Name: crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

Dette projekt modtog støtte fra eu's Horisont 2020-forsknings-og innovationsprogram i henhold til tilskudsaftale nr. 686070 (DD-DeCaf) og 764591 (SynCrop) og fra forskningsprogrammets byggeklodser med projektnummer 737.016.005 af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO). T.E.G. blev støttet af Royal Society (Grant UF160357) og BrisSynBio, et BBSRC/EPSRC syntetisk biologi Research Center (Grant BB/L01386X/1). Vi takker Zi di og Jeffrey van Wijk for deres bidrag til gær spotting eksperimenter for at skabe gær pixel kunst.

<ol>
	<li>Knott, G. J., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+guides+the+future+of+genetic+engineering.">CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering.</a> Science. 361 (6405), 866-869 (2018).</li><li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+metabolic+engineering+using+an+orthogonal+tri-functional+CRISPR+system.">Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system.</a> Nature Communications. 8 (1), 1688 (2017).</li><li>Li, Z. -. H., Liu, M., Lyu, X. -. M., Wang, F. -. Q., Wei, D. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+facilitated+large+fragment+deletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).</li><li>Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+facilitated+multiple-chromosome+fusion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).</li><li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Abudayyeh, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector.">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Makarova, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+evolutionary+classification+of+CRISPR-Cas+systems.">An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).</li><li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovi&#269;, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA.">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae.+using+the+CRISPR/Cas+System.">Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601 (2018).</li><li>Ferreira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+CRISPR/Cas9+genome+editing+and+gene+regulation+using+Csy4+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).</li><li>Swarts, D. C., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+versus+Cas12a/Cpf1:+Structure&#8211;function+comparisons+and+implications+for+genome+editing.">Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure&#8211;function comparisons and implications for genome editing.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481 (2018).</li><li>Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Basis+for+DNA+Target+Specificity+of+CRISPR-Cas12a.">Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a.</a> Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).</li><li>Verwaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+beta-carotene+in+Saccharomyces+cerevisiae.+by+successive+transformation+with+carotenogenic+genes+from+Xanthophyllomyces+dendrorhous.">High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).</li><li>Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+enables+fast+and+simple+genome+editing+of+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).</li><li>Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+advances+engineering+of+microbial+cell+factories.">CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories.</a> Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).</li><li>Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3 (11), 3647 (2008).</li><li>Franklin, R. E., Gosling, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+configuration+in+sodium+thymonucleate.">Molecular configuration in sodium thymonucleate.</a> Nature. 171, 740-741 (1953).</li><li>Watson, J. D., Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structure+for+deoxyribose+nucleic+acid.">A structure for deoxyribose nucleic acid.</a> Nature. 171, 737-738 (1953).</li><li>Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+deoxypentose+nucleic+acids.">Molecular structure of deoxypentose nucleic acids.</a> Nature. 171, 738-740 (1953).</li><li>Young, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+algorithm-guided+design+of+massive+strain+libraries,+applied+to+itaconic+acid+production+in+yeast.">Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast.</a> Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).</li><li>Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cloning Method. , (2013).</li><li>Mandel, M., Higa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+bacteriophage+DNA+infection.">Calcium-dependent bacteriophage DNA infection.</a> Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).</li><li>Van Dijken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interlaboratory+comparison+of+physiological+and+genetic+properties+of+four+Saccharomyces+cerevisiae+strains.">An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains.</a> Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Acids Research. 19 (20), 5791 (1991).</li><li>Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+genomic+DNA+from+yeasts+for+PCR-based+applications.">Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications.</a> Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).</li><li>Tak, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+multiplex+gene+regulation+using+CRISPR-Cpf1-based+transcription+factors.">Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors.</a> Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+editing+by+CRISPR-Cpf1+using+a+single+crRNA+array.">Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array.</a> Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).</li><li>Swiat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FnCpf1:+a+novel+and+efficient+genome+editing+tool+for+Saccharomyces+cerevisiae.">FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cpf1-Assisted+Multiplex+Genome+Editing+and+Transcriptional+Repression+in+Streptomyces.">CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces.</a> Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1.">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell Discovery. 3, 17018 (2017).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).</li><li>Perez, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GuideScan+software+for+improved+single+and+paired+CRISPR+guide+RNA+design.">GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).</li><li>Cox, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Biology+Open+Language+Visual+(SBOL+Visual)+Version+2.0.">Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0.</a> Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at der er en interessekonflikt. Forfatterne har indgivet IP relateret til præsenterede metoder.

Den medfølgende protokol beskriver multiplex genomredigering af S. cerevisiae ved hjælp af Cas12a fra lachnospiraceae bakterie ND2006 i kombination med et enkelt crrna-array og donor-DNA. Design af det enkelte crRNA-array og donor-DNA forklares i detaljer. I modsætning til det veletablerede crispr/Cas9-system har crispr/Cas12a den unikke ekstra evne til at behandle flere crrnas udtrykt fra et enkelt crrna-array13,33. På grund af denne funktion er samtidig redigering af flere mål lettere at opsætte og kan opnås i en enkelt transformation. Denne enkelt crRNA array tilgang blev demonstreret før af Zetsche et al. 34 , som samtidig redigerede op til fire gener i pattedyrsceller ved hjælp af AsCas12a, og ved Swiat et al. 35 , som INTRODUCEREDE fire DNA-fragmenter i et gærgenom ved hjælp af FnCas12a. Til vores kendskab er et større antal samtidige genomændringer ved hjælp af et Cas12a system ikke blevet rapporteret, og den maksimale grænse for mål pr. enkelt array for Cas12a er endnu ikke fastlagt. Yderligere forskning ved hjælp af enkelt crrna-systemer i kombination med Cas12a omfatter multiplex transkriptional regulering i en bred vifte af organismer33,36,37.
