Name: crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

Dit project ontving financiering uit het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 686070 (DD-DeCaf) en 764591 (SynCrop), en uit het onderzoeksprogramma building blocks of Life met projectnummer 737.016.005 door de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO). T.E.G. werd gesteund door de Royal Society (Grant UF160357) en BrisSynBio, een onderzoekscentrum voor synthetische biologie van BBSRC/EPSRC (Grant BB/L01386X/1). We bedanken Zi di en Jeffrey van wijk voor hun bijdrage aan de gist spotting experimenten voor het maken van de gist pixel art.

<ol>
	<li>Knott, G. J., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+guides+the+future+of+genetic+engineering.">CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering.</a> Science. 361 (6405), 866-869 (2018).</li><li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+metabolic+engineering+using+an+orthogonal+tri-functional+CRISPR+system.">Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system.</a> Nature Communications. 8 (1), 1688 (2017).</li><li>Li, Z. -. H., Liu, M., Lyu, X. -. M., Wang, F. -. Q., Wei, D. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+facilitated+large+fragment+deletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).</li><li>Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+facilitated+multiple-chromosome+fusion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).</li><li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Abudayyeh, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector.">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Makarova, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+evolutionary+classification+of+CRISPR-Cas+systems.">An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).</li><li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovi&#269;, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA.">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae.+using+the+CRISPR/Cas+System.">Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601 (2018).</li><li>Ferreira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+CRISPR/Cas9+genome+editing+and+gene+regulation+using+Csy4+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).</li><li>Swarts, D. C., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+versus+Cas12a/Cpf1:+Structure&#8211;function+comparisons+and+implications+for+genome+editing.">Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure&#8211;function comparisons and implications for genome editing.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481 (2018).</li><li>Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Basis+for+DNA+Target+Specificity+of+CRISPR-Cas12a.">Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a.</a> Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).</li><li>Verwaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+beta-carotene+in+Saccharomyces+cerevisiae.+by+successive+transformation+with+carotenogenic+genes+from+Xanthophyllomyces+dendrorhous.">High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).</li><li>Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+enables+fast+and+simple+genome+editing+of+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).</li><li>Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+advances+engineering+of+microbial+cell+factories.">CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories.</a> Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).</li><li>Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3 (11), 3647 (2008).</li><li>Franklin, R. E., Gosling, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+configuration+in+sodium+thymonucleate.">Molecular configuration in sodium thymonucleate.</a> Nature. 171, 740-741 (1953).</li><li>Watson, J. D., Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structure+for+deoxyribose+nucleic+acid.">A structure for deoxyribose nucleic acid.</a> Nature. 171, 737-738 (1953).</li><li>Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+deoxypentose+nucleic+acids.">Molecular structure of deoxypentose nucleic acids.</a> Nature. 171, 738-740 (1953).</li><li>Young, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+algorithm-guided+design+of+massive+strain+libraries,+applied+to+itaconic+acid+production+in+yeast.">Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast.</a> Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).</li><li>Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cloning Method. , (2013).</li><li>Mandel, M., Higa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+bacteriophage+DNA+infection.">Calcium-dependent bacteriophage DNA infection.</a> Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).</li><li>Van Dijken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interlaboratory+comparison+of+physiological+and+genetic+properties+of+four+Saccharomyces+cerevisiae+strains.">An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains.</a> Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Acids Research. 19 (20), 5791 (1991).</li><li>Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+genomic+DNA+from+yeasts+for+PCR-based+applications.">Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications.</a> Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).</li><li>Tak, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+multiplex+gene+regulation+using+CRISPR-Cpf1-based+transcription+factors.">Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors.</a> Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+editing+by+CRISPR-Cpf1+using+a+single+crRNA+array.">Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array.</a> Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).</li><li>Swiat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FnCpf1:+a+novel+and+efficient+genome+editing+tool+for+Saccharomyces+cerevisiae.">FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cpf1-Assisted+Multiplex+Genome+Editing+and+Transcriptional+Repression+in+Streptomyces.">CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces.</a> Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1.">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell Discovery. 3, 17018 (2017).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).</li><li>Perez, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GuideScan+software+for+improved+single+and+paired+CRISPR+guide+RNA+design.">GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).</li><li>Cox, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Biology+Open+Language+Visual+(SBOL+Visual)+Version+2.0.">Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0.</a> Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).</li></ol>

De auteurs verklaren dat er sprake is van een belangenconflict. De auteurs hebben IP gerelateerd aan gepresenteerde methoden ingediend.

Het verstrekte protocol beschrijft multiplex genoom editing van S. cerevisiae met behulp van Cas12a van Lachnospiraceae bacterie ND2006 in combinatie met een enkele crrna array en donor DNA. Het ontwerp van de enkelvoudige crRNA-array en het donor-DNA wordt gedetailleerd toegelicht. In tegenstelling tot het welbekende crispr/Cas9 systeem, heeft de crispr/Cas12a de unieke extra mogelijkheid om meerdere crrna's te verwerken, uitgedrukt in één crrna array13,33. Vanwege deze functie is het gelijktijdig bewerken van meerdere doelen eenvoudiger om in te stellen en kan het worden bereikt in één transformatie. Deze enkele crRNA array aanpak werd eerder gedemonstreerd door Zetsche et al. 34 die gelijktijdig tot vier genen in zoogdiercellen hebben bewerkt met behulp van AsCas12a, en door Swiat et al. 35 die vier DNA-fragmenten introduceerde in een gist-genoom met behulp van FnCas12a. Voor onze kennis is een hoger aantal gelijktijdige genomische modificaties met behulp van een Cas12a-systeem niet gerapporteerd en moet de maximale limiet van de doelen per enkele array voor Cas12a nog worden bepaald. Verder onderzoek met behulp van enkelvoudige crrna-arrays in combinatie met Cas12a omvat multiplex transcriptionele regulering in een breed scala van organismen33,36,37.
