، بطريقة متعددة، في الحمض النووي الجيني للمضيف من خلال مبادئ التصميم الموصوفة في هذا البروتوكول، أو بدلاً من ذلك يمكن استخدام الحمض النووي للمانحين لحذف الحمض النووي من الجينوم المضيف. هيكل وحدات من مجموعة crRNA واحدة يسهل سهولة التكيف من فاصل وتسلسل تكرار مباشر. ويسمح تعديل تسلسلات الحيز بإحداث تغيير في موضع التكامل المقصود الذي يمكن تصميمه بواسطة إحدى الأدوات لتحديد موقع هدف جيني، مثل برنامج GuideScan 1.039. فبدلاً من استخدام تسلسلات محيطية كبيرة تحتوي على تسلسلات موصلات، يمكن إدراج 50 نقطة أساس للمنطقة المحيطة في تسلسلات الحمض النووي للجهات المانحة عن طريق إدراج هذه التسلسلات المحيطة بالمنطقة التي تبلغ 50 نقطة أساس في المواد التمهيدية المستخدمة في PCR. في هذه الحالة، في المجموع، هناك حاجة فقط ثلاثة بدلا من تسعة أجزاء الحمض النووي المانحة لتجربة تحرير الجينوم متعددة الناجحة.
وباختصار، يوفر هذا البروتوكول توجيهات خطوة بخطوة لإجراء تحرير الجينوم المتعدد في S. cerevisiae باستخدام Cas12a في تركيبة مع نهج صفيف crRNA واحد. وقد تجلى البروتوكول في تحرير الجينوم المتعدد باستخدام 9 أجزاء من الحمض النووي للمانحين وترميز صفيف crRNA واحد لثلاث مرات. نعرض ترددات تحرير عامة عالية تتراوح بين 50% و94% لتصاميم السلالة الثلاثة التي تم الإبلاغ عنها هنا. ختاما، والسمة الفريدة من Cas12a هو القدرة على معالجة مجموعة crRNA واحدة في crRNAs الفردية في الخلية، مما يجعل Cas12a أداة ممتازة لتمكين تحرير الجينوم متعددة وتطوير وحدات التنظيم النسخي التي تستهدف متعددة أشرطة التعبير في واحد على سبيل العمل. في النهاية، تم الحصول على ثلاث سلالات تنتج الكاروتينات على مستوى مختلف والألوان في ظلال بين الأصفر والبرتقالي. مع تلك السلالات وسلالة من نوع البرية، أظهرنا كيف يمكن استخدام معالج السائل الصوتية مباشرة لجعل الخميرة بكسل الفن - وهذا تكريما لروزاليند فرانكلين الذي ساهم في اكتشاف هيكل الحمض النووي قبل 65 عاما من قبل صورتها الشهيرة 5123< /c1>.