Der er nogle kritiske trin i den præsenterede protokol. Design omhyggeligt alle DNA-sekvenser, der er involveret i Cas12a genomredigerende eksperiment, især i tilfælde, hvor nye DNA-sekvenser introduceres. Bestem funktionaliteten af nye afstands sekvenser del af en crRNA, for eksempel ved en singleplex genomredigering eksperiment som beskrevet af Verwaal et al. 19 før du kombinerer dem i et enkelt crrna-array. Følg anbefalingerne for udarbejdelse af transformation buffer løsninger, der anvendes i Cas12a redigering eksperiment for at opnå en god transformation effektivitet af gær.
Der er nogle valgfrie modifikationer af teknikken. Det anbefales at bruge 1 μg af hver donor DNA, lineariseret pRN1120 eller enkelt crRNA array Expression kassette i omdannelsen, selv om brugen af et lavere DNA-beløb forventes også at resultere i en tilfredsstillende transformation effektivitet. Udfør en test transformation for at afgøre, om der kan anvendes lavere DNA-mængder. Omdannelse af S. cerevisiae kan udføres ved hjælp af en anden metode end den, der er beskrevet i denne protokol, for eksempel den protokol, der er beskrevet af gietz et al. (2007) 38. guide RNA-modtager plasmid pRN1120 er egnet til ekspression af et enkelt crrna og enkelt crrna-array af forskellige Cas12a varianter (f. eks.fra acidaminococcus spp. BV3L6 eller Francisella novicida U112) samt til ekspression af sgRNA i kombination med Cas919. Donor-DNA behøver ikke at være begrænset til carotenoid genekspression kassetter og ledsage regioner, der er målrettet donor DNA til de beskrevne INT1, INT2 og INT3 steder i genomisk DNA. Ethvert DNA af interesse kan indføres på en multiplex måde i genomisk DNA af værten ved de designprincipper, der er beskrevet i denne protokol, eller alternativt donor DNA kan bruges til at slette DNA fra et værts-genom. Den modulære struktur af enkelt crRNA-array letter nem justering af spacer og direkte gentagelses sekvenser. Ændring af afstands sekvenser giver mulighed for en ændring af den tilsigtede integration locus, som kan være designet af et af de værktøjer til identifikation af en genomisk mål site, f. eks guidescan software 1,039. I stedet for at bruge store ledsage sekvenser, der indeholder stik sekvenser, kan 50-BP af ledsage regionen medtages i donor DNA-sekvenser ved at indarbejde disse 50-BP ledsage region sekvenser i primere, der anvendes i PCR. I dette tilfælde, i alt kun tre i stedet for ni donor DNA fragmenter er nødvendige for en vellykket multiplex genomredigering eksperiment.
I Resumé, denne protokol giver trin-for-trin anvisninger til at udføre multiplex genom redigering i S. cerevisiae ved hjælp af Cas12a i kombination med en enkelt crrna array tilgang. Protokollen blev demonstreret af multiplex genom editing ved hjælp af 9 donor DNA fragmenter og enkelt crrna array kodning for tre grnas. Vi viser høje samlede redigerings frekvenser mellem 50% og 94% for de tre stamme designs, som rapporteres her. Afsluttende, det unikke træk ved Cas12a er evnen til at behandle en enkelt crRNA array i individuelle crRNAs i en celle, hvilket gør Cas12a et glimrende værktøj til at muliggøre multiplex genomredigering og udvikle transkriptionelle regulerings moduler rettet mod flere udtryk kassetter på én go. I sidste ende, tre stammer blev opnået producerer carotenoider på et andet niveau og farver i nuancer mellem gul og orange. Med disse stammer og en vild-type stamme, vi viste, hvordan en akustisk væske handler kan bruges ligefremdet at gøre gær pixel kunst-dette til ære for Rosalind Franklin, der bidrog til opdagelsen af DNA-strukturen 65 år siden af hendes berømte billede 5123 < /C1 >.

CRISPR/CAS-enzymer har utvivlsomt revolutioneret molekylær biologi og er blevet bredt vedtaget som værktøjer til ingeniør genomer med en hastighed, der ikke tidligere var gennemførlig1. Den første ændring af en Saccharomyces cerevisiae genom ved crispr/Cas9 genom redigeringssystem blev rapporteret af DiCarlo et al. 2, viser vellykket gen knock-out og gøre punktmutationer ved hjælp af eksternt introducerede oligonucleotides. Yderligere udvikling af gær CRISPR Toolbox omfattede: transkriptional regulering ved fusion af katalytisk inaktive Dead Cas9 (dCas9) med transkriptional Effector domæner for at muliggøre aktivering og hæmning af transkriptionen3, ansøgning om både genomredigering og reguleringsfunktioner for metabolisk pathway Engineering ved samtidig aktivering, undertrykkelse og sletning4, sletning af store fragmenter fra S. cerevisiae genom5og multiple-kromosom fusioner6 .