Er zijn enkele kritieke stappen in het gepresenteerde protocol. Ontwerp zorgvuldig alle DNA-sequenties die betrokken zijn bij het Cas12a genoom Editing experiment, vooral in het geval dat nieuwe DNA-sequenties worden geïntroduceerd. Bepaal de functionaliteit van nieuwe spacer sequenties deel van een crRNA, bijvoorbeeld door een singleplex genoom Editing experiment zoals beschreven door Verwaal et al. 19 alvorens ze te combineren tot één crrna array. Volg de aanbevelingen voor het voorbereiden van transformatie bufferoplossingen die worden gebruikt in het Cas12a Editing experiment om een goede transformatie efficiëntie van gist te bereiken.
Er zijn enkele optionele modificaties van de techniek. Het wordt aanbevolen om 1 μg van elk donor-DNA, gelineariseerde pRN1120 of enkele crrna array Expression cassette in de transformatie te gebruiken, hoewel het gebruik van een lager DNA-bedrag ook naar verwachting resulteert in een bevredigende transformatie efficiëntie. Voer een test transformatie uit om te bepalen of lagere DNA-bedragen kunnen worden gebruikt. De transformatie van S. cerevisiae kan worden uitgevoerd met een andere methode dan beschreven in dit protocol, bijvoorbeeld het protocol dat is beschreven door Gietz et al. (2007) 38. de gids RNA-ontvanger plasmide pRN1120 is geschikt voor de expressie van een enkele crrna-en enkele crrna-array van verschillende Cas12a-varianten (bijv.van acidaminococcus spp. BV3L6 of Francisella novicida U112) en voor de uitdrukking van sgRNA in combinatie met Cas919. Het donor DNA hoeft niet te worden beperkt tot carotenoïde genexpressie cassettes en flankerende gebieden die het donor DNA targeten op de beschreven INT1, INT2 en INT3 locaties in genomisch DNA. Elk DNA van belang kan op multiplex wijze in genomisch DNA van de gastheer worden geïntroduceerd door de in dit protocol beschreven ontwerpprincipes, of als alternatief kan donor DNA worden gebruikt om DNA van een gastheer genoom te verwijderen. De modulaire structuur van enkele crRNA-array vergemakkelijkt eenvoudige aanpassing van de Spacer en directe herhalings sequenties. Wijziging van de afstandsequenties maakt een verandering van de beoogde integratie Locus mogelijk, die kan worden ontworpen door een van de instrumenten voor de identificatie van een genomische doellocatie, bijvoorbeeld Guide scan software 1,039. In plaats van grote flankerende sequenties te gebruiken die verbindingslijnen bevatten, kan 50-BP van de flankerende regio in de DNA-sequenties van de donor worden opgenomen door de sequenties van deze 50-BP flankerende regio te integreren in de primers die in de PCR worden gebruikt. In dit geval, in totaal slechts drie in plaats van negen donor DNA-fragmenten zijn vereist voor een succesvolle multiplex genoom Editing experiment.
Samengevat, dit protocol biedt stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van multiplex genoom Editing in S. cerevisiae met behulp van Cas12a in combinatie met een enkele crrna array-benadering. Het protocol werd gedemonstreerd door multiplex genoom Editing met behulp van 9 donor DNA fragmenten en enkele crRNA array Coding voor drie Grna's. We tonen hoge algemene bewerkings frequenties tussen 50% en 94% voor de drie strain designs die hier worden gerapporteerd. Tot slot, het unieke kenmerk van Cas12a is de mogelijkheid om een enkele crRNA-array in individuele Crrna's in een cel te verwerken, wat Cas12a een uitstekend hulpmiddel maakt om multiplex genoom te bewerken en transcriptionele regulatie modules te ontwikkelen die gericht zijn op meerdere expressie cassettes in één gaan. Uiteindelijk, drie stammen werden verkregen produceren carotenoïden op een ander niveau en kleuren in tinten tussen geel en oranje. Met die stammen en een wild-type stam, lieten we zien hoe een akoestische vloeistof behandelaar op een rechte manier kan worden gebruikt om gist pixel kunst te maken-dit ter ere van Rosalind Franklin die heeft bijgedragen aan de ontdekking van de DNA-structuur 65 jaar geleden door haar beroemde foto 5123 < /C1 >.

Crispr/CAS enzymen hebben ongetwijfeld een revolutie teweeggebracht in de moleculaire biologie en zijn algemeen aangenomen als hulpmiddelen voor engineering genomen met een snelheid die voorheen onhaalbaar was1. De eerste modificatie van een Saccharomyces cerevisiae genoom door het crispr/Cas9 genoom editing systeem werd gerapporteerd door DiCarlo et al. 2, aantonen van succesvolle gen knock-out en het maken van puntmutaties met behulp van extern geïntroduceerde oligonucleotiden. Verdere ontwikkeling van gist CRISPR Toolbox inbegrepen: transcriptionele regulering door fusie van katalytisch inactief Dead Cas9 (dCas9) met transcriptionele Effector domeinen om activering en uitschakeling van transcriptie3mogelijk te maken, toepassing voor beide genoom editing en regelgevende functies voor metabole traject techniek door gelijktijdige activering, onderdrukking en deletie4, verwijdering van grote fragmenten uit de S. cerevisiae genoome5, en multichromosoom Fusions6 .
