Name: crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

Dieses Projekt wurde aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Fördervereinbarung Nr. 686070 (DD-DeCaf) und 764591 (SynCrop) sowie aus dem Forschungsprogramm Bausteine des Lebens mit der Projektnummer 737.016.005 von der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO). T.E.G. wurde von der Royal Society (Grant UF160357) und BrisSynBio, einem BBSRC/EPSRC Synthetic Biology Research Centre (Grant BB/L01386X/1), unterstützt. Wir danken Zi Di und Jeffrey van Wijk für ihren Beitrag zu den Hefe-Spotting-Experimenten zur Entstehung der Hefe-Pixel-Kunst.

<ol>
	<li>Knott, G. J., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+guides+the+future+of+genetic+engineering.">CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering.</a> Science. 361 (6405), 866-869 (2018).</li><li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+metabolic+engineering+using+an+orthogonal+tri-functional+CRISPR+system.">Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system.</a> Nature Communications. 8 (1), 1688 (2017).</li><li>Li, Z. -. H., Liu, M., Lyu, X. -. M., Wang, F. -. Q., Wei, D. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+facilitated+large+fragment+deletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).</li><li>Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+facilitated+multiple-chromosome+fusion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).</li><li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Abudayyeh, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector.">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Makarova, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+evolutionary+classification+of+CRISPR-Cas+systems.">An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).</li><li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovi&#269;, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA.">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae.+using+the+CRISPR/Cas+System.">Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601 (2018).</li><li>Ferreira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+CRISPR/Cas9+genome+editing+and+gene+regulation+using+Csy4+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).</li><li>Swarts, D. C., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+versus+Cas12a/Cpf1:+Structure&#8211;function+comparisons+and+implications+for+genome+editing.">Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure&#8211;function comparisons and implications for genome editing.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481 (2018).</li><li>Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Basis+for+DNA+Target+Specificity+of+CRISPR-Cas12a.">Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a.</a> Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).</li><li>Verwaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+beta-carotene+in+Saccharomyces+cerevisiae.+by+successive+transformation+with+carotenogenic+genes+from+Xanthophyllomyces+dendrorhous.">High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).</li><li>Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+enables+fast+and+simple+genome+editing+of+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).</li><li>Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+advances+engineering+of+microbial+cell+factories.">CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories.</a> Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).</li><li>Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3 (11), 3647 (2008).</li><li>Franklin, R. E., Gosling, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+configuration+in+sodium+thymonucleate.">Molecular configuration in sodium thymonucleate.</a> Nature. 171, 740-741 (1953).</li><li>Watson, J. D., Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structure+for+deoxyribose+nucleic+acid.">A structure for deoxyribose nucleic acid.</a> Nature. 171, 737-738 (1953).</li><li>Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+deoxypentose+nucleic+acids.">Molecular structure of deoxypentose nucleic acids.</a> Nature. 171, 738-740 (1953).</li><li>Young, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+algorithm-guided+design+of+massive+strain+libraries,+applied+to+itaconic+acid+production+in+yeast.">Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast.</a> Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).</li><li>Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cloning Method. , (2013).</li><li>Mandel, M., Higa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+bacteriophage+DNA+infection.">Calcium-dependent bacteriophage DNA infection.</a> Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).</li><li>Van Dijken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interlaboratory+comparison+of+physiological+and+genetic+properties+of+four+Saccharomyces+cerevisiae+strains.">An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains.</a> Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Acids Research. 19 (20), 5791 (1991).</li><li>Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+genomic+DNA+from+yeasts+for+PCR-based+applications.">Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications.</a> Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).</li><li>Tak, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+multiplex+gene+regulation+using+CRISPR-Cpf1-based+transcription+factors.">Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors.</a> Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+editing+by+CRISPR-Cpf1+using+a+single+crRNA+array.">Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array.</a> Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).</li><li>Swiat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FnCpf1:+a+novel+and+efficient+genome+editing+tool+for+Saccharomyces+cerevisiae.">FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cpf1-Assisted+Multiplex+Genome+Editing+and+Transcriptional+Repression+in+Streptomyces.">CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces.</a> Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1.">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell Discovery. 3, 17018 (2017).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).</li><li>Perez, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GuideScan+software+for+improved+single+and+paired+CRISPR+guide+RNA+design.">GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).</li><li>Cox, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Biology+Open+Language+Visual+(SBOL+Visual)+Version+2.0.">Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0.</a> Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass es einen Interessenkonflikt gibt. Die Autoren haben IP in Bezug auf präsentierte Methoden eingereicht.