وقد أحدثت إنزيمات كريسبر/كاس ثورة بلا شك في البيولوجيا الجزيئية واعتمدت على نطاق واسع كأدوات للجينوم الهندسي بسرعة لم تكن مجدية من قبل1. وقد أبلغ ديكارلو وآخرون عن التعديل الأول للجينوم السكري من قبل نظام تحرير الجينوم CRISPR/Cas9. 2، مما يدل على نجاح الجينات بالضربة القاضية وجعل الطفرات نقطة باستخدام oligonucleotides المقدمة خارجيا. وشملت التطورات الخميرة كريسبر مربع الأدوات الأخرى: تنظيم النسخ عن طريق دمج القتلى غير النشط الحفاز Cas9 (dCas9) مع المجالات تأثير النسخ لتمكين تفعيل وإسكات النسخ3، وتطبيق لكلا تحرير الجينوم والوظائف التنظيمية لهندسة المسار الأيضي عنطريق التنشيط المتزامن، والقمع والحذف 4، حذف أجزاء كبيرة من الجينوم S. سيريفيسياي 5،والانصهارات الكروموسوم المتعددة6 .
توجد أنظمة تحرير الجينوم CRISPR/Cas أصلها في أنظمة المناعة التكيفية للبكتيريا وarchaea وقد تم تكييف هذه الأنظمة من قبل علماء الأحياء الجزيئية لتحرير الجينوم. وتستند وظائفها على متفاوتالمسافات بانتظام قصيرة Palindromic يكرر (كريسبر) مناطق الحمض النووي ترميز RNA المسؤولة عن الاعتراف الحمض النووي الأجنبي أو الحمض النووي الريبي والجينات المرتبطة كريسبر (كاس) الذي ترميز RNA-guided 1 ,7,8,9. واستنادا إلى تحليل الجينوم الأخير لأنظمة كريسبر/كاس، اقتُرح تقسيم نظم كريسبر/كاس إلى فئتين، خمسة أنواع و 16 نوعا فرعيا10. يتم تمييز الفئتين على أساس تنظيم المجمعات التأثيرية المشاركة في الانقسام المستهدف. عادة، يتم تصنيف أنظمة CRISPR/Cas مع مؤسسة متعددة الوحدات الفرعية على أنها فئة 1، في حين أن مجمعات تأثير الوحدة الفرعية الأحادية تنتمي إلى الفئة 210و11 . في هذه الورقة، ونحن استكشاف فئة 2 نوع V Cas12a، ودعا سابقا Cpf110،12، وهو بديل للفئة 2 من النوع الثاني Cas9. على الرغم من أن Cas9 يتميز بشكل جيد ويستخدم على نطاق واسع في البحوث، Cas12a يقدم ميزات إضافية12. أولا، Cas12a يشكل مجمع مع RNA كريسبر (crRNA) من 42 إلى 44 النيوكليوتيدات دون الحاجة إلى تحويل تنشيط إضافية كريسبر RNA (تراكررنا). لذلك، يمكن استخدام الحمض النووي الريبي دليل أقصر في تحرير الجينوم مع أنظمة CRISPR/Cas12a مقارنة مع CRISPR/Cas9. ثانيا، فإن النشاط الفريد من الإندونوكليس وendoribonuclease من Cas12a تمكن من النضج من قبل crRNA13. يسمح هذا النشاط RNase لترميز crRNAs متعددة على صفيف crRNA كريسبر واحد، في حين يتطلب Cas9 التعبير منفصلة عن كل ما يسمى الحمض النووي الريبي دليل واحد (sgRNA) أو بدلا من ذلك على سبيل المثال التعبير عن endonuclease إضافية ( على سبيلالمثال، Csy4) في تركيبة مع زخارف الاعتراف لCsy4 المحيطة بكل sgRNA14،15. ثالثاً، يتطلب التعرف على الموقع المستهدف Cas12a عزر متجاوب (PAM) في نهاية 5'من الهدف ويشق بعد وضع +18/+23 من PAM مما أدى إلى وجود الحمض النووي المُشق مع نهايات لزجة، في حين يتطلب Cas9 وجود بام يقع على الطرف 3 من الهدف ويشق بعد موقف -3 خلق تخفيضات نهاية حادة في الحمض النووي12. رابعا، تسلسل النيوكليوتيد توافق الآراء من PAM يختلف بين Cas12a ((T)TTV) وCas9 (NGG)، مما يجعل Cas12a مرشحا واعدا لاستهداف T-الغنية المروج وتسلسل المنهي16. وأخيرا، أفادت دراسة حديثة عن خصوصية هدف أكبر لCas12a من السكان الأصليين Cas917.
نقدم بروتوكولًا لاستخدام نظام CRISPR/Cas12a لتحرير الجينوم من S. cerevisiae مع التركيز بشكل خاص على إدخال أشرطة تعبير الحمض النووي المتعددة في موضع الجينوم المستقل في وقت واحد (تحرير الجينوم المتعدد) باستخدام تحرير الجينوم المتعدد) باستخدام صفيف crRNA واحد. يتم تصوير الخطوات الرئيسية للبروتوكول في الشكل 1. وكدليل على المفهوم، طُبق نظام CRISPR/Cas12a لإدخال ثلاثة أشرطة تعبير في جينوم S. cerevisiae التي تمكن من إنتاج β-carotene18 كما هو مبين تخطيطيا في الشكل 2. إنتاج بيتا كاروتين يؤثر على النمط الظاهري من S. سيريفيسياي: أي، عند إدخال ناجح لجميع الجينات الثلاثة غير المتجانسة المطلوبة للتخليق البيولوجي الكاروتينات، وخلايا S. cerevisiae البيضاء تتحول إلى اللون الأصفر أو البرتقالي، اعتمادا على قوة التعبير من المروج كل جين. نظرا لقراءة بصرية بسيطة من هذا المسار، وقد تم إدخال لتطوير النظم المتقدمة القائمة على كريسبر وطرق لتحرير الجينوم19،20. في هذا العمل، تم بناء أشرطة التعبير ترميز الجينات الكاروتينية crtE، crtYB وcrtI باستخدام نهج استنساخ البوابة الذهبية (GGC)21 مع المروجين غير متجانسة والمنهيات متجانسة تستخدم لدفع التعبير عن الجينات. تحاط أشرطة التعبير بتسلسلات فريدة من 50 قاعدة (bp)، تسمى الموصلات، التي تسمح في التجميع في الجسم الحي مع تسلسلات الحمض النووي للجناح التكامل (المناطق المحيطة) مع نفس تسلسلات 50 نقطة أساس، والتكامل اللاحق في الحمض النووي الجيني للخميرة في الموقف الذي تحدده المناطق المحيطة بها. باستخدام نقاط قوة المروج مختلفة، تم الحصول على سلالات مع مستويات مختلفة من إنتاج الكاروتينات مما أدى إلى اختلاف في لون الخلايا. وقد استخدمت هذه السلالات - مستوحاة من "مشروع الفن الخميرة"22 - في إعداد اكتشاف مع معالج السائل الصوتية لإنشاء 4-لون عالية الدقة "صورة الخميرة" من روزاليند فرانكلين. فرانكلين (1920-1958) كان الكيميائي الإنجليزية والأشعة السينية crystallographer معروفة جيدا لمساهمتها في اكتشاف هيكل الحمض النووي من قبل الصورة 5123,24,25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals specific for the protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td style="width:175px;">Selection of E. coli transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">BsaI-HF (20 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R353L</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td style="width:175px;">Transfromation of 
			S. cerevisiae (carrier DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">dNTPs</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethanol absolute for analysis</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethylenediamine-tetraacetic acid</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Histodenz</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D2158&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Yeast pixel art</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100993</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nancy-520 DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>1494</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NEB10 competent E. coli cells</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>C3019H</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nourseothricin</td>
			<td style="width:144px;">Jena Bioscience</td>
			<td>AB102</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Phusion buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Polyethylene glycol 4000</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>7490</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:156px;">Purple loading dye</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td style="width:175px;">Purification of plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">RNase coctail enzyme mix</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>46300-018</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA Ligase (1 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>1705218</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit</td>
			<td style="width:144px;">Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td style="width:175px;">Purification of PCR products and linearized pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Xhol</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Zymolyase 50 mg/ml (5 units/&#181;L)</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1006</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:156px;">Zymolyase storage buffer</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1004-B</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals of general use</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">2*Peptone-Yeast extract (PY) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">2*PY medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Demineralized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">ELFO buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">MQ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Physiological salt solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">YEPD (2% glucose) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microplate 96 wells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 0.5 - 10 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 10 - 200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Pipette tips 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Shake flasks (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Sterile filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Centrifuge (Falcon tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Echo 525 acoustic liquid handler</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">NanoDrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Set for eletrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Table centrifuge (Eppendorfs tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCSN067</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101748</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pRN1120</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101750</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">S. cerevisiae strain 
			CEN.PK113-7D</td>
			<td style="width:144px;">EUROSCARF collection</td>
			<td></td>
			<td>http://www.euroscarf.de</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art

