Name: crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

פרויקט זה קיבל מימון של אופק 2020 האיחוד האירופי תוכנית מחקר וחדשנות תחת הסכם מענק no. 686070 (DD-נטול) ו 764591 (SynCrop), ומתוך תוכנית המחקר בניית אבני החיים עם מספר הפרויקט 737.016.005 על ידי ארגון הולנד למחקר מדעי (NWO). T.E.G. היה נתמך על ידי החברה המלכותית (גרנט UF160357) ו BrisSynBio, BBSRC/EPSRC מחקר ביולוגיה סינתטי מרכז (הענק BB/L01386X/1). אנו מודים Zi Di וג ואן וייק עבור תרומתם שמרים האיתור ניסויים ליצירת אמנות פיקסל שמרים.

<ol>
	<li>Knott, G. J., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+guides+the+future+of+genetic+engineering.">CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering.</a> Science. 361 (6405), 866-869 (2018).</li><li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+metabolic+engineering+using+an+orthogonal+tri-functional+CRISPR+system.">Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system.</a> Nature Communications. 8 (1), 1688 (2017).</li><li>Li, Z. -. H., Liu, M., Lyu, X. -. M., Wang, F. -. Q., Wei, D. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+facilitated+large+fragment+deletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).</li><li>Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+facilitated+multiple-chromosome+fusion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).</li><li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Abudayyeh, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector.">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Makarova, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+evolutionary+classification+of+CRISPR-Cas+systems.">An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).</li><li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovi&#269;, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA.">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae.+using+the+CRISPR/Cas+System.">Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601 (2018).</li><li>Ferreira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+CRISPR/Cas9+genome+editing+and+gene+regulation+using+Csy4+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).</li><li>Swarts, D. C., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+versus+Cas12a/Cpf1:+Structure&#8211;function+comparisons+and+implications+for+genome+editing.">Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure&#8211;function comparisons and implications for genome editing.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481 (2018).</li><li>Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Basis+for+DNA+Target+Specificity+of+CRISPR-Cas12a.">Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a.</a> Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).</li><li>Verwaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+beta-carotene+in+Saccharomyces+cerevisiae.+by+successive+transformation+with+carotenogenic+genes+from+Xanthophyllomyces+dendrorhous.">High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).</li><li>Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+enables+fast+and+simple+genome+editing+of+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).</li><li>Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+advances+engineering+of+microbial+cell+factories.">CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories.</a> Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).</li><li>Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3 (11), 3647 (2008).</li><li>Franklin, R. E., Gosling, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+configuration+in+sodium+thymonucleate.">Molecular configuration in sodium thymonucleate.</a> Nature. 171, 740-741 (1953).</li><li>Watson, J. D., Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structure+for+deoxyribose+nucleic+acid.">A structure for deoxyribose nucleic acid.</a> Nature. 171, 737-738 (1953).</li><li>Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+deoxypentose+nucleic+acids.">Molecular structure of deoxypentose nucleic acids.</a> Nature. 171, 738-740 (1953).</li><li>Young, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+algorithm-guided+design+of+massive+strain+libraries,+applied+to+itaconic+acid+production+in+yeast.">Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast.</a> Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).</li><li>Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cloning Method. , (2013).</li><li>Mandel, M., Higa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+bacteriophage+DNA+infection.">Calcium-dependent bacteriophage DNA infection.</a> Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).</li><li>Van Dijken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interlaboratory+comparison+of+physiological+and+genetic+properties+of+four+Saccharomyces+cerevisiae+strains.">An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains.</a> Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Acids Research. 19 (20), 5791 (1991).</li><li>Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+genomic+DNA+from+yeasts+for+PCR-based+applications.">Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications.</a> Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).</li><li>Tak, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+multiplex+gene+regulation+using+CRISPR-Cpf1-based+transcription+factors.">Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors.</a> Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+editing+by+CRISPR-Cpf1+using+a+single+crRNA+array.">Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array.</a> Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).</li><li>Swiat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FnCpf1:+a+novel+and+efficient+genome+editing+tool+for+Saccharomyces+cerevisiae.">FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cpf1-Assisted+Multiplex+Genome+Editing+and+Transcriptional+Repression+in+Streptomyces.">CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces.</a> Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1.">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell Discovery. 3, 17018 (2017).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).</li><li>Perez, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GuideScan+software+for+improved+single+and+paired+CRISPR+guide+RNA+design.">GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).</li><li>Cox, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Biology+Open+Language+Visual+(SBOL+Visual)+Version+2.0.">Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0.</a> Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).</li></ol>

המחברים מצהירים שקיים ניגוד אינטרסים. המחברים הגישו IP הקשורים שיטות שהוצגו.