Das bereitgestellte Protokoll beschreibt die Multiplex-Genombearbeitung von S. cerevisiae mit Cas12a aus Lachnospiraceae-Bakterium ND2006 in Kombination mit einem einzigen crRNA-Array und Spender-DNA. Das Design des einzelnen crRNA-Arrays und der Spender-DNA wird ausführlich erläutert. Im Gegensatz zum bewährten CRISPR/Cas9-System verfügt das CRISPR/Cas12a über die einzigartige zusätzliche Fähigkeit, mehrere crRNAs aus einem einzigen crRNA-Array13,33zu verarbeiten. Aufgrund dieser Funktion ist die gleichzeitige Bearbeitung mehrerer Ziele einfacher einzurichten und kann in einer einzigen Transformation erreicht werden. Dieser einzelne crRNA-Array-Ansatz wurde zuvor von Zetsche etal. demonstriert. 34, die gleichzeitig bis zu vier Gene in Säugetierzellen mit AsCas12a und von Swiat et al. 35, die mit FnCas12a vier DNA-Fragmente in ein Hefegenom einführten. Unserer Kenntnis nach wurde eine höhere Anzahl simultaner genomischer Modifikationen mit einem Cas12a-System nicht gemeldet, und die maximale Zielgrenze pro einzelnem Array für Cas12a steht noch nicht fest. Weitere Forschung mit einzelnen crRNA-Arrays in Kombination mit Cas12a umfasst Multiplex-Transkriptionsregulation in einer Vielzahl von Organismen33,36,37.
Es gibt einige wichtige Schritte im vorgestellten Protokoll. Entwerfen Sie sorgfältig alle DNA-Sequenzen, die am Cas12a-Genombearbeitungsexperiment beteiligt sind, insbesondere im Falle der Einführung neuartiger DNA-Sequenzen. Bestimmen Sie die Funktionalität neuer Spacer-Sequenzen, die Teil einer crRNA sind, z. B. durch ein Singleplex-Genombearbeitungsexperiment, wie von Verwaal et albeschrieben. 19, bevor sie zu einem einzigen crRNA-Array kombiniert werden. Befolgen Sie die Empfehlungen für die Vorbereitung von Transformationspufferlösungen, die im Cas12a-Bearbeitungsexperiment verwendet werden, um eine gute Transformationseffizienz von Hefe zu erreichen.
Es gibt einige optionale Änderungen der Technik. Es wird empfohlen, bei der Transformation 1 g jeder Spender-DNA, linearisierte pRN1120 oder eine einzelne crRNA-Array-Expressionskassette zu verwenden, obwohl die Verwendung einer geringeren DNA-Menge ebenfalls zu einer zufriedenstellenden Transformationseffizienz führen dürfte. Führen Sie eine Testtransformation durch, um festzustellen, ob niedrigere DNA-Mengen verwendet werden können. Die Transformation von S. cerevisiae kann mit einer anderen Methode als der in diesem Protokoll beschriebenen durchgeführt werden, zum Beispiel das von Gietz et al. beschriebene Protokoll. 2007: 38. Das Guide-RNA-Empfänger-Plasmid pRN1120 eignet sich für die Expression eines einzelnen crRNA- und einzelnen crRNA-Arrays verschiedener Cas12a-Varianten(z.B.aus Acidaminococcus spp. BV3L6 oder Francisella novicida U112) sowie zur Expression von sgRNA in Kombination mit Cas919. Die Spender-DNA muss sich nicht auf Carotinoid-Genexpressionskassetten und flankierende Regionen beschränken, die die Spender-DNA auf die beschriebenen INT1-, INT2- und INT3-Standorte in der genomischen DNA zielen. Jede DNA von Interesse kann in Multiplex-Manier durch die in diesem Protokoll beschriebenen Designprinzipien in die genomische DNA des Wirts eingeführt werden, oder alternativ kann Spender-DNA verwendet werden, um DNA aus einem Wirtsgenom zu löschen. Der modulare Aufbau eines einzelnen crRNA-Arrays ermöglicht eine einfache Einstellung von Abstands- und direkten Wiederholungssequenzen. Die Modifikation von Abstandsreihen ermöglicht eine Änderung des vorgesehenen Integrationsortes, der durch eines der Werkzeuge zur Identifizierung einer genomischen Zielstelle entworfen werden kann, z.B. GuideScan Software 1.039. Anstatt große Flankensequenzen zu verwenden, die Konnektorensequenzen enthalten, können 50-bp des flankierenden Bereichs in die Spender-DNA-Sequenzen einbezogen werden, indem diese 50-bp-Flankenbereichssequenzen in die in der PCR verwendeten Primer integriert werden. In diesem Fall sind insgesamt nur drei statt neun Spender-DNA-Fragmente für ein erfolgreiches Multiplex-Genom-Editing-Experiment erforderlich.
Zusammenfassend bietet dieses Protokoll Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Multiplex-Genombearbeitung in S. cerevisiae mit Cas12a in Kombination mit einem einzigen crRNA-Array-Ansatz. Das Protokoll wurde durch Multiplex-Genombearbeitung mit 9 Spender-DNA-Fragmenten und einer einzigen crRNA-Array-Codierung für drei gRNAs demonstriert. Wir zeigen hohe Gesamtbearbeitungsfrequenzen zwischen 50% und 94% für die drei hier gemeldeten Dehnungsdesigns. Das einzigartige Merkmal von Cas12a ist die Fähigkeit, ein einzelnes crRNA-Array in einzelne crRNAs in einer Zelle zu verarbeiten, was Cas12a zu einem ausgezeichneten Werkzeug macht, um multiple Xx-Genombearbeitung zu ermöglichen und Transkriptions-Regulierungsmodule zu entwickeln, die auf mehrere Ausdruckskassetten in einem Rutsch. Am Ende wurden drei Stämme erhalten, die Carotinoide auf einer anderen Ebene und Farben in Schattierungen zwischen Gelb und Orange produzieren. Mit diesen Stämmen und einer wilden Sorte zeigten wir, wie ein akustischer Flüssigkeitshandler einfach eingesetzt werden kann, um Hefe-Pixel-Kunst zu machen – dies zu Ehren von Rosalind Franklin, die vor 65 Jahren durch ihr berühmtes Foto 51 23 zur Entdeckung der DNA-Struktur beitrug. /c1>.