CRISPR/CAS-genomredigeringssystemer finder deres oprindelse i adaptive immun systemer af bakterier og archaea, og disse systemer er blevet tilpasset af molekylære biologer til genomredigering. Deres funktionalitet er baseret på klynger regelmæssigt Interspaced korte Palindromic gentagelser (CRISPR) DNA regioner kodning RNA ansvarlig for anerkendelse af det fremmede DNA eller RNA og CRISPR associerede gener (CAS) som koder RNA-guidede endonukleaser1,7,8,9. På baggrund af den nylige genomanalyse af CRISPR/CAS-systemer blev det foreslået at opdele CRISPR/CAS-systemerne i to klasser, fem typer og 16 undertyper10. De to klasser er kendetegnet på grundlag af organiseringen af Effector komplekser involveret i Target kavalergang. CRISPR/CAS-systemer med en organisation med flere under enheder kategoriseres typisk som klasse 1, hvorimod enkelt enheder under enheds-Effector tilhører klasse 210,11. I dette papir udforsker vi klasse 2 type V Cas12a, tidligere kaldet Cpf110,12, som er et alternativ til klasse 2 type II Cas9. Selv om Cas9 er velkarakteriseret og meget udbredt i forskning, Cas12a tilbyder yderligere funktioner12. For det første danner Cas12a et kompleks med CRISPR RNA (crRNA) på 42 til 44 nucleotider uden at kræve en yderligere Trans-aktivering af CRISPR RNA (tracrRNA). Derfor kan en kortere guide RNA udnyttes i genomredigering med CRISPR/Cas12a systemer sammenlignet med CRISPR/Cas9. For det andet muliggør den unikke endonuklease-og endoribonucleaseaktivitet af Cas12a modning af dens præ-crRNA13. Denne RNase aktivitet giver mulighed for kodning af flere crrnas på en enkelt crispr crrna array, mens Cas9 kræver separat udtryk for hver såkaldt single-guide RNA (sgrna) eller alternativt for eksempeludtryk for en yderligere endonuklease ( f. eks.Csy4) i kombination med genkendelses motiver for Csy4 omkring hver sgrna14,15. For det tredje, Cas12a Target site Recognition kræver en protospacer tilstødende motiv (PAM) ved 5 ' ende fra målet og kløver efter + 18/+ 23 position fra sin PAM resulterer i kløvet DNA med klæbrig ender, mens Cas9 kræver en PAM placeret på 3 ' ende fra den Target og spalter efter den-3 position skabe stump ende nedskæringer i DNA12. For det fjerde er den konsensus-nukleotid sekvens af PAM adskiller mellem Cas12a ((T) TTV) og Cas9 (NGG), hvilket gør Cas12a en lovende kandidat til målretning T-rige promotor og Terminator sekvenser16. Endelig rapporterede en nylig undersøgelse større målspecificitet for Cas12a end for de indfødte Cas917.
Vi præsenterer en protokol for brug af crispr/Cas12a system til genomredigering af S. cerevisiae med særligt fokus på indførelse af flere DNA-udtryks kassetter i uafhængig genomisk loci samtidigt (multiplex genom editing) ved hjælp af et enkelt crRNA-array. De vigtigste trin i protokollen er afbildet i figur 1. Som et bevis på konceptet blev CRISPR/Cas12a-systemet anvendt til at indføre tre udtryks kassetter i genomet i S. cerevisiae , som gør det muligt at fremstille β-caroten18 som skematisk vist i figur 2. Produktion af β-caroten påvirker fænotype S. cerevisiae: dvs., efter vellykket indførelse af alle tre heterologe gener, der kræves for carotenoider biosyntese, de hvide s. cerevisiae celler bliver gule eller orange, afhængigt af udtryks styrken for hvert gene's promotor. På grund af den simple visuelle læsning af denne vej, er det blevet introduceret til at udvikle avancerede crispr-baserede systemer og metoder til genomredigering19,20. I dette arbejde er udtryks kassetter, der koder for carotenoide gener Crte, crtyb og crti , blevet konstrueret ved hjælp af en Golden Gate kloning (GGC) approach21 med heterologe promotorer og homologe terminatorer bruges til at drive ekspression af gener. Udtrykket kassetter er omgivet af unikke 50-base par (BP) sekvenser, kaldet stik, der giver mulighed for in vivo -samling med integration FLANKE DNA-sekvenser (flankerer regioner) med de samme 50-BP sekvenser, og efterfølgende integration i det genomiske DNA af gær på den position, som er fastlagt af de flankkende regioner. Ved at bruge forskellige promotor styrker, stammer med forskellige niveauer af carotenoider produktion blev opnået resulterer i variation i farven på cellerne. Disse stammer-inspireret af "gær kunstprojekt"22 -blev brugt i en spotting setup med en akustisk væske handler til at skabe en 4-farve høj opløsning "gær fotografi" af Rosalind Franklin. Franklin (1920-1958) var en engelsk kemiker og X-ray crystallographer kendt for sit bidrag til opdagelsen af DNA-strukturen ved foto 5123,24,25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals specific for the protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td style="width:175px;">Selection of E. coli transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">BsaI-HF (20 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R353L</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td style="width:175px;">Transfromation of 
			S. cerevisiae (carrier DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">dNTPs</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethanol absolute for analysis</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethylenediamine-tetraacetic acid</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Histodenz</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D2158&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Yeast pixel art</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100993</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nancy-520 DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>1494</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NEB10 competent E. coli cells</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>C3019H</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nourseothricin</td>
			<td style="width:144px;">Jena Bioscience</td>
			<td>AB102</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Phusion buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Polyethylene glycol 4000</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>7490</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:156px;">Purple loading dye</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td style="width:175px;">Purification of plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">RNase coctail enzyme mix</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>46300-018</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA Ligase (1 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>1705218</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit</td>