הפרוטוקול המסופק מתאר את עריכת הגנום מולטיפלקס של ס. cerevisiae ס באמצעות Cas12a מחיידק הND2006 בשילוב עם מערך crrna יחיד ו-DNA תורם. עיצוב של מערך crRNA יחיד ו-DNA התורם מוסבר בפרוטרוט. בניגוד היטב מערכת crispr/Cas9, crispr/Cas12a יש את היכולת הייחודית הנוספת של עיבוד crrnas מרובים ביטא מערך crrna אחד13,33. הודות לתכונה זו, ניתן לבצע עריכה בו של מספר מטרות מרובות וניתנת להשגה בטרנספורמציה אחת. זו גישה מערך crRNA יחיד הוכח בעבר על ידי זצ'ה ואח'. 34 אשר בו העריכה עד ארבעה גנים בתאי היונקים באמצעות AsCas12a, ועל ידי swiat ואח'. 35 מי הציג ארבעה שברי DNA לתוך הגנום שמרים באמצעות FnCas12a. לידיעתך, מספר גבוה יותר של שינויים גנוביים בו באמצעות מערכת Cas12a לא דווחו ואת המגבלה המקסימלית של מטרות לכל מערך בודד עבור Cas12a עדיין נקבע. מחקר נוסף ניצול מערכים crrna יחיד בשילוב עם Cas12a כולל בקרת מולטיטרסקריפט במגוון רחב של אורגניזמים33,36,37.
קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול המוצג. עיצוב בקפידה את כל רצפי ה-DNA כי הם מעורבים בניסוי Cas12a הגנום עריכת, במיוחד במקרה כאשר רצפי DNA הרומן מוצגים. לקבוע את הפונקציונליות של רצפים הרווח החדש חלק של crRNA, למשל על ידי ניסוי הגנום בלבד לערוך כמתואר על ידי Verwaal ואח'. 19 לפני שילוב אותם לתוך מערך crrna יחיד. בצע את ההמלצות להכנת פתרונות מאגר טרנספורמציה בשימוש בניסוי עריכת Cas12a כדי להשיג יעילות שינוי טוב של שמרים.
ישנם כמה שינויים אופציונליים של הטכניקה. מומלץ להשתמש 1 μg של כל ה-DNA של התורם, pRN1120 או יחיד crRNA מערך ביטוי הקלטת בטרנספורמציה, למרות השימוש בסכום ה-DNA נמוך צפוי גם לגרום ליעילות שינוי משביע רצון. בצע שינוי בדיקה כדי לקבוע אם ניתן להשתמש בכמויות DNA נמוכות. הטרנספורמציה של ה-S. cerevisiae ס עשויה להתבצע בשיטה שונה מזו המתוארת בפרוטוקול זה, למשל הפרוטוקול המתואר באמצעות gietz et al. (2007) 38. the מדריך RNA הנמען פלמיד pRN1120 מתאים לביטוי של crrna בודד ומערך crrna יחיד של משתניםCas12a שונים (למשל, מ-"מוחמץ" . BV3L6 או פרנסיז'לה novicida U112) כמו גם לביטוי של sgRNA בשילוב עם Cas919. ה-DNA התורם אינו צריך להיות מוגבל לתוך הביטוי גנים קרוטנאיד בתוך האזורים האגפים היעד ה-DNA התורם המתואר INT1, INT2 ו INT3 אתרים ב-DNA גנומית. כל ה-DNA של עניין יכול להיות הציג, באופן מדומה, ל-DNA גנומית של המארח על ידי עקרונות