CRISPR/CAS genoom bewerkingssystemen vinden hun oorsprong in adaptieve immuunsystemen van bacteriën en archaea en deze systemen zijn aangepast door moleculaire biologen voor genoom bewerking. Hun functionaliteit is gebaseerd op de geclusterd regelmatig Intergespreide korte palindroom herhalingen (CRISPR) DNA-gebieden coderen RNA dat verantwoordelijk is voor de herkenning van het vreemde DNA of RNA en de CRISPR geassocieerde genen (CAS) die RNA-geleide enzym1,7,8,9. Op basis van de recente genoom analyse van crispr/CAS systemen werd voorgesteld om de crispr/CAS systemen te verdelen in twee klassen, vijf types en 16 subtypen10. De twee klassen worden onderscheiden op basis van de organisatie van Effector complexen die betrokken zijn bij Target decolleté. Meestal zijn crispr/CAS-systemen met een multi-subeenheid-organisatie gecategoriseerd als klasse 1, terwijl enkele subeenheid Effector-complexen behoren tot klasse 210,11. In dit artikel, onderzoeken we de klasse 2 type V Cas12a, voorheen Cpf110,12genoemd, wat een alternatief is voor het klasse 2 type II Cas9. Hoewel Cas9 goed wordt gekarakteriseerd en op grote schaal wordt gebruikt in onderzoek, biedt Cas12a extra functies12. Ten eerste vormt Cas12a een complex met CRISPR RNA (crRNA) van 42 tot 44 nucleotiden zonder dat er een extra trans-activerende CRISPR RNA (tracrRNA) nodig is. Daarom kan een kortere handleiding RNA worden gebruikt in genoom Editing met CRISPR/Cas12a systemen in vergelijking met CRISPR/Cas9. Ten tweede maakt de unieke endonuclease-en endoribonuclease-activiteit van Cas12a de rijping van zijn pre-crRNA-13mogelijk. Deze RNase-activiteit maakt het mogelijk om meerdere Crrna's op één CRISPR crRNA-array te coderen, terwijl Cas9 de afzonderlijke uitdrukking vereist van elke zogenaamde enkelvoudige gelei-RNA (sgRNA) of als alternatief, bijvoorbeeld expressie van een extra endonuclease ( bijvoorbeeldCsy4) in combinatie met herkennings motieven voor Csy4 rondom elke sgrna14,15. Ten derde vereist Cas12a herkenning van de doelsite een protospacer aangrenzend motief (PAM) op het 5 ' uiteinde van het doel en Slaid na de + 18/+ 23 positie van zijn pam, resulterend in gespleten DNA met kleverige uiteinden, terwijl Cas9 een pam moet hebben die zich op het 3 ' uiteinde van de target en deaves na de-3 positie waardoor botte eind sneden in het DNA12ontstaan. Ten vierde verschilt de consensus nucleotide-sequentie van de PAM van Cas12a ((T) TTV) en Cas9 (NGG), wat Cas12a een veelbelovende kandidaat maakt voor het targeten van T-Rich promoter en Terminator sequences16. Ten slotte meldde een recente studie een grotere doel specificiteit voor Cas12a dan voor de inheemse Cas917.
We presenteren een protocol voor het gebruik van het CRISPR/Cas12a-systeem voor genoom bewerking van S. cerevisiae met een bijzondere focus op de introductie van meerdere DNA-expressie cassettes in onafhankelijke genomische loci tegelijk (multiplex genoom bewerking) met behulp van een enkele crRNA-array. De belangrijkste stappen van het protocol worden afgebeeld in Figuur 1. Als proof of concept werd het CRISPR/Cas12a-systeem toegepast voor de introductie van drie uitdrukkings cassettes in het genoom van S. cerevisiae , die de productie van β-caroteen18 als schematisch weergegeven in Figuur 2mogelijk maken. De productie van β-caroteen beïnvloedt het fenotype van S. cerevisiae: d.w.z.na een geslaagde introductie van alle drie heterologeuze genen die nodig zijn voor de biosynthese van carotenoïden, worden de witte s. cerevisiae -cellen geel of oranje, afhankelijk van de expressie sterkte van de promotor van elk gen. Door de eenvoudige visuele uitlezen van dit traject is het geïntroduceerd om geavanceerde crispr-gebaseerde systemen en methoden voor het bewerken van genoom19,20te ontwikkelen. In dit werk zijn expressie cassettes die de carotenoïde genen CRTE, crtyb en crti coderen met behulp van een Golden Gate klonen (GGC)-aanpak21 met heterologeuze promotors en homologe terminators opgebouwd. gebruikt om de expressie van de genen te stimuleren. De expressie cassettes worden omgeven door unieke 50-base pairs (BP) sequenties, genaamd connectors, die toelaten in vivo assemblage met integratie flank DNA sequenties (flankerende regio's) met dezelfde 50-BP sequenties, en daaropvolgende integratie in het genomische DNA van gist op de positie bepaald door de flankerende gebieden. Door het gebruik van verschillende promotor sterktes, stammen met verschillende niveaus van carotenoïden productie werden verkregen resulterend in variatie in kleur van de cellen. Deze stammen-geïnspireerd door het "gist kunst project"22 -werden gebruikt in een spotting Setup met een akoestische Liquid handler om een 4-color High-Resolution "gist foto" van Rosalind Franklin te creëren. Franklin (1920-1958) was een Engelse scheikundige en Röntgen kristallograaf die bekend stond om haar bijdrage aan de ontdekking van de DNA-structuur door foto 5123,24,25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals specific for the protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td style="width:175px;">Selection of E. coli transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">BsaI-HF (20 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R353L</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td style="width:175px;">Transfromation of 
			S. cerevisiae (carrier DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">dNTPs</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethanol absolute for analysis</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethylenediamine-tetraacetic acid</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Histodenz</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D2158&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Yeast pixel art</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100993</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nancy-520 DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>1494</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NEB10 competent E. coli cells</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>C3019H</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nourseothricin</td>
			<td style="width:144px;">Jena Bioscience</td>