وقد سهلت كفاءة عالية، وسهولة الاستخدام وتعدد الاستخدامات من تكرارات قصيرة متباعدة بانتظام/ كريسبر المرتبطة البروتين 9 (CRISPR / Cas9) التعديل الوراثي المتقدم من Saccharomyces سيريفيسياي، وهو نموذج الكائن الحي وحصان العمل في التكنولوجيا الحيوية الصناعية. البروتين المرتبط بـ CRISPR 12a (Cas12a)، وهو إندونوكليس موجه من الحمض النووي الريبي مع ميزات يمكن تمييزها عن Cas9 يتم تطبيقه في هذا العمل، مما يزيد من توسيع الأدوات الجزيئية لأغراض تحرير الجينوم. ومن فوائد نظام CRISPR/Cas12a أنه يمكن استخدامه في تحرير الجينوم المتعدد مع العديد من الأبعاد RNAs الإرشادية التي يتم التعبير عنها من وحدة نسخ واحدة (صفيف واحد من RNA كريسبر (crRNA). نقدم بروتوكولاً لدمج الجينات المتعددة غير المتجانسة في مكان مستقل للجينوم S. cerevisiae باستخدام نظام CRISPR/Cas12a مع crRNAs متعددة يتم التعبير عنها من بناء صفيف crRNA واحد. وتستغل الطريقة المقترحة قدرة S. cerevisiae على القيام في عملية إعادة تركيب ة في الجسم الحي لشظايا الحمض النووي لتجميع صفيف crRNA واحد في بلازميد التي يمكن استخدامها لاختيار التحويل، فضلا عن تجميع الحمض النووي المانح التسلسلات التي تندمج في الجينوم في المواقف المقصودة. Cas12a هو قبل التعبير عن هامدة، مما يسهل الانقسام من الجينوم S. سيريفيسياي في المواقف المقصودة عند التعبير عن مجموعة crRNA واحدة. ويشمل البروتوكول تصميم وبناء صفيف crRNA واحد وأشرطة التعبير الحمض النووي المانحة، ويستغل نهج التكامل الاستفادة من تسلسلموصلات الحمض النووي 50-bp فريدة من نوعها وتسلسل الحمض النووي منفصلة الجانب التكامل، الذي يبسط التصميم التجريبي من خلال التوحيد والوحدات ويوسع نطاق التطبيقات. وأخيرا، ونحن نعرض تقنية مباشرة لخلق الخميرة بكسل الفن مع معالج السائل الصوتية باستخدام الكاروتينات الملونة بشكل مختلف إنتاج سلالات الخميرة التي تم بناؤها.