העיצוב המתוארים בפרוטוקול זה, או לחילופין DNA תורם יכול לשמש כדי למחוק DNA מן הגנום המארח. המבנה המודולרי של מערך crRNA יחיד מקל על התאמה קלה של מרווח ורצפים חוזרים ישירים. שינוי רצפי מרווח מאפשר שינוי של לוקוס שילוב מיועד אשר יכול להיות מעוצב על ידי אחד הכלים לזיהוי של אתר יעד גנומית, לדוגמה תוכנת הנחיה 1.039. במקום להשתמש ברצפי אגפים גדולים המכילים רצפי מחברים, 50-bp של האזור האגף ניתן לכלול ברצפי ה-DNA של התורם על ידי שילוב רצפי האזורים האלה 50 bp האגפים בצבעי היסוד בשימוש ב-PCR. במקרה זה, בסך הכל רק שלושה במקום תשעה שברי דנ א התורמים נדרשים לניסוי מוצלח של הגנום בקולנוע.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק הוראות צעד אחר צעד כדי לבצע עריכת הגנום מולטיפלקס ב- S. cerevisiae ס באמצעות Cas12a בשילוב עם גישה אחת מערך crrna. הפרוטוקול הוכח על ידי עריכת הגנום מולטיפלקס באמצעות 9 שברי ה-DNA תורם וקוד מערך crRNA יחיד עבור שלוש gRNAs. אנו מציגים תדרים גבוהים עריכה הכוללת בין 50% ו 94% עבור שלושת העיצובים הזנים שדווחו כאן. מסכם, התכונה הייחודית של Cas12a היא היכולת לעבד מערך crRNA יחיד לתוך crRNAs בודדים בתא, מה שהופך Cas12a כלי מצוין כדי לאפשר הגנום מולטיפלקס עריכת ולפתח מודולים רגולציה מיקוד מרובים קלטות ביטוי באחד הולכים. בסופו של דבר, שלושה זנים הושגו הפקת קרוטנואידים ברמה שונה וצבעים בגוונים בין צהוב וכתום. עם אלה זנים וזן פראי, הראנו כיצד מטפל נוזלי אקוסטי יכול לשמש ישר לעשות אמנות פיקסל שמרים – זה לכבוד רוזלינד פרנקלין שתרמו לגילוי של מבנה ה-DNA 65 לפני שנים על ידי צילום המפורסם שלה 5123 < /c1 >.

האנזימים crispr/Cas יש ללא ספק מהפכה בביולוגיה מולקולרית והיה אימץ באופן נרחב כלים עבור גנום הנדסה במהירות שהיתה בעבר לא ריאלי1. השינוי הראשון של מערכת הגנום הסרביסים על ידי CRISPR/Cas9 הגנום המערכת העריכה דווחה על ידי dicarlo ואח '. 2, הוכחת גן מוצלח מעלף וביצוע מוטציות הנקודות באמצעות הציג מבחוץ oligונו, מו, הזרמים. עוד שמרים ההתפתחויות בארגז הכלים של CRISPR כללו: רגולציה בתקנה על ידי היתוך של מCas9 בלתי פעיל לזרז מתים (dCas9) עם הטרנססקריפט התחומים כדי לאפשר הפעלה והשתקה של שעתוק3, בקשה עבור שניהם עריכת הגנום ופונקציות רגולציה עבור הנדסת מסלול מטבולית על ידי הפעלה בו זמנית, דיכוי ומחיקה4, מחיקה של שברי גדול מ -S. cerevisiae ס הגנום5, וכרומוזום מרובה fusions6 .