CRISPR/Cas-Enzyme haben zweifellos die Molekularbiologie revolutioniert und wurden weithin als Werkzeuge für die Entwicklung von Genomen in einer Geschwindigkeit angenommen, die bisher nicht machbar war1. Die erste Modifikation eines Saccharomyces cerevisiae Genoms durch das CRISPR/Cas9 Genom-Editing-System wurde von DiCarlo et al. berichtet. 2, um erfolgreicheS Gen-Knock-out und Punktmutationen mit extern eingeführten Oligonukleotiden zu demonstrieren. Weitere Entwicklungen in der Hefe-CRISPR-Toolbox umfassten: Transkriptionsregulierung durch Fusion von katalytisch inaktiven toten Cas9 (dCas9) mit Transkriptionseffektordomänen, um die Aktivierung und das Silencing von Transkription3zu ermöglichen, Anwendung für beide Genom-Editing und regulatorische Funktionen für Metabolische Signalweg-Engineering durch gleichzeitige Aktivierung, Unterdrückung und Löschung4, Löschung von großen Fragmenten aus dem S. cerevisiae Genom5und Multiple-Chromosom-Fusionen6 .
CRISPR/Cas Genom-Editing-Systeme finden ihren Ursprung in adaptiven Immunsystemen von Bakterien und Archaeen und diese Systeme wurden von Molekularbiologen für die Genombearbeitung angepasst. Ihre Funktionalität basiert auf den Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) DNA-Regionen, die RNA kodieren, die für die Erkennung der fremden DNA oder RNA und der CRISPR-assoziierten Gene (Cas) verantwortlich ist, die RNA-geführte endonukleases1,7,8,9. Basierend auf der jüngsten Genomanalyse von CRISPR/Cas-Systemen wurde vorgeschlagen, die CRISPR/Cas-Systeme in zwei Klassen, fünf Typen und 16 Subtypen10zu unterteilen. Die beiden Klassen werden anhand der Organisation von Effektorkomplexen unterschieden, die an der Zielspaltung beteiligt sind. In der Regel werden CRISPR/Cas-Systeme mit einer Organisation mit mehreren Untereinheiten als Klasse 1 kategorisiert, während Effektorkomplexe mit einer Untereinheit zur Klasse 210,11gehören. In diesem Artikel untersuchen wir die Klasse 2 Typ V Cas12a, früher Cpf110,12genannt, die eine Alternative zur Klasse 2 Typ II Cas9 darstellt. Obwohl Cas9 gut charakterisiert und weit verbreitet in der Forschung verwendet wird, bietet Cas12a zusätzliche Funktionen12. Erstens bildet Cas12a einen Komplex mit CRISPR-RNA (crRNA) von 42 bis 44 Nukleotiden, ohne dass eine zusätzliche transaktivierende CRISPR-RNA (tracrRNA) erforderlich ist. Daher kann eine kürzere Führungs-RNA in der Genombearbeitung mit CRISPR/Cas12a-Systemen im Vergleich zu CRISPR/Cas9 verwendet werden. Zweitens ermöglicht die einzigartige Endonuklease- und Endoribonuklease-Aktivität von Cas12a die Reifung seiner Pre-crRNA13. Diese RNase-Aktivität ermöglicht die Codierung mehrerer crRNAs auf einem einzelnen CRISPR crRNA-Array, während Cas9 die separate Expression jeder sogenannten Single-Guide-RNA (sgRNA) oder alternativ z.B. expression einer zusätzlichen Endonuklease ( erfordert. z.B., Csy4) in Kombination mit Erkennungsmotiven für Csy4, die jede sgRNA14,15umgeben. Drittens erfordert die Cas12a-Zielstandorterkennung ein protospacer-benachbartes Motiv (PAM) am 5'-Ende des Ziels und spaltet nach der +18/+23-Position von seinem PAM, was zu einer geballten DNA mit klebrigen Enden führt, während Cas9 ein PAM benötigt, das sich am 3'-Ende Ziel und spaltet nach der -3 Position und erzeugt stumpfe Endschnitte in der DNA12. Viertens unterscheidet sich die Konsensnukleotidsequenz des PAM zwischen Cas12a ((T)TTV) und Cas9 (NGG), was Cas12a zu einem vielversprechenden Kandidaten für die Ausrichtung auf T-reiche Promoter- und Terminator-Sequenzenmacht 16. Schließlich berichtete eine aktuelle Studie über eine größere Zielspezifität für Cas12a als für die einheimische Cas917.
Wir präsentieren ein Protokoll zur Verwendung des CRISPR/Cas12a-Systems zur Genombearbeitung von S. cerevisiae mit besonderem Schwerpunkt auf der gleichzeitigen Einführung mehrerer DNA-Expressionskassetten in unabhängige genomische Loci (Multiplex-Genombearbeitung) ein einzelnes crRNA-Array. Die wichtigsten Schritte des Protokolls sind in Abbildung 1dargestellt. Als Proof of Concept wurde das CRISPR/Cas12a-System zur Einführung von drei Expressionskassetten in das Genom von S. cerevisiae eingesetzt, die die Herstellung von .-Carotin18 ermöglichen, wie schematisch in Abbildung 2dargestellt. Die Produktion von C-Carotin wirkt sich auf den Phänotyp von S. cerevisiaeaus: d.h.bei erfolgreicher Einführung aller drei heterologen Gene, die für die Carotinoide Biosynthese benötigt werden, werden die weißen S. cerevisiae Zellen gelb oder orange, abhängig von der Expressionsstärke des Promotors jedes Gens. Aufgrund der einfachen visuellen Auslesung dieses Weges wurde es eingeführt, um fortschrittliche CRISPR-basierte Systeme und Methoden für die Genombearbeitung zu entwickeln19,20. In dieser Arbeit wurden Expressionskassetten, die die Carotinoidgene crtE, crtYB und crtI kodieren, mit einem Golden Gate Kloning (GGC) Ansatz21 mit heterologen Promotoren und homologen Terminatoren konstruiert. verwendet, um die Expression der Gene zu fördern. Die Expressionskassetten sind von eindeutigen 50-Base-Paaren (bp) Sequenzen umgeben, die als Konnektoren bezeichnet werden und eine In-vivo-Montage mit Integrationsflanken-DNA-Sequenzen (flankierende Bereiche) mit den gleichen 50-bp-Sequenzen und der anschließenden Integration ermöglichen. in die genomische DNA der Hefe an der Position, die durch die flankierenden Regionen bestimmt wird. Durch die Verwendung unterschiedlicher Promotorstärken wurden Stämme mit unterschiedlichen Carotinoiden-Produktionen erhalten, was zu einer Variation der Farbe der Zellen führte. Diese Stämme - inspiriert vom "Yeast Art Project"22 - wurden in einem Spotting-Setup mit einem akustischen Flüssigkeitshandler verwendet, um ein 4-farbiges hochauflösendes "Hefefoto" von Rosalind Franklin zu erstellen. Franklin (1920-1958) war eine englische Chemikerin und Röntgenkristallographin, die für ihren Beitrag zur Entdeckung der DNA-Struktur durch Photo 5123,24,25bekannt ist.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals specific for the protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td style="width:175px;">Selection of E. coli transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">BsaI-HF (20 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R353L</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td style="width:175px;">Transfromation of 
			S. cerevisiae (carrier DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">dNTPs</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethanol absolute for analysis</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethylenediamine-tetraacetic acid</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Histodenz</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D2158&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Yeast pixel art</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100993</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nancy-520 DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>1494</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NEB10 competent E. coli cells</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>C3019H</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nourseothricin</td>
			<td style="width:144px;">Jena Bioscience</td>
			<td>AB102</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Phusion buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Polyethylene glycol 4000</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>7490</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:156px;">Purple loading dye</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td style="width:175px;">Purification of plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">RNase coctail enzyme mix</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>46300-018</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA Ligase (1 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>1705218</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit</td>
			<td style="width:144px;">Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td style="width:175px;">Purification of PCR products and linearized pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Xhol</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Zymolyase 50 mg/ml (5 units/&#181;L)</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1006</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:156px;">Zymolyase storage buffer</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1004-B</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals of general use</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">2*Peptone-Yeast extract (PY) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">2*PY medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Demineralized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">ELFO buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">MQ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Physiological salt solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">YEPD (2% glucose) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microplate 96 wells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 0.5 - 10 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 10 - 200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Pipette tips 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Shake flasks (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Sterile filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Centrifuge (Falcon tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Echo 525 acoustic liquid handler</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">NanoDrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Set for eletrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Table centrifuge (Eppendorfs tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCSN067</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101748</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pRN1120</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101750</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">S. cerevisiae strain 
			CEN.PK113-7D</td>
			<td style="width:144px;">EUROSCARF collection</td>
			<td></td>
			<td>http://www.euroscarf.de</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art