			<td style="width:144px;">Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td style="width:175px;">Purification of PCR products and linearized pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Xhol</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Zymolyase 50 mg/ml (5 units/&#181;L)</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1006</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:156px;">Zymolyase storage buffer</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1004-B</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals of general use</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">2*Peptone-Yeast extract (PY) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">2*PY medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Demineralized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">ELFO buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">MQ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Physiological salt solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">YEPD (2% glucose) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microplate 96 wells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 0.5 - 10 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 10 - 200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Pipette tips 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Shake flasks (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Sterile filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Centrifuge (Falcon tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Echo 525 acoustic liquid handler</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">NanoDrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Set for eletrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Table centrifuge (Eppendorfs tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCSN067</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101748</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pRN1120</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101750</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">S. cerevisiae strain 
			CEN.PK113-7D</td>
			<td style="width:144px;">EUROSCARF collection</td>
			<td></td>
			<td>http://www.euroscarf.de</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art

Høj effektivitet, brugervenlighed og alsidighed af grupperet regelmæssigt hinanden korte palindromiske gentagelser/crispr-associerede protein 9 (crispr/Cas9) system har lettet avanceret genetisk modifikation af Saccharomyces cerevisiae, en model organisme og arbejdshest i industriel bioteknologi. CRISPR-associeret protein 12a (Cas12a), en RNA-styret endonuklease med funktioner, der adskiller sig fra Cas9, anvendes i dette arbejde, hvilket yderligere udvider den molekylære værktøjskasse til genom-redigeringsformål. En fordel ved crispr/Cas12a systemet er, at det kan bruges i multiplex genom redigering med flere guide RNAs udtrykt fra en enkelt transkriptional enhed (enkelt crispr RNA (crrna) array). Vi præsenterer en protokol for multiplex integration af flere heterologe gener i uafhængige loci af S. cerevisiae genom ved hjælp af crispr/Cas12a system med flere crrnas udtrykt fra en enkelt crrna array konstruktion. Den foreslåede metode udnytter S. cerevisiae evne til at udføre in vivo rekombination af DNA-fragmenter til at samle den enkelte crrna array i en plasmid, der kan bruges til transformerende udvælgelse, samt samling af donor DNA sekvenser, der integreres i genomet på de tilsigtede positioner. Cas12a er præ-udtrykt konstitutivt, lette spaltning af S. cerevisiae genom på de påtænkte positioner ved ekspression af den enkelte crrna array. Protokollen omfatter design og konstruktion af et enkelt crRNA-array og donor-DNA-udtryks kassetter og udnytter en integrationstilgang, der gør brug af unikke 50-BP-DNA-stik sekvenser og separate integrations flanke-DNA-sekvenser, hvilket forenkler Eksperimentel design gennem standardisering og modularisering og udvider rækken af applikationer. Endelig viser vi en ligetil teknik til at skabe gær pixel kunst med en akustisk væske handler ved hjælp af forskelligt farvet carotenoid producerer gærstammer, der blev konstrueret.

Protokollen til multiplex-genomredigering ved hjælp af CRISRP/Cas12a blev påvist ved at konstruere tre carotenoid-producerende S. cerevisiae -stammer, som udtrykker crte-, Crtyb -og crti -gener ved hjælp af heterologe høj, medium og lav styrke: stamme 1, 2 og, 3 henholdsvis (supplerende tabel 3). Opførelsen af disse stammer nødvendig generation af tre donor DNA-udtryk kassetter og seks ledsage regioner pr stamme for målretning til tre forskellige loci i genomisk DNA (vist i figur 2B). Som beskrevet heri blev Promoter, åben læse ramme, Terminator og to sammenhængende 50-BP-stik sekvenser samlet i en udtryks kassette via en Golden Gate-klonings reaktion, og samlingen blev verificeret af PCR (figur 3a). Det enkelte crRNA-array blev bestilt som et syntetisk DNA-fragment og blev forstærket af PCR (figur 3B). Recipient plasmid for det enkelte crRNA array (plasmid pRN1120) blev lineariseret med EcoRi-HF og xhoI og linearisering blev bekræftet af elektroforese (figur 3C). Design-og nukleotidsekvenserne for de indførte donor-DNA-udtryks kassetter og flankerings områder er vist i supplerende tabel 3 og supplerende tabel 4. Sekvensen af enkelt-crRNA-matrix udtryks kassetter findes i supplerende tabel 1. Funktionaliteten af Spacers inkluderet i den enkelte crrna array blev testet på forhånd af singleplex genom redigering med individuelle crrnas19.
Effektiviteten af genomredigeringen ved hjælp af Cas12a blev først evalueret baseret på antallet af farvede kolonier opnået efter transformation (tabel 1, figur 4). Redigeringen effektiviteten af de tre konstruerede stammer varierede fra 50% til 94%. Indførelsen af udtryks kassetter, der anvendes til generering af stamme 1, viste den laveste redigerings effektivitet, muligvis forårsaget af donor-DNA'ET (dvs.disse udtryks kassetter indkode crte, Crtyb og crti fra tre højstyrke promotorer). For det andet blev korrekt integrering af de tre donor-DNA-udtryks kassetter ved det tilsigtede loci på det genomiske DNA bekræftet af PCR (figur 5). Primere blev konstrueret på en sådan måde, at PCR-produkter blev opnået, når den korrekte integration af donor-DNA på det tilsigtede locus forekom. For hvert Transformations eksperiment blev otte kolonier plukket fra Transformations pladen og afprøvet (Bemærk, at kun tre er præsenteret i figur 5). I almindelighed, ud af 8 kolonier testet pr donor DNA, korrekt integration af Crte donor DNA på INT1 locus, CRTYB på INT2 Locus og crti på INT3 locus blev bekræftet i > 90% af transformanterne. Disse resultater demonstrere crispr/Cas12a system i kombination med en enkelt crrna array muliggør effektiv multiplex redigering af S. cerevisiae genom på flere loci samtidigt.