CRISPR/Cas מערכות עריכת הגנום למצוא את המקור שלהם במערכות החיסון אדפטיבית של חיידקים ומערכות אלה הותאמו על ידי ביולוגים מולקולריים לעריכת הגנום. הפונקציונליות שלהם מבוססת על באשכולות קבועים מקובצים באופן סדיר בטווח הקצר (CRISPR) אזורי DNA קידוד RNA אחראי על ההכרה של ה-DNA הזר או RNA ו CRISPR הקשורים גנים (Ca) אשר מקודד RNA-מונחה .שבעה, שמונה,9 בהתבסס על ניתוח הגנום האחרונות של מערכות CRISPR/Cas זה הוצע לחלק את מערכות CRISPR/Cas לשני מחלקות, חמישה סוגים 16 תת-סוגי10. שני הכיתות נבדלים על בסיס ארגון של מכלולי אפקטור המעורבים במחשוף מטרה. בדרך כלל, מערכות CRISPR/Cas עם ארגון רב-ממדי מסווגים כמחלקה 1, ואילו מכלולי משנה אחת של מתחמי שייכות לכיתה 210,11. במאמר זה, אנו לחקור את class 2 סוג V Cas12a, שנקרא בעבר Cpf110,12, שהיא חלופה לכיתה 2 סוג II Cas9. למרות שCas9 מאופיין היטב ונעשה בו שימוש נרחב במחקר, Cas12a מציעה תכונות נוספות12. ראשית, Cas12a צורות מורכב עם CRISPR RNA (crRNA) של 42 כדי 44 נוקלאוטידים מבלי לדרוש עוד מפעיל הפעלה-RNA CRISPR (tracrRNA). לכן, a מדריך קצר RNA יכול להיות מנוצל עריכת הגנום עם CRISPR/Cas12a מערכות לעומת CRISPR/Cas9. שנית, endonuclease ייחודי ו endoribonucחכירה הפעילות של Cas12a מאפשר התבגרות של pre-crRNA שלה13. פעילות RNase זו מאפשרת קידוד של crRNAs מרובים על מערך CRISPR יחיד, בעוד Cas9 דורש את הביטוי הנפרד של כל מה שנקרא מדריך יחיד RNA (sgRNA) או לחילופין ביטוי לדוגמה של endonuclease נוספת ( לדוגמה, Csy4) בשילוב עם מוטיבים הוקרה עבור Csy4 המקיפים כל sgrna14,15. שלישית, Cas12a היעד הכרה באתר דורש מוטיב הסמוך פרוטומי (פאם) בסוף 5 ' היעד ואת דבק לאחר + 18/+ 23 מיקום של פאם שלה וכתוצאה מכך ביקתה DNA עם קצוות דביק, בעוד Cas9 דורש פם ממוקם על 3 ' הקצה מן ה יעד ו-דבק לאחר מיקום -3 ליצור חתכים בקצה קהה ב-DNA12. רביעית, הקונצנזוס ההסכמה הרצף של פאם שונה בין Cas12a ((T) TTV) ו Cas9 (NGG), מה שהופך Cas12a מועמד מבטיח עבור התמקדות מקדם המקדם T-עשיר ושליחות קטלנית רצפים16. לבסוף, מחקר שנערך לאחרונה דיווח ספציפיות יותר היעד עבור Cas12a מאשר יליד Cas917.
אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במערכת CRISPR/Cas12a לעריכת הגנום של S. cerevisiae ס עם מיקוד מסוים על המבוא של ביטוי DNA מרובים לתוך הקורה גנומית עצמאית בו זמנית (עריכת הגנום מולטיפלקס) באמצעות מערך crRNA יחיד. השלבים המרכזיים של הפרוטוקול מתוארים באיור 1. כהוכחה למושג, מערכת CRISPR/Cas12a הוחל על הקדמה של שלוש קלטות הביטוי לתוך הגנום של S. cerevisiae ס המאפשרים ייצור של β-קרוטן18 כפי שמוצג באיור 2. ייצור של β-קרוטן משפיע על הפנוטיפ של S. cerevisiae ס: כלומר, על הקדמה מוצלחת של כל שלושת הגנים הטרוולוגיים הדרושים עבור biotenoid הביוסינתזה, התאים הלבנים של cerevisiae ס להפוך צהוב או כתום, בהתאם לחוזק הביטוי של כל אחד מהמקדם של הגן. בשל הקריאה הפשוטה ויזואלית של מסלול זה, הוא הוצג לפתח מערכות מבוססות crispr מבוסס ושיטות לעריכת הגנום19,20. בעבודה זו, קלטות ביטויים הקידוד של הגנים קרוטאיד Crte, crtyb ו crte נבנו באמצעות שיבוט שער הזהב (ggc) גישה21 עם הטרוולוגיים היזמים ומדבירי הומוולוגי משמש כדי לנהוג בביטוי של הגנים. קלטות הביטויים מוקפות ברצפים ייחודיים של 50-בסיס (bp), המכונים מחברים, המאפשרים בהרכבה vivo עם מאגף שילוב רצפי DNA (אזורים מאגפים) עם רצפים בעלי אותו 50 bp, ואינטגרציה עוקבת לתוך ה-DNA גנומית של שמרים בעמדה שנקבעת על ידי האזורים האגפים. באמצעות החוזקות המקדם שונים, זנים עם רמות שונות של ייצור קרוטנואידים הושגו וכתוצאה מכך וריאציה בצבע של התאים. אלה זנים בהשראת "פרויקט שמרים אמנות"22 -שימשו בכיוונון האיתור עם מטפל נוזלי אקוסטי כדי ליצור 4 צבעים ברזולוציה גבוהה "צילום שמרים" של רוזלינד פרנקלין. פרנקלין (1920-1958) היה כימאי אנגלי ו-X-ray קריסטלוגרף ידוע בשל תרומתו לגילוי של מבנה ה-DNA על ידי צילום 5123,24,25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals specific for the protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td style="width:175px;">Selection of E. coli transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">BsaI-HF (20 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R353L</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td style="width:175px;">Transfromation of 
			S. cerevisiae (carrier DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">dNTPs</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethanol absolute for analysis</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethylenediamine-tetraacetic acid</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Histodenz</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D2158&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Yeast pixel art</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100993</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nancy-520 DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>1494</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NEB10 competent E. coli cells</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>C3019H</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nourseothricin</td>