			<td>AB102</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Phusion buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Polyethylene glycol 4000</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>7490</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:156px;">Purple loading dye</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td style="width:175px;">Purification of plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">RNase coctail enzyme mix</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>46300-018</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA Ligase (1 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>1705218</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit</td>
			<td style="width:144px;">Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td style="width:175px;">Purification of PCR products and linearized pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Xhol</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Zymolyase 50 mg/ml (5 units/&#181;L)</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1006</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:156px;">Zymolyase storage buffer</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1004-B</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals of general use</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">2*Peptone-Yeast extract (PY) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">2*PY medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Demineralized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">ELFO buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">MQ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Physiological salt solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">YEPD (2% glucose) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microplate 96 wells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 0.5 - 10 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 10 - 200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Pipette tips 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Shake flasks (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Sterile filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Centrifuge (Falcon tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Echo 525 acoustic liquid handler</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">NanoDrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Set for eletrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Table centrifuge (Eppendorfs tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCSN067</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101748</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pRN1120</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101750</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">S. cerevisiae strain 
			CEN.PK113-7D</td>
			<td style="width:144px;">EUROSCARF collection</td>
			<td></td>
			<td>http://www.euroscarf.de</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art

Hoog rendement, gebruiksgemak en veelzijdigheid van de geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen/CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (CRISPR/Cas9) systeem heeft de gevorderde genetische modificatie van Saccharomyces cerevisiaevergemakkelijkt, een model organisme en het werkpaard in de industriële biotechnologie. CRISPR-geassocieerde proteïne 12a (Cas12a), een RNA-geleide endonuclease met kenmerken die te onderscheiden zijn van Cas9, wordt toegepast in dit werk, waardoor de moleculaire Toolbox verder wordt uitgebreid voor genoom bewerkings doeleinden. Een voordeel van de crispr/Cas12a systeem is dat het kan worden gebruikt in multiplex genoom Editing met meerdere gids rna's uitgedrukt uit een enkele transcriptionele eenheid (single crispr RNA (crrna) array). We presenteren een protocol voor multiplex integratie van meerdere heterologeuze genen in onafhankelijke loci van het S. cerevisiae genoom met behulp van het crispr/Cas12a systeem met meerdere Crrna's uitgedrukt uit een enkele crrna array construct. De voorgestelde methode benut het vermogen van S. cerevisiae om in vivo recombinatie van DNA-fragmenten uit te voeren om de enkelvoudige crrna-array in een plasmide te monteren die kan worden gebruikt voor de selectie van de Gasste, evenals de samenstelling van het donor DNA sequenties die integreren in het genoom op de beoogde posities. Cas12a wordt vooruitgedruct in constitutief, waardoor het decolleté van het S. cerevisiae genoom op de beoogde posities wordt vergemakkelijkt bij de uitdrukking van de enkelvoudige crrna-array. Het protocol omvat het ontwerp en de constructie van een enkele crRNA array en donor DNA expressie cassettes, en exploiteert een integratie aanpak die gebruik maakt van unieke 50-BP DNA connectors sequenties en afzonderlijke integratie flank DNA sequenties, die vereenvoudigt experimenteel ontwerp door standaardisatie en modularisatie en breidt het toepassingsgebied uit. Ten slotte demonstreren we een eenvoudige techniek voor het maken van gist pixel kunst met een akoestische vloeistof handler met verschillend gekleurde carotenoïde producerende giststammen die werden geconstrueerd.

Het protocol voor multiplex genoom Editing met behulp van crisrp/Cas12a werd aangetoond door de bouw van drie carotenoïde produceren S. cerevisiae stammen uitdrukken van de CRTE, crtyb en crti genen met behulp van heterologe promoters van hoge, gemiddelde en lage sterkte: stam 1, 2 en, 3 respectievelijk (supplementaire tabel 3). De bouw van deze stammen vereist het genereren van drie donor-DNA-expressie cassettes en zes flankerende gebieden per stam voor targeting op drie verschillende loci in genomisch DNA (weergegeven in Figuur 2B). Zoals hierin beschreven, werden Promoter, open reading frame, Terminator en twee aaneengesloten 50-BP connectoren sequenties samengevoegd in een Expression cassette via een Golden Gate kloon reactie en werd de assemblage geverifieerd door PCR (Figuur 3a). De enkelvoudige crRNA-array werd besteld als een synthetisch DNA-fragment en werd versterkt door PCR (Figuur 3B). De ontvangende plasmide voor de enkelvoudige crrna array (plasmide pRN1120) werd gelineariseerde met EcoRI-HF en xhoI en linearisatie werd bevestigd door elektroforese (Figuur 3C). Het ontwerp en de nucleotide-sequenties van de geïntroduceerde donor-DNA-expressie cassettes en flankerende gebieden worden weergegeven in aanvullende tabel 3 en aanvullende tabel 4. De opeenvolging van enkelvoudige crRNA array-expressie cassettes is beschikbaar in de aanvullende tabel 1. Functionaliteit van de spacers opgenomen in de single crRNA array werd vooraf getest door singleplex genoom Editing met individuele Crrna's19.