Derudover viser vi skabelsen af "gær pixel kunst" ved hjælp af de tre carotenoid producerende stammer, der blev bygget sammen med en ikke-farvet vildtype stamme. Med udgangspunkt i et sort og hvidt billede af Rosalind Franklin (figur 6a) blev der oprettet et 4-farvet billede (figur 6B) og spotting List, som derefter blev brugt til at spotte de fire forskellige gærstammer på en agar-mikroplade ved hjælp af en akustisk væske handler, hvilket resulterer i en høj opløsning "gær maleri" af Rosalind Franklin (figur 6C, D, E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig1v5.jpg"> Figur 1 : Workflow af protokollen for crispr/Cas12a multiplex genom redigering i S. cerevisiae. Arbejdsprocessen indeholder vigtige trin i den præsenterede metode. For detaljer se protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig2.jpg"> Figur 2 : Skema af crispr/Cas12a multiplex genom redigering ved hjælp af en enkelt crrna array. (A) det enkelte crrna-array er sammensat af tre crRNAs-enheder i deres modne form, en 20-BP Direct REPEAT-specifik for LbCas12a (grå firkanter) med en 23-BP guide sekvens (farvede diamanter). Udtryk af crRNA-arrayet aktiveres af SNR52 promoter og SUP4 Terminator. Omdannelse af S. cerevisiae med en lineariseret pRN1120 og den enkelt crrna array Expression kassette indeholdende homologi med pRN1120 (diagonal striber) giver mulighed for in vivo rekombination i en cirkulær plasmid i celler præ-udtrykke LbCas12a. Det enkelte crRNA-array behandles efterfølgende af Cas12a. B) Cas12a er rettet mod de tilsigtede INT1, INT2 og INT3 genomiske målområder og skaber dobbelt strandede pauser. I Transformations blandingen blev donor-DNA bestående af ledsage-regioner og carotenoid-genekspressions kassetten inkluderet. Donor-DNA-samlinger blev rettet mod en enkelt strækning af DNA i genomisk DNA omkring INT1 (Crte), INT2 (crtyb) og INT3 (crti) loci ved in vivo rekombination på grund af tilstedeværelsen af 50-BP homologe stik-sekvenser, angivet som 5, A, B, C, D eller E. P1-P3, forskellige initiativtagere T1 – T3, forskellige terminatorer. Dette tal er blevet modificeret fra Verwaal et al. 201819. Genetiske konstruktioner vist ved hjælp af syntetisk biologi Open Language (SBØL) visuelle symboler40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig3.jpg"> Figur 3 : PCR kontrollerer eksperimenter med genomredigering. (A) verifikation af Golden Gate kloning reaktioner af MONTEREDE donor DNA kassetter. Opnåede resultater er i enighed med forventede længder. (B) PCR af det enkelte crrna-array. C) linearisering af plasmid pRN1120. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig4.jpg"> Figur 4 : Plader af S. cerevisiae transformationer ved hjælp af multiplex genom redigeringsmetode. A) stamme 1,derudtrykker crte, crtyb og crti fra tre stærke initiativtagere (mørke orange kolonier). B) stamme 2, som udtrykker crte, Crtyb og crti fra tre medium styrke promotorer (appelsin kolonier). C) stamme 3, som udtrykker crte, Crtyb og crti fra tre lavstyrke promotorer (gule kolonier). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig5.jpg"> Figur 5 : PCR, som verificerer integrationen af donor-DNA-udtryks kassetterne ved det tilsigtede loci inden for genomisk DNA. A) verifikation af tre kolonier af stammen 1. B) verifikation af tre kolonier af stammen 2. C) verifikation af tre kolonier af stammen 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig5large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig6.jpg"> Figur 6 : Gær pixel kunst af Rosalind Franklin. (A) sort og hvid RGB foto af 220 × 280 pixels af Rosalind Franklin, der blev brugt som en skabelon. (B) computer konvertering af det sorte og hvide foto af Rosalind Franklin ind i en 4-farvet 64 × 96 pixel liste. (C) foto af gær pixel kunst med 64 × 96 gær kolonier med en zoomet-in sektion. (D) foto af en akustisk væske handler med to fulde dyrkede plader. (E) foto af en fuld dyrket mikropladen med 64 × 96 gær kolonier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig6large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Stamme 1</td>
			<td>Stamme 2</td>
			<td>Stamme 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Farvede kolonier</td>
			<td>16</td>
			<td>279</td>
			<td>220</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hvide kolonier</td>
			<td>16</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kolonier i alt</td>
			<td>32</td>
			<td>297</td>
			<td>238</td>
		</tr>
<tr>
<td>Effektivitet</td>
			<td>50%</td>
			<td>94%</td>
			<td>92%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: redigering af effektiviteten af multiplex-genomredigeringstilgangen.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>crRNA array sekvensa, b, c, d, e, f</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Har du ikke mere at gøre med, er det ikke en af de mest iøjne faldende, men ikke en af de andre...... Tctttgaaaa HAR du en af de andre, som har været med til at gøre det, er det ikke en af de andre. TGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCA TTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGC har studeret på AATGTTCGKCCT-Pccgtaagataättätka har studeret påGccn-CCT-Pkttn-AATGA GCCGGAGCCGACGGAatttctactaagtgtagattgcccctcttatacgattatattTT TTTTTGTTTTTTATGTCTggggggcccggtacccagcttttgttccctttagtgagg GTTAATTCCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG
</td>
		</tr>
<tr>
<td>a. homologi til pRN1120 (fed). b. SNR52 promotor (kursiv). c. genomiske målsekvenser (understreget). d. guide direkte gentagelser specifikke for LbCas12a (kursiv, fed). e. SUP4 Terminator (kursiv). f. Homology til pRN1120 (fed).</td>
		</tr>
</tbody></table>Supplerende tabel 1: enkelt crRNA-array for LbCas12a indeholdende homologi med plasmid pRN1120.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>Navn</td>
			<td>Sekvensa</td>
			<td>Beskrivelseb</td>
			<td>Anvendt i punkt</td>