Hohe Effizienz, Benutzerfreundlichkeit und Vielseitigkeit des gruppierten, regelmäßig interspaceierten kurzen palindromischen Wiederholungs-/CRISPR-assoziierten Proteins 9 (CRISPR/Cas9) System hat eine fortgeschrittene genetische Modifikation von Saccharomyces cerevisiaeermöglicht, einem Modell Und Arbeitspferd in der industriellen Biotechnologie. CRISPR-assoziiertes Protein 12a (Cas12a), eine RNA-geführte Endonuklease mit von Cas9 unterscheidbaren Merkmalen, wird in dieser Arbeit angewendet, wodurch die molekulare Toolbox für die Genombearbeitung weiter erweitert wird. Ein Vorteil des CRISPR/Cas12a-Systems ist, dass es in der Multiplex-Genombearbeitung mit mehreren Führungs-RNAs verwendet werden kann, die aus einer einzigen Transkriptionseinheit (einzelnes CRISPR-RNA-Array (crRNA)-Array) exprimiert werden. Wir präsentieren ein Protokoll zur Multiplex-Integration mehrerer heterologer Gene in unabhängige Loci des S. cerevisiae-Genoms mit dem CRISPR/Cas12a-System mit mehreren crRNAs, die aus einem einzigen crRNA-Arraykonstrukt exprimiert werden. Die vorgeschlagene Methode nutzt die Fähigkeit von S. cerevisiae, in vivo Rekombination von DNA-Fragmenten durchzuführen, um das einzelne crRNA-Array zu einem Plasmid zusammenzubauen, das für die transformative Selektion sowie die Montage von Spender-DNA verwendet werden kann. Sequenzen, die sich an beabsichtigten Positionen in das Genom integrieren. Cas12a ist konstitutiv vorab exprimiert, was die Spaltung des S. cerevisiae Genoms an den vorgesehenen Positionen bei Expression des einzelnen crRNA-Arrays erleichtert. Das Protokoll umfasst das Design und die Konstruktion eines einzelnen crRNA-Arrays und einer Spender-DNA-Expressionskassette und nutzt einen Integrationsansatz, der einzigartige 50-bp-DNA-Konnektorensequenzen und separate Integrationsflanken-DNA-Sequenzen nutzt, was die experimentelles Design durch Standardisierung und Modularisierung und erweitert das Anwendungsspektrum. Schließlich zeigen wir eine einfache Technik zur Erstellung von Hefepixelkunst mit einem akustischen Flüssigkeitshandler mit verschiedenfarbigem Carotinoid, das Hefestämme produziert, die konstruiert wurden.