De efficiëntie van genoom bewerking met behulp van Cas12a werd eerst geëvalueerd op basis van het aantal gekleurde kolonies verkregen na transformatie (tabel 1, Figuur 4). De bewerkings efficiëntie van de drie gebouwde stammen varieerden van 50% tot 94%. Met name de introductie van expressie cassettes die worden gebruikt om stam 1 te genereren, heeft de laagste bewerkings efficiëntie weergegeven, mogelijk veroorzaakt door de aard van het donor-DNA (d.w.z.deze expressie cassettes coderen CRTE, Crtyb en crti van drie hogekrachtpromo tors). Ten tweede werd de correcte integratie van de drie donor-DNA-expressie cassettes op de beoogde loci op het genomische DNA bevestigd door PCR (Figuur 5). Primers werden zo ontworpen dat PCR-producten werden verkregen wanneer de juiste integratie van het donor-DNA op de beoogde locatie plaatsvond. Voor elk transformatie experiment werden acht kolonies uit de transformatie plaat geplukt en getest (merk op dat er slechts drie worden weergegeven in Figuur 5). In het algemeen, van de 8 onderzochte kolonies per donor-DNA, werd de correcte integratie van het CRTE donor-DNA bij de INT1 Locus, CRTYB bij de INT2 Locus en crti op de INT3 Locus bevestigd in > 90% van de transformanten. Deze resultaten demonstreren het CRISPR/Cas12a systeem in combinatie met een enkele crRNA array maakt efficiënte multiplex bewerking van de S. cerevisiae genoom op meerdere loci tegelijk mogelijk.
Daarnaast demonstreren we de creatie van "gist pixel art" met behulp van de drie carotenoïde producerende stammen die samen met een niet-gekleurde wild-type stam werden geconstrueerd. Beginnend met een zwart-wit beeld van Rosalind Franklin (Figuur 6a), werd een afbeelding met 4 kleuren (Figuur 6B) en spotting List gemaakt die vervolgens werd gebruikt om de vier verschillende giststammen op een agar-microplaat te spotten met behulp van een akoestische Liquid handler, resulterend in een hoge resolutie "gist schilderij" van Rosalind Franklin (Figuur 6C, D, E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig1v5.jpg"> Figuur 1 : Workflow van het protocol voor CRISPR/Cas12a multiplex genoom Editing in S. cerevisiae. De werkstroom bevat cruciale stappen van de gepresenteerde methode. Zie het protocol voor meer informatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig2.jpg"> Figuur 2 : Schema van CRISPR/Cas12a multiplex genoom bewerking met behulp van een enkele crRNA-array. (A) de enkelvoudige crrna-array bestaat uit drie crRNAs-eenheden in hun volwassen vorm, een directe herhaling van 20 BP die specifiek is voor LbCas12a (Grijze vierkantjes) met een 23-BP geleidings sequentie (gekleurde diamanten). Expressie van de crRNA-array wordt ingeschakeld door de SNR52 promoter en SUP4 Terminator. Transformatie van S. cerevisiae met een gelineariseerde pRN1120 en de enkelvoudige crrna array Expression cassette met homologie met pRN1120 (diagonale strepen) maakt een in vivo recombinatie mogelijk in een circulair plasmide in cellen die vooraf LbCas12a. De enkelvoudige crRNA-array wordt vervolgens verwerkt door Cas12a. B) Cas12a is gericht op de beoogde INT1, INT2 en INT3 genomische doellocaties en creëert dubbele gestrande pauzes. In het transformatie mengsel werden donor-DNA bestaande uit flankerende gebieden en de carotenoïde genexpressie cassette opgenomen. Donor-DNA-assemblages werden gericht op één stuk DNA in genomisch DNA rond de INT1 (CRTE), INT2 (crtyb) en INT3 (crti) loci door in vivo recombinatie door de aanwezigheid van 50-BP homologe connectors sequenties, aangeduid als 5, A, B, C, D of E. P1 – P3, verschillende promotors; T1 – T3, verschillende terminators. Dit cijfer is gewijzigd van Verwaal et al. 201819. Genetische constructies getoond met behulp van synthetische biologie open Language (SBOL) visuele symbolen40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig3.jpg"> Figuur 3 : PCR controle van de genoom bewerking experimenten. A) verificatie van de gouden poort klonen reacties van geassembleerde donor DNA cassettes. Verkregen resultaten zijn in overeenstemming met de verwachte lengtes. B) PCR van de enkelvoudige crrna-array. C) linearisatie van plasmide pRN1120. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig4.jpg"> Figuur 4 : Platen van S. cerevisiae transformaties met behulp van de multiplex genoom Editing aanpak. A) stam 1 die CRTE, crtyb en crti uitdrukt van drie sterke promotors (donker oranje kolonies). B) stam 2 waarin CRTE, Crtyb en crti uit drie middelgrote sterkte bevorderaar (oranje kolonies) worden uitgesproken. C) stam 3 uitdrukken van CRTE, Crtyb en crti van drie lage-sterkte bevorderaar (gele kolonies). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig5.jpg"> Figuur 5 : PCR verifieert de integratie van de donor-DNA-expressie cassettes op de beoogde loci binnen het genomische DNA. A) verificatie van drie kolonies van de stam 1. B) verificatie van drie kolonies van de stam 2. C) verificatie van drie kolonies van de stam 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig6.jpg"> Figuur 6 : Gist pixel art van Rosalind Franklin. (A) zwart-wit RGB-foto van 220 × 280 pixels van Rosalind Franklin die als sjabloon werd gebruikt. (B) computer conversie van de zwart-witfoto van Rosalind Franklin in een 4-kleurige 64 × 96 pixel lijst. C) foto van gist pixelart met 64 × 96 gist kolonies met een ingezoomd gedeelte. D) foto van een akoestische vloeistof behandelaar met twee volgroeide platen. E) foto van een volgroeide microplaat met 64 × 96 gist kolonies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Stam 1</td>
			<td>Stam 2</td>
			<td>Stam 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gekleurde kolonies</td>
			<td>16</td>
			<td>279</td>
			<td>220</td>
		</tr>
<tr>
<td>Witte kolonies</td>
			<td>16</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totaal kolonies</td>
			<td>32</td>
			<td>297</td>
			<td>238</td>
		</tr>
<tr>
<td>Efficiëntie</td>
			<td>50%</td>
			<td>94%</td>
			<td>92%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Bewerk de efficiëntie van de multiplex genoom Editing aanpak.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>crRNA array sequentiea, b, c, d, e, f</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Catgtttgacagcttatcatcgataatccggagctagcatgcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcag Tctttgaaaa GATAATGTATGATTATGCTTTCACTCATATTTATACAGAAACTTGATGTTTTCTTTCGAGTATATACAAGG TGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCA TTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGC ATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCAatttctactaagtgtagat CTGGTGGGAGAAAGCTTATGAAatttctactaagtgtagatgtgccgtac GCCGGAGCCGACGGAatttctactaagtgtagattgcccctcttatacgattatattTT TTTTTGTTTTTTATGTCTggggggcccggtacccagcttttgttccctttagtgagg GTTAATTCCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG
</td>
		</tr>
<tr>
<td>a. homologie aan pRN1120 (Bold). b. SNR52 promotor (cursief). c. genomische streef reeksen (onderstreept). d. Guide direct herhalingen specifiek voor LbCas12a (cursief, vet). e. SUP4 Terminator (cursief). f. homologie aan pRN1120 (Bold).</td>
		</tr>
</tbody></table>Aanvullende tabel 1: enkelvoudige crRNA-array voor LbCas12a die homologie met plasmide pRN1120 bevat.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>Naam</td>
			<td>Volgordea</td>
			<td>Omschrijvingb</td>
			<td>Gebruikt in punt</td>
		</tr><tr><td>KC-101</td>
			<td>GEAAND, Nederland</td>
			<td>FW primer voor versterking van enkele crRNA array</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-102</td>
			<td>CACACAGGAAACAGCTATGAC</td>
			<td>RV primer voor versterking van enkele crRNA array</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-103</td>
			<td>AAGCGACTTCCAATCGCTTTGC</td>
			<td>FW primer voor versterking van donor DNA met connector 5</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-104</td>
			<td>Een van de meest GEAAGDE</td>
			<td>RV primer voor versterking van donor DNA met connector A</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-105</td>
			<td>EEN van de meest GEGE-</td>
			<td>FW primer voor versterking van donor DNA met connector B</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-106</td>
			<td>CAACAGGAGGCGGATGGATATAC</td>
			<td>RV primer voor versterking van donor DNA met connector C</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-107</td>
			<td>AACGTTGTCCAGGTTTGTATCC</td>
			<td>FW primer voor versterking van donor DNA met connector D</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-108</td>
			<td>Een van de meest GEAAGDE</td>
			<td>RV primer voor versterking van donor DNA met connector E</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-109</td>
			<td>Een van de meest GESMOKKELDE bloemen</td>
			<td>FW primer voor versterking van INT1 5 ' met connector 5</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-110</td>
			<td>
Een van de meest GEKKEN TGGATATGCAAAGCGATTGGAA GTCGCTTgactcctctgccgtc ATTCC</td>
			<td>RV primer voor versterking van INT1 5 ' met connector 5</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-111</td>
			<td>
GEAGLDE, Een van de meest GEKKEN. TGCTTTaagcgttgaagtttcctc TTTG</td>
			<td>FW primer voor versterking van INT1 3 ' met connector A</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-112</td>
			<td>TGTCAACTGGAGAGCTATCG</td>
			<td>RV primer voor versterking van INT1 3 ' met connector A</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-113</td>
			<td>AGAAGATTTCTCTTCAATCTC</td>
			<td>FW primer voor versterking van INT2 5 ' met connector B</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-114</td>
			<td>
TGCTAAGATTTGTGTTCGTT TGGGTGCAGTCGGTTGTGTACAT CGATCCGcccttatcaaggatacc TGGTTG</td>
			<td>RV primer voor versterking van INT2 5 ' met connector B</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-115</td>
			<td>
Een van de meest GEKKEN Een van de meest GECATONE CCTGTTGGGCGATTACACAAGCG GTGG</td>
			<td>FW primer voor versterking van INT2 3 ' met connector C</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-116</td>
			<td>TCTCCTCTTCGATGACCGGG</td>
			<td>RV primer voor versterking van INT2 3 ' met connector C</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-117</td>
			<td>Een van de meest GEAGLDE</td>
			<td>FW primer voor versterking van INT3 5 ' met connector D</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-118</td>
			<td>
Een van de meest GESMOKKELDE schoenen EEN van de meest gebruikte GACAACGTTttccaaggaggtg AAGAACG</td>
			<td>RV primer voor versterking van INT3 5 ' met connector D</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-119</td>
			<td>
Een van de meest gebruikte CCCATATGCTCGGTCGTGCTTGTT GTACCTgatgggacgtcagcact GTAC</td>
			<td>FW primer voor versterking van INT3 3 ' met connector E</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-120</td>
			<td>Een van de meest toegepaste</td>
			<td>RV primer voor versterking van INT3 3 ' met connector E</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-121</td>
			<td>EEN van de meest GEKKEN.</td>
			<td>FW primer voor de verificatie van de integratie van con5-crtE-conA naar INT1 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-122</td>
			<td>Een van de meest GEKKEN</td>
			<td>FW primer voor de verificatie van de integratie van con5-crtE-conA naar INT1 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-123</td>
			<td>Een van de meest GEKKEN</td>
			<td>FW primer voor de verificatie van de integratie van conB-crtYB-conC tot INT2 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-124</td>
			<td>GTCTCCAGCTGAATTGGTCC</td>
			<td>FW primer voor de verificatie van de integratie van conB-crtYB-conC tot INT2 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-125</td>
			<td>CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC</td>
			<td>FW primer voor de verificatie van de integratie van conD-crtI-conE naar INT3 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-126</td>
			<td>Een van de meest GEAGLTE schoenen</td>
			<td>FW primer voor de verificatie van de integratie van conD-crtI-conE naar INT3 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-127</td>
			<td>Een van de meest creatieve</td>
			<td>RV primer voor verificatie van de integratie van con5-crtE-conA naar INT1 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-128</td>
			<td>GCTGTCATGATCTGTGATAAC</td>
			<td>RV primer voor verificatie van de integratie van con5-crtE-conA naar INT1 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-129</td>
			<td>CTGGCAATGTTGACCAATTGC</td>
			<td>RV primer voor verificatie van de integratie van conB-crtYB-conC tot INT2 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-130</td>
			<td>Een van de meest GEKKEN</td>
			<td>RV primer voor verificatie van de integratie van conB-crtYB-conC naar INT2 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-131</td>
			<td>CCTTACCTTCTGGAGCAGCAG</td>
			<td>RV primer voor verificatie van de integratie van conD-crtI-conE tot INT3 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-132</td>
			<td>CTGGTTACTTCCCTAAGACTG</td>
			<td>RV primer voor verificatie van de integratie van conD-crtI-conE tot INT3 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>a. vette reeksen duiden op verbindingsreeksen. b. voorwaartse en omgekeerde primers worden aangeduid als FW en RV, respectievelijk.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Aanvullende tabel 2: primer sequenties.