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

نظام كريسبر/كاس12a في تركيبة مع صفيف crRNA واحد يتيح تحرير متعددة فعالة من الجينوم S. سيريفيسياي في موضع متعددة في وقت واحد. ويتجلى ذلك من خلال بناء الكاروتينات المنتجة سلالات الخميرة التي تستخدم في وقت لاحق لخلق الخميرة بكسل الفن.

كريسبر / Cas12a متعددة الجينوم التحرير من Saccharomyces سيريفيسياي وخلق الخميرة بكسل الفن

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

يوضح هذا البروتوكول أسلوباً جديداً لتحرير الجينوم المتعدد من Saccharomyces cerevisiae عن طريق إدخال أشرطة متعددة التعبير على loci مختلفة في خطوة تحويل واحدة. هذا الاستنساخ الحرة plasmid نهج التجميع للتعبير عن مجموعة كررنا واحد ، يؤدي إلى بروتوكول تحرير الجينوم سريعة وفعالة ومرنة. سوف نهندس خلايا الخميرة من النوع البري، لإنتاج الكاروتينات من خلال إدخال جينات غير متغايرة مجانية على لُوَس الجينومية الحرة.مجموعة crRNA واحد يتكون من crRNAs الفردية الحرة التي أعرب عنها من RNA البوليميراز المروج الحرة. Cas12a العمليات في الجسم الحي مجموعة crRNA في crRNAs الفردية. دليل crRNAs Cas12a إلى loci الهدف على الحمض النووي الجينومي حيث Cas12a يقدم فواصل حبلا مزدوجة.شظايا الحمض النووي إلى الأسفل إعادة الدمج في إعادة الدمج في الجسم الحي والاندماج في الحمض النووي الجينومي. وسيكون إثبات البروتوكول كلاوديا سيوروكوت، طالبة دكتوراه. جيفري فان Wijk، عالم مشارك.و (بريندا فونك) عالمة مساعدة كبيرة من مختبرنا بعد الحصول على صفيفة crRNA واحدة لتجارب تحرير الجينوم متعددة من الحمض النووي الاصطناعية، وإعداد مزيج التضخيم PCR، وتحميل الصفيف في الدراجات الحرارية للتضخيم. لتحليل منتجات PCR بواسطة الكهرباء، قم بتشغيل العينات على جل agarose بنسبة 0.8٪في 5 V/cm لمدة 40 دقيقة.تحميل سلم الحمض النووي مع شظايا الحمض النووي تتراوح بين 100 10000 أزواج قاعدة ثم تنقية المنتجات PCR باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لتحويل الخميرة، تبدأ قبل زراعة الخميرة نوع البرية في قارورة 100 مل تحتوي على 20 مل من الخميرة استخراج dextrose الببتون أو YEPD المتوسطة. لاحتضان بين عشية وضحاها، في 30 درجة مئوية، و 250 التناوب في الدقيقة الواحدة في صباح اليوم التالي، تلقيح 20 مل من YEPD المتوسطة الطازجة مع حجم محسوب من الخميرة ما قبل الثقافة بين عشية وضحاها.ضع الثقافة في حاضنة الهز حتى يتم الوصول إلى كثافة بصرية قدرها 1.0، تقاس عند 600 نانومتر. حصاد خلايا الخميرة عن طريق الطرد المركزي. غسل بيليه خلية الخميرة في 20 مل من درجة حرارة الغرفة demineralized المياه، تليها طرد مركزي إضافية.Resuspend بيليه في 100 ميكرولترات من محلول ليثيوم خلات تريس EDTA ، ونقل الخميرة إلى أنبوب microcentrifuge. مزيج خمسة ميكرولترات من الحمض النووي الناقل واحد الذين تقطعت بهم السبل وميكروغرام واحد من psmid pCSN067 مع تعليق خلية الخميرة. ثم مزيج 600 ميكروليتر من البولي ايثيلين جلايكول LIAc-TE حل مع العينة.احتضان خلايا الخميرة وplsmid لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية و 450 prm في كتلة الحرارة أعلى الجدول. في نهاية الحضانة، اخلط 70 مل من سلفوكسيد ثنائي الميثيل مع محلول التحويل. سخني الخليط لمدة 15 دقيقة في حمام مائي 42 درجة مئوية.نقل الخليط إلى أنبوب أسفل جولة 15 مل. إضافة 10 مل من YEPD إلى أنبوب لاحتضان ليلة وضحاها في 30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة. في صباح اليوم التالي، وجمع الخلايا المحولة عن طريق الطرد المركزي، وpirate جميع ما عدا 200 ميكرولترات النهائي من عظمى.Resuspend بيليه خلية الخميرة المحولة في الماسخ المتبقية. لوحة 150 ميكرولترات من مزيج التحول، و 150 ميكرولترات من 20 مرة تخفيف المتبقية 50 ميكرولترات من مزيج التحول في YEPD، على YEPD أجار لوحات، تستكمل مع 0.2 غرام لكل لتر من G418. بعد 48 إلى 72 ساعة في 30 درجة مئوية، واختيار محول واحد لإعادة streaking على لوحة جديدة YEPD أجار تكملها 0.2 غرام / لتر من G418.