Das Protokoll zur Multiplex-Genombearbeitung mit CRISRP/Cas12a wurde durch die Konstruktion von drei Carotinoid-Produktionsstämmen von S. cerevisiae demonstriert, die die Gene crtE, crtYB und crtI mit hilfe heterologen Promotoren von hohe, mittlere und niedrige Festigkeit: Dehnung 1, 2 bzw. 3 (Zusatztabelle 3). Der Aufbau dieser Stämme erforderte die Erzeugung von drei Spender-DNA-Expressionskassetten und sechs flankierenden Regionen pro Stamm für das Targeting auf drei verschiedene Loci in der genomischen DNA (siehe Abbildung 2B). Wie hierbeschrieben, wurden Promotor, offener Leserahmen, Terminator und zwei zusammenhängende 50-bp-Steckverbindersequenzen über eine Golden Gate Cloning-Reaktion zu einer Ausdruckskassette zusammengebaut und die Baugruppe durch PCR überprüft (Abbildung 3A). Das einzelne crRNA-Array wurde als synthetisches DNA-Fragment geordnet und durch PCR verstärkt (Abbildung 3B). Das Empfängerplasmid für das einzelne crRNA-Array (Plasmid pRN1120) wurde mit EcoRI-HF und XhoI linearisiert und die Linearisierung wurde durch Elektrophorese bestätigt (Abbildung 3C). Die Design- und Nukleotidsequenzen der eingeführten Spender-DNA-Expressionskassetten und flankierenden Bereiche sind in der ergänzenden Tabelle 3 und der Ergänzenden Tabelle 4dargestellt. Die Sequenz einzelner crRNA-Arrayexpressionskassetten ist in Der Ergänzenden Tabelle 1angegeben. Die Funktionalität der im einzelnen crRNA-Array enthaltenen Abstandshalter wurde zuvor durch Singleplex-Genombearbeitung mit einzelnen crRNAs19getestet.
Die Effizienz der Genombearbeitung mit Cas12a wurde zunächst anhand der Anzahl der farbigen Kolonien bewertet, die nach der Transformation erhalten wurden (Tabelle 1, Abbildung 4). Die Bearbeitungseffizienz der drei konstruierten Stämme schwankte zwischen 50 % und 94 %. Insbesondere die Einführung von Expressionskassetten, die zur Erzeugung von Stamm 1 verwendet werden, zeigte die geringste Bearbeitungseffizienz, die möglicherweise durch die Art der Spender-DNA verursacht wurde(d. h.diese Expressionskassetten kodieren crtE, crtYB und crtI von drei hochfesten Promotoren). Zweitens wurde die korrekte Integration der drei Spender-DNA-Expressionskassetten an der vorgesehenen Loci in die genomische DNA durch PCR bestätigt (Abbildung 5). Primer wurden so konzipiert, dass PCR-Produkte erhalten wurden, wenn die korrekte Integration der Spender-DNA am vorgesehenen Ort erfolgte. Für jedes Transformationsexperiment wurden acht Kolonien aus der Transformationsplatte entnommen und getestet (beachten Sie, dass nur drei in Abbildung 5dargestellt sind). Im Allgemeinen wurde von 8 Kolonien, die pro Spender-DNA getestet wurden, die korrekte Integration der crtE-Spender-DNA am INT1-Heuschreck, crtYB am INT2-Lokus und crtI am INT3-Lokus in >90% der Transformanten bestätigt. Diese Ergebnisse zeigen das CRISPR/Cas12a-System in Kombination mit einem einzigen crRNA-Array, das eine effiziente Multiplex-Bearbeitung des S. cerevisiae Genoms an mehreren Loci gleichzeitig ermöglicht.
Darüber hinaus zeigen wir die Erstellung von "Hefe-Pixel-Kunst" mit den drei Carotinoid-produzierenden Stämmen, die zusammen mit einer nicht farbigen Wild-Typ-Sorte konstruiert wurden. Ausgehend von einem Schwarz-Weiß-Bild von Rosalind Franklin (Abbildung 6A) wurde ein 4-Farben-Bild (Abbildung 6B) und eine Spotting-Liste erstellt, die dann verwendet wurde, um die vier verschiedenen Hefestämme auf einer Agar-Mikroplatte mit einem akustischen Flüssigkeitshandler, was zu einer hochauflösenden "Hefemalerei" von Rosalind Franklin führt (Abbildung 6C,D,E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig1v5.jpg"> Abbildung 1 : Workflow des Protokolls für CRISPR/Cas12a Multiplex-Genombearbeitung in S. cerevisiae. Der Workflow enthält entscheidende Schritte der vorgestellten Methode. Weitere Informationen finden Sie im Protokoll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig2.jpg"> Abbildung 2 : Schema der CRISPR/Cas12a Multiplex-Genombearbeitung mit einem einzigen crRNA-Array. (A) Das einzelne crRNA-Array besteht aus drei crRNAs-Einheiten in ihrer ausgereiften Form, einer 20-bp-Direktwiederholung spezifisch für LbCas12a (graue Quadrate) mit einer 23-bp-Führungssequenz (farbige Diamanten). Die Expression des crRNA-Arrays wird durch den SNR52-Promotor und den SUP4-Terminator aktiviert. Die Transformation von S. cerevisiae mit einem linearisierten pRN1120 und der einzelnen crRNA-Arrayexpressionskassette, die Homologie mit pRN1120 (diagonale Streifen) enthält, ermöglicht eine In-vivo-Rekombination in ein kreisförmiges Plasmid in Zellen, das LbCas12a. Das einzelne crRNA-Array wird anschließend von Cas12a verarbeitet. (B) Cas12a ist auf die vorgesehenen genomischen Zielstellen INT1, INT2 und INT3 gerichtet und erzeugt doppelsträngige Brüche. In der Transformationsmischung wurden Spender-DNA, bestehend aus flankierenden Regionen und der Carotinoid-Genexpressionskassette, aufgenommen. Spender-DNA-Assemblys wurden auf einen DNA-Abschnitt in der genomischen DNA um die INT1 (crtE), INT2 (crtYB) und INT3 (crtI) loci durch In-vivo-Rekombination aufgrund des Vorhandenseins von 50-bp homologen Konnektorensequenzen, angegeben als 5, A, B, C, D oder E. P1-P3, verschiedene Promotoren; T1–T3, verschiedene Terminatoren. Diese Zahl wurde von Verwaal et al. 201819geändert. Genetische Konstrukte, die mit Synthetischen Biologie Open Language (SBOL) Visuelle Symbole40gezeigt werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig3.jpg"> Abbildung 3 : PCR-Überprüfung der Genom-Editing-Experimente. (A) Überprüfung der Golden Gate Cloning Reaktionen von montierten Spender-DNA-Kassetten. Die erzielten Ergebnisse sind mit den erwarteten Längen übereinstimmend. (B) PCR des einzelnen crRNA-Arrays. (C) Linearisierung des Plasmids pRN1120. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig4.jpg"> Abbildung 4 : Platten von S. cerevisiae Transformationen mit dem Multiplex-Genom-Editing-Ansatz. (A) Stamm 1, der crtE, crtYB und crtI von drei starken Promotoren (dunkelorange Kolonien) ausdrückt. (B) Stamm 2, der crtE, crtYB und crtI aus drei mittelstarken Promotoren (orange Kolonien) ausdrückt. (C) Stamm 3, der crtE, crtYB und crtI aus drei niederfesten Promotoren (gelbe Kolonien) ausdrückt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig5.jpg"> Abbildung 5 : PCR-Überprüfung der Integration der Spender-DNA-Expressionskassetten an der vorgesehenen Loci in die genomische DNA. (A) Überprüfung von drei Kolonien des Stammes 1. (B) Überprüfung von drei Kolonien des Stammes 2. (C) Überprüfung von drei Kolonien des Stammes 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig6.jpg"> Abbildung 6 : Hefe-Pixel-Kunst von Rosalind Franklin. (A) Schwarz-Weiß RGB-Foto von 220 x 280 Pixel von Rosalind Franklin, die als Vorlage verwendet wurde. (B) Computerkonvertierung des Schwarz-Weiß-Fotos von Rosalind Franklin in eine 4-Farben-Liste mit 64 x 96 Pixeln. (C) Foto von Hefe-Pixel-Kunst mit 64 x 96 Hefekolonien mit einem vergrößerten Abschnitt. (D) Foto eines akustischen Flüssigkeitshandlers mit zwei ausgewachsenen Platten. (E) Foto einer ausgewachsenen Mikroplatte mit 64 x 96 Hefekolonien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>last</td>
			<td>Dehnung 2</td>
			<td>Dehnung 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Farbige Kolonien</td>
			<td>16</td>
			<td>279</td>
			<td>220</td>
		</tr>
<tr>
<td>Weiße Kolonien</td>
			<td>16</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kolonien insgesamt</td>
			<td>32</td>
			<td>297</td>
			<td>238</td>
		</tr>
<tr>
<td>fähigkeit</td>
			<td>50%</td>
			<td>94%</td>
			<td>92%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Bearbeitungseffizienz des Multiplex-Genom-Editing-Ansatzes.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>crRNA-Arraysequenza,b,c,d,e,f</td>
		</tr>
<tr>
<td>
CATGTTTGACAGCTTATCATCGATAATCCGGAGCTAGCATGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAG TCTTTGAAAA GATAATGTATGATTATGCTTTCACTATTTATTTATTTATACAGAAACTTGATGTTTTCTTTCTATTATATACAAGG TGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCA TTTTTTCACACCCTACAATGTGTTCAAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGC ATGTTTCGGCGGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCAATTTCTACTAAGTGTAGAT CTGGTGGGAGAGAAAGCTTATGAAATTTCTACTAAGTGTAGATGTGCCGTAC GCCGGAGCCGACGGAATTTCTACTAAGTGTAGATTGCCCCTCTTATACGATTATTTT TTTTTTTTTTTTATGTCTGGGGGGCCCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGG GTTAATTCCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTCTCTGTGTG
</td>
		</tr>
<tr>
<td>a. Homologie zu pRN1120 (fett). b. SNR52-Promotor (italics). c) Genomische Zielsequenzen (unterstrichen). d. Leitlinie direkte Wiederholungen spezifisch für LbCas12a (italics, fett). e. SUP4-Terminator (italics). f. Homologie zu pRN1120 (fett).</td>
		</tr>
</tbody></table>Ergänzende Tabelle 1: Einzelnes crRNA-Array für LbCas12a mit Homologie mit Plasmid pRN1120.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>name</td>
			<td>Sequenza</td>
			<td>Beschreibungb</td>
			<td>Verwendet in Punkt</td>
		</tr><tr><td>KC-101</td>
			<td>CATGTTTGACAGCTTATCATC</td>
			<td>FW-Primer zur Verstärkung einzelner crRNA-Arrays</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-102</td>
			<td>CACACAGGAAACAGCTATGAC</td>
			<td>RV-Primer zur Verstärkung einzelner crRNA-Arrays</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-103</td>
			<td>AAGCGACTTCCAATCGCTTTGC</td>
			<td>FW-Grundierung zur Verstärkung der Spender-DNA mit Stecker 5</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-104</td>
			<td>AAAGCAAAGGAAGGAGAGAAC</td>
			<td>RV-Grundierung zur Verstärkung der Spender-DNA mit Stecker A</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-105</td>
			<td>CGGATCGATGTACACAACCG</td>
			<td>FW-Grundierung zur Verstärkung der Spender-DNA mit Stecker B</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-106</td>
			<td>CAACAGGAGGCGGATGGATATAC</td>
			<td>RV-Grundierung zur Verstärkung der Spender-DNA mit Stecker C</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-107</td>
			<td>AACGTTGTCCAGGTTTGTATCC</td>
			<td>FW-Grundierung zur Verstärkung der Spender-DNA mit Stecker D</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-108</td>
			<td>AGGTACAACAAGCACGACCG</td>