<img alt="Supplementary Table 3" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable3.jpg"> Aanvullende tabel 3: ontwerp van geconstrueerde stammen.
<img alt="Supplementary Table 4" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable4.jpg"> Aanvullende tabel 4: sequenties van donor-DNA-expressie cassettes en Schilde gebieden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/Suppl_Table_4.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

Het CRISPR/Cas12a systeem in combinatie met een enkele crRNA array maakt efficiënte multiplex bewerking van de S. cerevisiae genoom op meerdere loci tegelijk mogelijk. Dit wordt aangetoond door het construeren van Carotenoïde producerende giststammen die vervolgens worden gebruikt om gist pixel kunst te maken.

CRISPR/Cas12a multiplex genoom bewerking van Saccharomyces cerevisiae en de creatie van gist pixel art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Dit protocol toont een nieuwe methode voor Multiplex Genome Editing van Saccharomyces cerevisiae door de invoering van meerdere expressie cassettes op verschillende loci in een enkele transformatie stap. Deze kloonvrije plasmideassemblagebenadering voor het uitdrukken van één crRNA-array, leidt tot een snel, efficiënt en flexibel genoombewerkingsprotocol. We zullen wilde gistcellen ontwerpen, om carotenoïden te produceren door vrije heterologe genen op vrije genomische loci te introduceren.De enkele crRNA-array bestaat uit gratis individuele crRNAs, uitgedrukt uit RNA polymerase vrije promotor. Cas12a verwerkt in vivo de crRNA-array in individuele crRNAs. De crRNAs begeleiden Cas12a naar de doellening op het genomische DNA waar Cas12a dubbele strengbreuken introduceert.Neerwaartse DNA-fragmenten hercombineren voor in vivo recombinatie en integreren in genomisch DNA. Het protocol wordt aan te tonen door Klaudia Ciurkot, een promovendus. Jeffery van Wijk, an Associate Scientist.En Brenda Vonk, senior associate scientist van ons laboratorium. Na het verkrijgen van een enkele crRNA-array voor Multiplex Genome Editing-experimenten met synthetisch DNA, bereidt u de PCR-versterkingsmix voor en laadt u de array in de thermocycler voor versterking. Om de PCR-producten te analyseren door middel van elektroforese, voer de monsters op een 0,8% agarose gel op 5 V/cm gedurende 40 minuten.Laad de DNA-ladder met de DNA-fragmenten, variërend van 100 10000 basisparen En zuiver de PCR-producten vervolgens met behulp van een PCR-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant. Voor gist transformatie, beginnen met pre-culturing wilde type gist in een 100 mL kolf met 20 mL van gistextract peptone dextrose of YEPD medium. Voor een nachtelijke incubatie, bij 30 graden Celsius en 250 rotaties per minuut De volgende ochtend inent u 20 mL vers YEPD-medium met een berekend volume van 's nachts pre-kweekgist.Plaats de cultuur in een schuddende incubator tot een optische dichtheid van 1.0, gemeten op 600 nanometer is bereikt. Oogst de gistcellen door centrifugatie. Was de gistcelpellet in 20 mL kamertemperatuur gedemineraliseerd water, gevolgd door een extra centrifugatie.Resuspend de pellet in 100 microliters van lithiumacetaat Tris-EDTA oplossing, en breng de gist naar een microcentrifuge buis. Meng vijf microliters van enkelstrengs drager-DNA en één microgram plasmide pCSN067 met de gistcelsuspensie. Meng vervolgens 600 microliters polyethyleenglycol LiAc-TE-oplossing met het monster.Incubeer de gistcellen en plasmid gedurende 30 minuten bij 30 graden Celsius en 450 prm in een tafelblad warmteblok. Meng aan het einde van de incubatie 70 mL dimethylsulfoxide met de transformatieoplossing. Verwarm schok het mengsel gedurende 15 minuten in een 42 graden Celsius waterbad.Breng het mengsel over op een ronde onderbuis van 15 mL. Voeg 10 mL YEPD toe aan de buis voor een nachtelijke incubatie bij 30 graden Celsius en 250 rpm. De volgende ochtend, verzamel de getransformeerde cellen door centrifugatie, en aspirate alle, behalve de laatste 200 microliter van de supernatant.Resuspend de getransformeerde gistcel pellet in de resterende supernatant. Plaat 150 microliter van de transformatiemix, en 150 microliter van een 20 keer verdunning van de resterende 50 microliter van transformatiemix in YEPD, op YEPD agarplaten, aangevuld met 0,2 gram per liter G418. Kies na 48 tot 72 uur bij 30 graden Celsius een enkele transformator voor re-streaking op een nieuwe YEPD agar plaat aangevuld met 0,2 g/L G418.Voor de tweede transformatie, groeien de cultuur tot een optische dichtheid op 600 nanometer van 1,0, zoals net aangetoond. En voeg 20 microliter cellen toe aan een microcentrifugebuis. Na centrifugatie, resuspend de celpellet in 100 microliters van LiAc-TE oplossing, en voeg ssDNA.Combineer