		</tr><tr><td>KC-101</td>
			<td>CATGTTTGACAGCTTATCATC</td>
			<td>FW primer til forstærkning af enkelt crRNA-array</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-102</td>
			<td>CACACAGGAAACAGCTATGAC</td>
			<td>RV primer til forstærkning af enkelt crRNA-array</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-103</td>
			<td>AAGCGACTTCCAATCGCTTTGC</td>
			<td>FW primer til forstærkning af donor DNA med stik 5</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-104</td>
			<td>AAAGCAAAGGAAGGAGAGAAC</td>
			<td>RV primer til forstærkning af donor DNA med Connector A</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-105</td>
			<td>CGGATCGATGTACACAACCG</td>
			<td>FW primer til forstærkning af donor DNA med stik B</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-106</td>
			<td>CAACAGGAGGCGGATGGATATAC</td>
			<td>RV primer til forstærkning af donor DNA med stik C</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-107</td>
			<td>AACGTTGTCCAGGTTTGTATCC</td>
			<td>FW primer til forstærkning af donor DNA med Connector D</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-108</td>
			<td>AGGTACAACAAGCACGACCG</td>
			<td>RV primer til forstærkning af donor DNA med stik E</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-109</td>
			<td>CACTATAGCAATCTGGCTATATG</td>
			<td>FW primer til forstærkning af INT1 5 ' med stik 5</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-110</td>
			<td>
AAACGCCTGTGGGTGTGGTAC TGGATATGCAAAGCGATTGGAA GTCGCTTgactcctctgccgtc ATTCC</td>
			<td>RV primer til forstærkning af INT1 5 ' med stik 5</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-111</td>
			<td>
TTGCCCATCGAACGTACAAG TACTCCTCTGTTCTCTCCTTCCTT TGCTTTaagcgttgaagtttcctc TTTG</td>
			<td>FW primer til forstærkning af INT1 3 ' med Connector A</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-112</td>
			<td>TGTCAACTGGAGAGCTATCG</td>
			<td>RV primer til forstærkning af INT1 3 ' med Connector A</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-113</td>
			<td>AGAAGATTTCTCTTCAATCTC</td>
			<td>FW primer til forstærkning af INT2 5 ' med Connector B</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-114</td>
			<td>
TGCTAAGATTTGTGTTCGTT TGGGTGCAGTCGGTTGTGTACAT CGATCCGcccttatcaaggatacc TGGTTG</td>
			<td>RV primer til forstærkning af INT2 5 ' med stik B</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-115</td>
			<td>
ACGCTTTCCGGCATCTTCCA GACCACAGTATATCCATCCGCCT CCTGTTGggcgattacacaagcg GTGG</td>
			<td>FW primer til forstærkning af INT2 3 ' med stik C</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-116</td>
			<td>TCTCCTCTTCGATGACCGGG</td>
			<td>RV primer til forstærkning af INT2 3 ' med stik C</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-117</td>
			<td>GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTG</td>
			<td>FW primer til forstærkning af INT3 5 ' med Connector D</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-118</td>
			<td>
GCGGAATATTGGCGGAACGG ACACACGTGGATACAAACCTG GACAACGTTttccaaggaggtg AAGAACG</td>
			<td>RV primer til forstærkning af INT3 5 ' med Connector D</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-119</td>
			<td>
AAATAACCACAAACATCCTT CCCATATGCTCGGTCGTGCTTGTT GTACCTgatgggacgtcagcact GTAC</td>
			<td>FW primer til forstærkning af INT3 3 ' med stik E</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-120</td>
			<td>GAGCTTACTCTATATATTCATTC</td>
			<td>RV primer til forstærkning af INT3 3 ' med stik E</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-121</td>
			<td>GTTACTAAACTGGAACTGTCCG</td>
			<td>FW primer til verifikation af integrationen af con5-crtE-conA til INT1 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-122</td>
			<td>CACTGCTAACTACGTTTACTTC</td>
			<td>FW primer til verifikation af integrationen af con5-crtE-conA til INT1 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-123</td>
			<td>CACTGGAACTTGAGCTTGAG</td>
			<td>FW primer til verifikation af integrationen af conB-crtYB-conC til INT2 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-124</td>
			<td>GTCTCCAGCTGAATTGGTCC</td>
			<td>FW primer til verifikation af integrationen af conB-crtYB-conC til INT2 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-125</td>
			<td>CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC</td>
			<td>FW primer til verifikation af integrationen af conD-crtI-conE til INT3 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-126</td>
			<td>GATCGGTCAATTAGGTGAAG</td>
			<td>FW primer til verifikation af integrationen af conD-crtI-conE til INT3 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-127</td>
			<td>CCTTGTCCAAGTAGGTGTCC</td>
			<td>RV primer til verifikation af integrationen af con5-crtE-conA til INT1 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-128</td>
			<td>GCTGTCATGATCTGTGATAAC</td>
			<td>RV primer til verifikation af integrationen af con5-crtE-conA til INT1 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-129</td>
			<td>CTGGCAATGTTGACCAATTGC</td>
			<td>RV primer til verifikation af integrationen af conB-crtYB-conC til INT2 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-130</td>
			<td>CCAACGTGCCTTAAAGTCTG</td>
			<td>RV primer til verifikation af integrationen af conB-crtYB-conC til INT2 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-131</td>
			<td>CCTTACCTTCTGGAGCAGCAG</td>
			<td>RV primer til verifikation af integrationen af conD-crtI-conE til INT3 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-132</td>
			<td>CTGGTTACTTCCCTAAGACTG</td>
			<td>RV primer til verifikation af integrationen af conD-crtI-conE til INT3 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>a. fed-sekvenser angiver forbindelses sekvenser. b. fremad-og bakgrundere betegnes henholdsvis FW og RV.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Supplerende tabel 2: primer-sekvenser.