			<td>RV-Grundierung zur Verstärkung der Spender-DNA mit Stecker E</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-109</td>
			<td>CACTATAGCAATCTCTCTATATG</td>
			<td>FW-Grundierung zur Verstärkung von INT1 5' mit Stecker 5</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-110</td>
			<td>
AAACGCCTGTGGGTGGTAC TGGATATGCAAAGCGATTGGAA GTCGCTTGACTCCTCTGCCGTC ATTCC</td>
			<td>RV-Grundierung zur Verstärkung von INT1 5' mit Stecker 5</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-111</td>
			<td>
TTGCCCATCGAACGTACAAG TACTCCTCTGTTCTCTCTCTCTT TGCTTTAAGCGTTGAAGTTTCCTC TTTG</td>
			<td>FW-Grundierung zur Verstärkung von INT1 3' mit Stecker A</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-112</td>
			<td>TGTCAACTGGAGAGCTATCG</td>
			<td>RV-Grundierung zur Verstärkung von INT1 3' mit Stecker A</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-113</td>
			<td>AGAAGATTTCTCTTCAATCTC</td>
			<td>FW-Grundierung zur Verstärkung von INT2 5' mit Stecker B</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-114</td>
			<td>
TGCTAAGATTTGTGTTCGTT TGGGTGCAGGGTTGTACAT CGATCCGCCCTTATCAAGGATACC TGGTTG</td>
			<td>RV-Grundierung zur Verstärkung von INT2 5' mit Stecker B</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-115</td>
			<td>
ACGCTTTCCGGCATCTTCCA GACCACAGTATATCCATCCGCCT CCTGTTGGGCGATTACACAAGCG GTGG</td>
			<td>FW-Grundierung zur Verstärkung von INT2 3' mit Stecker C</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-116</td>
			<td>TCTCTTCTCGATGACCGGG</td>
			<td>RV-Grundierung zur Verstärkung von INT2 3' mit Stecker C</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-117</td>
			<td>GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTG</td>
			<td>FW-Grundierung zur Verstärkung von INT3 5' mit Stecker D</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-118</td>
			<td>
GCGGAATATTGGCGGAACGG ACACACGTGGATACAAACCTG GACAACGTTTTCCAAGGAGGTG AAGAACG</td>
			<td>RV-Grundierung zur Verstärkung von INT3 5' mit Stecker D</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-119</td>
			<td>
AAATAACCACAAAACATCCTT CCCATATGCTCTCTCGCGCTTGTT GTACCTGATGGGACGTCAGCACT GTAC</td>
			<td>FW-Grundierung zur Verstärkung von INT3 3' mit Stecker E</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-120</td>
			<td>GAGCTTACTCTATATATTCATTC</td>
			<td>RV-Grundierung zur Verstärkung von INT3 3' mit Stecker E</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-121</td>
			<td>GTTACTAAACTGGAACTGTCCG</td>
			<td>FW-Primer zur Überprüfung der Integration von con5-crtE-conA in INT1 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-122</td>
			<td>CACTGCTAACTACGTTTACTTC</td>
			<td>FW-Primer zur Überprüfung der Integration von con5-crtE-conA in INT1 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-123</td>
			<td>CACTGGAACTTGAGCTTGAG</td>
			<td>FW-Primer zur Überprüfung der Integration von conB-crtYB-conC in INT2 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-124</td>
			<td>GTCTCCAGCTGAATTGGTCC</td>
			<td>FW-Primer zur Überprüfung der Integration von conB-crtYB-conC in INT2 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-125</td>
			<td>CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC</td>
			<td>FW-Primer zur Überprüfung der Integration von conD-crtI-conE in INT3 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-126</td>
			<td>GATCGGTCAATTAGGTGAAG</td>
			<td>FW-Primer zur Überprüfung der Integration von conD-crtI-conE in INT3 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-127</td>
			<td>CCTTGTCCAAGTAGGTCC</td>
			<td>RV-Primer zur Überprüfung der Integration von con5-crtE-conA in INT1 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-128</td>
			<td>GCTGTCATGATCTGTGATAAC</td>
			<td>RV-Primer zur Überprüfung der Integration von con5-crtE-conA in INT1 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-129</td>
			<td>CTGGCAATGTTGACCAATTGC</td>
			<td>RV-Primer zur Überprüfung der Integration von conB-crtYB-conC in INT2 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-130</td>
			<td>CCAACGTGCCTTAAAGTCTG</td>
			<td>RV-Primer zur Überprüfung der Integration von conB-crtYB-conC in INT2 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-131</td>
			<td>CCTTACCTTCTGGAGCAGCAG</td>
			<td>RV-Grundierung zur Überprüfung der Integration von conD-crtI-conE in INT3 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-132</td>
			<td>CTGGTTACTTCCCTAAGACTG</td>
			<td>RV-Primer zur Überprüfung der Integration von conD-crtI-conE in INT3 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>a. Fette Sequenzen bezeichnen Verbindersequenzen. b. Vorwärts- und Rückwärtsprimer werden als FW bzw. RV bezeichnet.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Ergänzende Tabelle 2: Primersequenzen.
<img alt="Supplementary Table 3" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable3.jpg"> Ergänzende Tabelle 3: Konstruktion konstruierter Stämme.
<img alt="Supplementary Table 4" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable4.jpg"> Ergänzende Tabelle 4: Sequenzen von Spender-DNA-Expressionskassetten und Abplatzungsbereichen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/Suppl_Table_4.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