in een aparte buis één microgram van de enkele crRNA-array, één microgram van de gelinelineiseerde ontvanger plasmid voor de crRNA-array, één microgram van elk donor-DNA en één microgram van elk flankerend gebied. Breng vervolgens het DNA-mengsel over naar de buis van bevoegde gistcellen en voltooi de tweede transformatie zoals aangetoond voor de eerste transformatie. De volgende ochtend, verzamel de cellen door centrifugatie en resuspend de pellet in een kleine aliquot van supernatant.Dan plaat 150 microliter van de transformatie mix, en 150 microliters van een 20 keer verdunning van de transformatiemix in YEPD-medium, op YEPD agar-platen aangevuld met 0,2 g/L G418, en 0,2 g/L nourseothricin Na 48 tot 72 uur, bij 30 graden Celsius, kies je een enkel gekleurd transformant voor re-streaking op een nieuwe YEPD-plaat om enkele gekleurde kolonies te verkrijgen. Om de genoombewerkingsefficiëntie te bepalen, telt u het aantal gekleurde en witte kolonies op de transformatieplaten en deelt u het aantal gekleurde kolonies door het totale aantal kolonies. Om gist pixel art te maken, inenting individuele 500 mL shake kolven met 100 mL yepd medium met drie verschillend gekleurde carotenoïde produceren S.cerevisiae stammen, en een wild type CEN.PK113-7D stam. Incubeer de culturen 's nachts bij 30 graden Celsius met schudden bij 250 rpm. Breng 0,5 mL van elke nachtcultuur over naar afzonderlijke buizen met 0,5 mL steriele, niet-ionische dichtheidgradiënt medium per buis, en meng de oplossingen kort door vortexing.Breng de cel schorsingen naar individuele, gekwalificeerde reservoir 2 bij 3 putten. Gebruik een csv-bestand met de vloeistofkalibratie-instelling 6RES_AQ_GPSA2 op een akoestisch vloeistofhandlerinstrument om 25 nanoliter van elke S.cerevisiae-stam te spotten van de juiste gekwalificeerde reservoirbronplaat op een 6144 putbestemmingsmicroplate met 50 mL YEPD agar. Wanneer alle putten zijn gespot, incubeer de microplaat op 30 degress Celsius voor 48 uur.Om de kleuren van de stammen te intensiveren, bewaar de agar platen op 4 graden Celsius voor ten minste 72 uur. Een foto van Rosalind Franklin is verschenen op de plaat. Zoals aangetoond, promotor, open leesframe, terminator, en twee aaneengesloten 50 bp connector sequenties kunnen worden gemonteerd in een expressie cassette via een Golden Gate klonen reactie, en geverifieerd door PCR.Na versterking van de enkele crRNA-array door PCR, wordt de ontvanger plasmid voor de enkele crRNA-array gelinelinealiseerd zoals bevestigd door elektroforese. De efficiëntie van de Multiplex Genome Editing kan worden berekend door het percentage gekleurde kolonies na de transformatie, en door de resultaten van PCR-analyses die de integratie van donor-DNA op de beoogde genomische DNA-locaties bevestigen. Bijvoorbeeld, uitgaande van een zwart-wit foto van Rosalind Franklin, een vier kleuren foto en spotting lijst die vervolgens werd gebruikt om de vier verschillende giststammen ter plaatse op een agar microplate via een akoestische vloeistof handler, zoals aangetoond, wat resulteert in een hoge resolutie gist schilderij van de wetenschapper.Gebruik voor deze transformatie vers bereide oplossingen en DNA-fragmenten van hoge kwaliteit. Deze methode kan ook worden toegepast voor multiplex introductie van gedefinieerde deleties en puntmutaties in genomisch DNA. Daarnaast kunnen CRISPR-regulatie-experimenten worden uitgevoerd.Deze methode kan worden gewijzigd om meer dan gratis crRNAs binnen een array te introduceren om het aantal gelijktijdige wijzigingen te verhogen dat kan worden aangebracht.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plasma Lithografie Surface Patterning voor de schepping van Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Lensfree On-chip Tomografische Microscopie Gebruikmakend van Multi-angle Verlichting en Pixel Super-resolutie

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Technieken voor de evolutie van de Robuuste Pentose hoge gisting Gist voor Bioconversie van omzetting van lignocellulose Ethanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Het creëren van cardiale weefsels die mechanische integratie van sferoïden tonen met behulp van 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Optimalisatie van een Multiplex RNA gebaseerde expressie-Assay met behulp van borst kanker archiefmateriaal

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection van Western maïswortelboorder, Diabrotica virgifera virgifera, embryo's voor Germline transformatie of CRISPR/Cas9 genoom bewerking

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Een netto schimmel gebaseerde methode van de steiger-free driedimensionale cardiale weefsel schepping

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...