للتحول الثاني، تنمو الثقافة إلى كثافة بصرية في 600 نانومتر من 1.0، كما هو موضح للتو. وإضافة 20 ميكرولترات من الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge. بعد الطرد المركزي، resuspend بيليه الخلية في 100 ميكرولترات من حل LIAc-TE، وإضافة SsDNA.في أنبوب منفصل، والجمع بين ميكروغرام واحد من مجموعة كررنا واحد، ميكروغرام واحد من بلازميد المتلقي الخطي لمصفوفة كررنا، ميكروغرام واحد من كل الحمض النووي المانح، وم ميكروغرام واحد من كل منطقة الجناح. ثم نقل خليط الحمض النووي إلى أنبوب من خلايا الخميرة المختصة واستكمال التحول الثاني كما هو موضح للتحول الأول. في صباح اليوم التالي، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في aliquot صغيرة من supernatant.ثم لوحة 150 ميكرولترات من مزيج التحول، و 150 ميكرولترات من 20 مرة تخفيف مزيج التحول في YEPD المتوسطة، على YEPD لوحات أجار تكملها 0.2 غرام / ل G418 ، و 0.2 غرام / ل nourseothricin بعد 48 إلى 72 ساعة ، في 30 درجة مئوية ، واختيار محول واحد الملونة لإعادة streaking على لوحة جديدة YEPD للحصول على المستعمرات الملونة واحدة. لتحديد كفاءة تحرير الجينوم ، عد عدد المستعمرات الملونة والبيضاء على لوحات التحول ، وتقسيم عدد المستعمرات الملونة على العدد الإجمالي للمستعمرات. لإنشاء خميرة بكسل الفن، تلقيح الفردية 500 مل يهز قارورات تحتوي على 100 مل من YEPD المتوسطة مع ثلاثة كاروتينويد الملونة بشكل مختلف إنتاج سلالات S.cerevisiae، والبرية نوع CEN.PK113-7D سلالة. احتضان الثقافات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة. نقل 0.5 مل من كل ثقافة بين عشية وضحاها إلى أنابيب الفردية التي تحتوي على 0.5 مل من العقيمة، غير الأيونية الانحدار المتوسطة لكل أنبوب، وخلط الحلول لفترة وجيزة من خلال دوامة.نقل تعليق الخلية إلى خزان فردي مؤهل 2 بنسبة 3 آبار. استخدام ملف csv مع ضبط معايرة السوائل 6RES_AQ_GPSA2 على أداة معالج السائل الصوتية بقعة 25 نانولترس من كل سلالة S.cerevisiae من لوحة مصدر خزان مؤهل المناسبة على 6144 جيدا الوجهة microplate التي تحتوي على 50 مل من YEPD أجار. عندما تم رصد جميع الآبار، احتضان microplate في 30 degressss مئوية لمدة 48 ساعة.لتكثيف ألوان السلالات، وتخزين لوحات أجار في 4 درجات مئوية لمدة 72 ساعة على الأقل. ظهرت صورة لروزاليند فرانكلين على اللوحة. كما هو موضح، يمكن تجميع المروج، إطار القراءة المفتوحة، المنهي، ومسلسلين متجاورين موصل 50 BP في شريط تعبير عبر تفاعل استنساخ البوابة الذهبية، والتحقق من قبل PCR.بعد التضخيم من صفيفة crRNA واحد من قبل PCR، يتم الخطية بلازميد المتلقي لصفيف crRNA واحد كما أكده الكهرباء. ويمكن حساب كفاءة تحرير الجينوم المتعدد من خلال النسبة المئوية للمستعمرات الملونة بعد التحول، ومن خلال نتائج تحليلات PCR التي تؤكد تكامل الحمض النووي للمتبرع في مواقع الحمض النووي الجينومي المقصود. على سبيل المثال ، بدءا من صورة بالأبيض والأسود لروزاليند فرانكلين ، تم إنشاء صورة ملونة أربعة وقائمة اكتشاف تم استخدامها بعد ذلك لاكتشاف سلالات الخميرة الأربعة المختلفة على لوحة صغيرة أجار عبر معالج سائل صوتي ، كما هو موضح ، مما أدى إلى لوحة خميرة عالية الدقة للعالم.لهذا التحول، واستخدام حلول حديثة الإعداد وشظايا الحمض النووي ذات جودة عالية. ويمكن أيضاً تطبيق هذه الطريقة لإدخال الحذفات المحددة والطفرات المحددة في الطفرات في الحمض النووي الجينومي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تجارب تنظيم CRISPR.يمكن تعديل هذا الأسلوب لإدخال أكثر من crRNAs الحرة داخل صفيف لزيادة عدد التعديلات المتزامنة التي يمكن إجراؤها.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