Das CRISPR/Cas12a-System in Kombination mit einem einzigen crRNA-Array ermöglicht eine effiziente Multiplex-Bearbeitung des S. cerevisiae Genoms an mehreren Loci gleichzeitig. Dies wird durch die Konstruktion von Carotinoid produzierenden Hefestämmen demonstriert, die anschließend zur Erzeugung von Hefepixelkunst verwendet werden.

CRISPR/Cas12a Multiplex Genom Bearbeitung von Saccharomyces cerevisiae und die Schaffung von Hefe Pixel Kunst

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Dieses Protokoll demonstriert eine neuartige Methode zur Multiplex-Genombearbeitung von Saccharomyces cerevisiae durch die Einführung mehrerer Expressionskassetten auf verschiedenen Loci in einem einzigen Transformationsschritt. Dieser Klon-Freie-Plasmid-Montageansatz zur Exdinierung eines einzelnen crRNA-Arrays führt zu einem schnellen, effizienten und flexiblen Genom-Editing-Protokoll. Wir werden wilde Hefezellen entwickeln, um Carotinoide zu produzieren, indem wir freie heterologe Gene auf freie genomische Loci einführen.Das einzelne crRNA-Array besteht aus freien individuellen crRNAs, die aus RNA-Polymerase-freiem Promotor exprimiert werden. Cas12a verarbeitet in vivo das crRNA-Array in einzelne crRNAs. Die crRNAs führen Cas12a zum Ziel-Loci auf der genomischen DNA, wo Cas12a doppelStrangbrüche einführt.DNA-Fragmente nach unten rekombinieren für die In-vivo-Rekombination und integrieren sich in die genomische DNA. Demonstriert wird das Protokoll von Klaudia Ciurkot, einer Doktorandin. Jeffery van Wijk, an Associate Scientist.Und Brenda Vonk, Senior Associate Scientist aus unserem Labor. Nachdem Sie ein einzelnes crRNA-Array für Multiplex Genome Editing-Experimente synthetischer DNA erhalten haben, bereiten Sie den PCR-Amplifikationsmix vor und laden Sie das Array zur Amplifikation in den Thermocycler. Um die PCR-Produkte durch Elektrophorese zu analysieren, führen Sie die Proben 40 Minuten lang auf einem 0,8%agarose Gel bei 5 V/cm aus.Laden Sie die DNA-Leiter mit den DNA-Fragmenten von 100 10000 Basenpaaren und reinigen Sie dann die PCR-Produkte mit einem PCR-Reinigungskit nach den Anweisungen des Herstellers. Für die Hefetransformation beginnen Sie mit der Vorkultivierung von Wildhefe in einem 100 ml Kolben, der 20 ml Hefeextrakt Pepton-Dextrose oder YEPD-Medium enthält. Für eine nächtliche Inkubation bei 30 Grad Celsius und 250 Umdrehungen pro Minute Am nächsten Morgen impfen Sie 20 ml frisches YEPD-Medium mit einem berechneten Volumen an über Nacht vorkulturbezogener Hefe.Platzieren Sie die Kultur in einem Schüttelinkubator, bis eine optische Dichte von 1,0, gemessen bei 600 Nanometern, erreicht ist. Ernten Sie die Hefezellen durch Zentrifugation. Waschen Sie das Hefezellpellet in 20 ml Raumtemperatur demineralisiertes Wasser, gefolgt von einer zusätzlichen Zentrifugation.Setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter Lithiumacetat Tris-EDTA Lösung aus und übertragen Sie die Hefe in ein Mikrozentrifugenrohr. Mischen Sie fünf Mikroliter einsträngiger Träger-DNA und ein Mikrogramm Plasmid pCSN067 mit der Hefezellsuspension. Mischen Sie dann 600 Mikroliter Polyethylenglykol LiAc-TE Lösung mit der Probe.Die Hefezellen und das Plasmid 30 Minuten bei 30 Grad Celsius und 450 Prm in einem Wärmeblock auf dem Tisch bebrüten. Am Ende der Inkubation 70 ml Dimethylsulfoxid mit der Transformationslösung mischen. Hitze schockieren die Mischung für 15 Minuten in einem 42 Grad Celsius Wasserbad.Übertragen Sie das Gemisch in ein 15 ml rundes Unterrohr. Fügen Sie 10 ml YEPD in die Röhre für eine nächtliche Inkubation bei 30 Grad Celsius und 250 U/min. Am nächsten Morgen sammeln Sie die transformierten Zellen durch Zentrifugation und aspirieren alle bis auf die letzten 200 Mikroliter des Überstandes.Setzen Sie das transformierte Hefezellpellet im verbleibenden Überstand wieder auf. Platte 150 Mikroliter des Transformationsmixes und 150 Mikroliter einer 20-fachen Verdünnung der verbleibenden 50 Mikroliter Transformationsmischung in YEPD, auf YEPD-Agarplatten, ergänzt mit 0,2 Gramm pro Liter G418. Nach 48 bis 72 Stunden bei 30 Grad Celsius, wählen Sie ein einziges Transformant für die Erneute Streaking auf einer neuen YEPD Agar Platte mit 0,2 g/L von G418 ergänzt.Für die zweite Transformation, wachsen die Kultur auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 1,0, wie gerade gezeigt. Und fügen Sie 20 Mikroliter Zellen zu einem Mikrozentrifugenrohr hinzu. Nach der Zentrifugation das Zellpellet in 100 Mikroliter LiAc-TE-Lösung wieder aufsetzen und ssDNA hinzufügen.Kombinieren Sie in einem separaten Rohr ein Mikrogramm des einzelnen crRNA-Arrays, ein Mikrogramm des linearisierten Empfängerplasmids für das crRNA-Array, ein Mikrogramm jeder Spender-DNA und ein Mikrogramm jeder flankierenden Region. Übertragen Sie dann das DNA-Gemisch in das Rohr kompetenter Hefezellen und schließen Sie die zweite Transformation ab, wie für die erste Transformation gezeigt. Am nächsten Morgen sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren sie das Pellet in einem kleinen Aliquot von Überstand.Dann Platte 150 Mikroliter der Transformationsmischung, und 150 Mikroliter einer 20-fachen Verdünnung des Transformationsmixes im YEPD-Medium auf YEPD-Agarplatten, ergänzt durch 0,2 g/L G418, und 0,2 g/L Nourseothricin Nach 48 bis 72 Stunden bei 30 Grad Celsius wählen Sie ein einfarbiges Transformant zum Nachstreichen auf einer neuen YEPD-Platte, um einfarbige Kolonien zu erhalten. Um die Effizienz der Genombearbeitung zu bestimmen, zählen Sie die Anzahl der farbigen und weißen Kolonien auf den Transformationsplatten und teilen Sie die Anzahl der farbigen Kolonien durch die Gesamtzahl der Kolonien. Um Hefe-Pixel-Kunst zu erzeugen, impfen Sie einzelne 500 ml-Shake-Kolben mit 100 ml YEPD-Medium mit drei verschiedenfarbigen Carotinoid-Produktions-S.cerevisiae-Stämmen und einem wilden Typ CEN.PK113-7D-Stamm. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 250 Rpm. Übertragen Sie 0,5 ml jeder Nachtkultur auf einzelne Röhren, die 0,5 ml steriles, nichtionisches Dichtegradientenmedium pro Rohr enthalten, und mischen Sie die Lösungen kurz durch Wirbeln.Übertragen Sie die Zellsuspensionen in einzelne, qualifizierte Reservoir 2 von 3 Brunnen. Verwenden Sie eine csv-Datei mit der Flüssigkeitskalibrierungseinstellung 6RES_AQ_GPSA2 auf einem akustischen Flüssigkeitshandler-Instrument, um 25 Nanoliter jedes S.cerevisiae-Stamms von der entsprechenden qualifizierten Reservoir-Quellplatte auf eine 6144-Well-Destination-Mikroplatte mit 50 ml YEPD-Agar zu erkennen. Wenn alle Brunnen gesichtet wurden, inkubieren Sie die Mikroplatte bei 30 Degress Celsius für 48 Stunden.Um die Farben der Stämme zu intensivieren, lagern Sie die Agarplatten bei 4 Grad Celsius für mindestens 72 Stunden. Ein Bild von Rosalind Franklin ist auf dem Teller aufgetaucht. Wie gezeigt, können Promoter, offener Leserahmen, Terminator und zwei zusammenhängende 50 bp-Steckverbindersequenzen über eine Golden Gate-Klonreaktion zu einer Ausdruckskassette zusammengebaut und von PCR überprüft werden.Nach der Verstärkung des einzelnen crRNA-Arrays durch PCR wird das Empfängerplasmid für das einzelne crRNA-Array linearisiert, wie durch Elektrophorese bestätigt. Die Effizienz der Multiplex GenomE Editing kann durch den Prozentsatz der farbigen Kolonien nach der Transformation und durch die Ergebnisse von PCR-Analysen berechnet werden, die die Integration von Spender-DNA an den beabsichtigten genomischen DNA-Standorten bestätigen. So wurde beispielsweise ausgehend von einem Schwarz-Weiß-Bild von Rosalind Franklin eine vierfarbige Bild- und Spotting-Liste erstellt, die dann verwendet wurde, um die vier verschiedenen Hefestämme auf einer Agar-Mikroplatte über einen akustischen Flüssigkeitshandler zu erkennen, wie gezeigt, was zu einer hochauflösenden Hefemalerei des Wissenschaftlers führte.Verwenden Sie für diese Transformation frisch zubereitete Lösungen und DNA-Fragmente von hoher Qualität. Diese Methode kann auch für multiplexe Einführung von definierten Deletionen und Punktmutationen in die genomische DNA angewendet werden. Darüber hinaus können CRISPR-Regulierungsexperimente durchgeführt werden.Diese Methode kann geändert werden, um mehr als freie crRNAs innerhalb eines Arrays einzuführen, um die Anzahl der gleichzeitigen Änderungen zu erhöhen, die vorgenommen werden können.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Forschung

Biotechnik

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Lensfree On-Chip-tomographischen Mikroskopie beschäftigt Multi-Angle-Beleuchtung und Super-Pixel-Auflösung

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Kontinuierliche Hochauflösende mikroskopische Beobachtung Replikative Aging in Bäckerhefe

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Techniken für die Entwicklung von robusten Pentose-gärenden Hefe für Biokonversion von Lignocellulose zu Ethanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Schaffung von Herzgewebe, die mechanische Integration von Sphäroiden mit 3D-Bioprinting ermöglicht

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Optimierung eines Multiplex-RNA-basierten Ausdruck-Assays mit Brust-Krebs-Archivmaterial

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Eine Net Schimmel basierende Methode der dreidimensionalen Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...