<img alt="Supplementary Table 3" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable3.jpg"> Supplerende tabel 3: udformning af konstruerede stammer.
<img alt="Supplementary Table 4" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable4.jpg"> Supplerende tabel 4: sekvenser af donor-DNA-udtryks kassetter og afskalning af regioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/Suppl_Table_4.docx" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a-systemet i kombination med et enkelt crRNA-array muliggør effektiv multiplex-redigering af S. cerevisiae -genomet på flere loci samtidigt. Dette påvises ved at konstruere carotenoid producerer gær stammer, som efterfølgende bruges til at skabe gær pixel kunst.

CRISPR/Cas12a multiplex Genome redigering af Saccharomyces cerevisiae og skabelsen af gær pixel kunst

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Denne protokol viser en ny metode til Multiplex Genome Redigering af Saccharomyces cerevisiae ved at indføre flere udtryk kassetter på forskellige loci i en enkelt transformation skridt. Denne kloning gratis plasmid samling tilgang til at udtrykke en enkelt crRNA array, fører til en hurtig, effektiv og fleksibel genom redigering protokol. Vi vil ingeniør vilde type gær celler, til at producere carotenoider ved at indføre gratis heterologe gener på fri genomisk loci.Single crRNA array består af gratis individuelle crRNA'er udtrykt fra RNA polymerasefri promotor. Cas12a behandler in vivo crRNA-systemet i individuelle crRNA'er. CrRNAs guide Cas12a til målet loci på genomisk DNA, hvor Cas12a introducerer dobbelt streng pauser.Nedadgående DNA fragmenter rekombinere til in vivo rekombination og integreres i genomisk DNA. Demonstration af protokollen vil være Klaudia Ciurkot, en ph.d.-studerende. Jeffery van Wijk, en associeret videnskabsmand.Og Brenda Vonk, seniorforsker fra vores laboratorium. Når du har fået et enkelt crRNA-system til Multiplex Genome Redigering af eksperimenter med syntetisk DNA, forberede PCR-forstærkningsblandingen og indlæse arrayet i termocykatoren til forstærkning. For at analysere PCR-produkterne ved hjælp af elektroforese skal du køre prøverne på en 0,8% agarosegel ved 5 V/cm i 40 minutter.Indlæse DNA stigen med DNA fragmenter spænder fra 100 10000 base par Derefter rense PCR produkter ved hjælp af en PCR rensning kit i henhold til instruktionerne fra producenten. For gær transformation, begynde med pre-culturing vilde type gær i en 100 ml kolbe, der indeholder 20 ml gær ekstrakt peptone dextrose eller YEPD medium. For en overnatning inkubation, ved 30 grader Celsius, og 250 rotationer per minut Næste morgen, inokulere 20 ml frisk YEPD medium med en beregnet volumen af natten pre-kultur gær.Kulturen i en rystende inkubator, indtil en optisk tæthed på 1,0, målt ved 600 nanometer, er nået. Høst gærcellerne ved centrifugering. Gærcellepiller i 20 ml rumtemperatur demineraliseret vand, efterfulgt af en ekstra centrifugering.Opslæm pellet i 100 mikroliter af lithium acetat Tris-EDTA opløsning, og overføre gær til en mikrocentrifuge rør. Bland fem mikroliter af enkeltstrenget bære-DNA og et mikrogram plasmid pCSN067 med gærcelleaffjedringen. Bland derefter 600 mikroliter polyethylenglycol LiAc-TE-opløsning med prøven.Inkuber gærcellerne og plasmid i 30 minutter ved 30 grader Celsius og 450 prm i en bordplade varmeblok. Ved slutningen af inkubationen blandes 70 ml dimethylsulfoxid med transformeringsopløsningen. Varme chok blandingen i 15 minutter i en 42 grader Celsius vandbad.Blandingen overføres til et 15 ml rundt bundrør. Tilsæt 10 ml YEPD til røret for en overnatning inkubation ved 30 grader Celsius og 250 rpm. Den næste morgen, indsamle de transformerede celler ved centrifugering, og aspirere alle, men de endelige 200 mikroliter af supernatant.Opspriv den transformerede gærcellepellet i den resterende supernatant. Plade 150 mikroliter af transformation mix, og 150 mikroliter af en 20 gange fortynding af de resterende 50 mikroliter af transformation mix i YEPD, på YEPD agar plader, suppleret med 0,2 gram per liter G418. Efter 48 til 72 timer ved 30 grader Celsius, vælge en enkelt transformant for re-striber på en ny YEPD agar plade suppleret med 0,2 g / l af G418.For den anden transformation, vokse kulturen til en optisk tæthed på 600 nanometer på 1,0, som netop påvist. Og tilsæt 20 mikroliter af celler til et mikrocentrifugerør. Efter centrifugering, resuspend cell pellet i 100 mikroliter af LiAc-TE løsning, og tilsæt ssDNA.I et separat rør skal du kombinere et mikrogram af enkelt crRNA-arrayet, et mikrogram af den