ارتفاع جانبي MicroRNA المناولة : ملتيبليكس محسن qRT - PCR على مقياس نانولتر في المحفل Fluidigm ArrayTM الحيوي

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

البلازما الطباعة الحجرية الزخرفة السطحية لإنشاء شبكات الخليوي

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Lensfree الميكروسكوب تصوير الشعاعي الطبقي على رقاقة ويعمل لدى الشركة متعددة زاوية الإضاءة وبكسل سوبر قرار

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

المستمر الملاحظة المجهرية عالية الدقة من تنسخي الشيخوخة في الخميرة الناشيء.

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

تقنيات لتطور قوية خميرة تخمر البنتوز للالتحويل البيولوجي من مادة الخشب إلى إيثانول

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

إنشاء الأنسجة القلبية عرض التكامل الميكانيكي للكروية باستخدام بيوبرينتينغ 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

كفاءة توليد وتحرير إيبسكس تغذية خالية من خلايا البنكرياس البشرية باستخدام نظام كريسبر-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

الأمثل للتحليل متعدد التعبير المستندة إلى الجيش الملكي النيبالي استخدام المواد الأرشيفية سرطان الثدي

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection "روتوورم الذرة الغربية"، ظهرت فيرجيفيرا فيرجيفيرا، والأجنة لتحويل الخط، أو تحرير الجينوم كريسبر/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

أسلوب صافي المستندة إلى القالب لإنشاء أنسجة القلب خالية من السقالة ثلاثي الأبعاد

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...