lineæriserede modtagerplasmid til crRNA-arrayet, et mikrogram af hver donor-DNA og et mikrogram i hver flankerende region. Overfør derefter DNA-blandingen til røret af kompetente gærceller og fuldfør den anden transformation som påvist for den første transformation. Den næste morgen, indsamle cellerne ved centrifugering og resuspend pellet i en lille aliquot af supernatant.Derefter plade 150 mikroliter af transformation mix, og 150 mikroliter af en 20 gange fortynding af transformation mix i YEPD medium, på YEPD agar plader suppleret med 0,2 g/L G418, og 0,2 g / L nourseothricin Efter 48 til 72 timer, ved 30 grader Celsius, vælge en enkelt farvet transformant for re-striber på en ny YEPD plade for at opnå ensfarvede kolonier. For at bestemme genom redigering effektivitet, tælle antallet af farvede og hvide kolonier på transformation plader, og dividere antallet af farvede kolonier med det samlede antal kolonier. For at skabe gær pixel kunst, inokulere individuelle 500 ml ryste kolber, der indeholder 100 ml YEPD medium med tre forskelligt farvede carotenoid producerer S.cerevisiae stammer, og en vild type CEN.PK113-7D stamme. Inkuber kulturerne natten over ved 30 grader Celsius med rystelser ved 250 rpm. Overfør 0,5 ml af hver nattekultur til individuelle rør, der indeholder 0,5 ml sterilt, ikke-ionisk tæthedsgradientmedium pr. rør, og bland kortvarigt opløsningerne ved vortexing.Overfør cellesuspensionerne til individuelle, kvalificerede reservoir 2 gange 3 brønde. Brug en csv-fil med væskekalibreringsindstillingen 6RES_AQ_GPSA2 på et akustisk væskehandlerinstrument til at få øje på 25 nanoliter af hver S.cerevisiae-stamme fra den relevante kvalificerede reservoirkildeplade på en 6144 brønds-destinationsmikroplade, der indeholder 50 ml YEPD-agar. Når alle brøndene er blevet spottet, inkubere mikropladen på 30 degress Celsius i 48 timer.For at intensivere farverne på stammerne, opbevare agar plader på 4 grader Celsius i mindst 72 timer. Et billede af Rosalind Franklin er dukket op på pladen. Som påvist, promotor, åben læseramme, terminator, og to sammenhængende 50 bp stik sekvenser kan samles i et udtryk kassette via en Golden Gate kloning reaktion, og verificeres af PCR.Efter forstærkning af enkelt crRNA array ved PCR, modtageren plasmid for enkelt crRNA array er lineariseret som bekræftet af elektroforese. Effektiviteten af Multiplex Genome Redigering kan beregnes ved procentdelen af farvede kolonier efter omdannelsen, og af resultaterne af PCR-analyser, der bekræfter integrationen af donor-DNA på de tilsigtede genomiske DNA steder. For eksempel, startende fra en sort og hvid billede af Rosalind Franklin, en fire farve billede og spotting liste blev oprettet, som derefter blev brugt til at få øje på de fire forskellige gær stammer på en agar mikroplade via en akustisk flydende handler, som vist, hvilket resulterer i en høj opløsning gær maleri af videnskabsmanden.Til denne transformation skal du bruge frisklavede opløsninger og DNA-fragmenter af høj kvalitet. Denne metode kan også anvendes til multiplexintroduktion af definerede sletninger og punktmutationer i genomisk DNA. Derudover kan der udføres CRISPR-reguleringseksperimenter.Denne metode kan ændres for at indføre mere end gratis crRNA'er i en matrix for at øge antallet af samtidige ændringer, der kan foretages.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Lensfree On-chip tomografiske Microscopy Under anvendelse af Multi-vinkel belysning og Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Kontinuerlig høj opløsning Mikroskopisk Observation af Replikativ Aging i Spirende Gær

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Teknikker til Udviklingen Robust pentose-gæring Gær til Biokonversion af lignocellulose til ethanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Oprettelse af hjertevæv, der udviser mekanisk integration af sfæroider ved hjælp af 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv Generation og redigering af Feeder-gratis IPSCs fra pancreas celler ved hjælp af CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Optimering af en Multiplex RNA-baserede udtryk analyse ved hjælp af bryst kræft arkivalier

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Mikroinjektion af Western majs-rodorm Diabrotica virgifera virgifera, embryoner for kønscelleoverførsel Transformation, eller CRISPR/Cas9 genom-redigering

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

En netto skimmel-baseret metode til stillads-gratis tre-dimensionelle hjerte væv skabelse

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...