			<td style="width:144px;">Jena Bioscience</td>
			<td>AB102</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Phusion buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Polyethylene glycol 4000</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>7490</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:156px;">Purple loading dye</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td style="width:175px;">Purification of plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">RNase coctail enzyme mix</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>46300-018</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA Ligase (1 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>1705218</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit</td>
			<td style="width:144px;">Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td style="width:175px;">Purification of PCR products and linearized pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Xhol</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Zymolyase 50 mg/ml (5 units/&#181;L)</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1006</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:156px;">Zymolyase storage buffer</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1004-B</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals of general use</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">2*Peptone-Yeast extract (PY) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">2*PY medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Demineralized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">ELFO buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">MQ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Physiological salt solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">YEPD (2% glucose) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microplate 96 wells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 0.5 - 10 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 10 - 200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Pipette tips 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Shake flasks (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Sterile filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Centrifuge (Falcon tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Echo 525 acoustic liquid handler</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">NanoDrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Set for eletrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Table centrifuge (Eppendorfs tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCSN067</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101748</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pRN1120</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101750</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">S. cerevisiae strain 
			CEN.PK113-7D</td>
			<td style="width:144px;">EUROSCARF collection</td>
			<td></td>
			<td>http://www.euroscarf.de</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art

יעילות גבוהה, קלות השימוש צדדיות של האשכולות באופן קבוע במרווחים של התאמה מלאה של palindromic מלאה/CRISPR-חלבון משויך 9 (CRISPR/Cas9) מערכת הקלה שינוי גנטי מתקדם של סכביסיסים cerevisiae ס, מודל אורגניזם וסוס עבודה בביוטכנולוגיה תעשייתית. CRISPR הקשורים חלבון 12a (Cas12a), מונחה RNA endonuclease עם תכונות להבדיל מ Cas9 מוחל בעבודה זו, עוד הרחבת ארגז הכלים המולקולרי למטרות עריכת הגנום. יתרון של מערכת CRISPR/Cas12a היא כי ניתן להשתמש בו ב מולטיפלקס עריכת הגנום עם מדריך מרובים RNAs מבוטא יחידה transcript יחיד (מערך CRISPR בודדים (crRNA) המערך). אנו מציגים פרוטוקול לאינטגרציה של מולטיפלקס של גנים מרובים הטרוולוגי לתוך הבית העצמאי של הגנום S. cerevisiae ס באמצעות מערכת crispr/Cas12a עם מספר crRNAs מבוטא מערך crrna בודד. השיטה המוצעת מנצלת את היכולת של S. cerevisiae ס לבצע ב vivo רקומבינציה של שברי DNA כדי להרכיב את מערך crrna יחיד לתוך פלבאמצע שיכול לשמש עבור בחירת טרנספוראנט, כמו גם הרכבה של ה-DNA תורם רצפים המשולבים לתוך הגנום בעמדות מיועדות. Cas12a מתבטא מראש באופן מכוון, הקלה על המחשוף של ה-S. cerevisiae ס הגנום על העמדה המיועדת על פי ביטוי של מערך crrna יחיד. הפרוטוקול כולל את העיצוב והבנייה של מערך crRNA יחיד וביטוי DNA התורם קלטות, ומנצל גישה שילוב עושה שימוש ייחודי 50 bp רצפי מחברי DNA רצפים ושילוב נפרד האגף DNA רצפים, אשר מפשט את תכנון ניסיוני באמצעות סטנדרטיזציה ומודולליזציה ומרחיב את מגוון היישומים. לבסוף, אנו מדגימים טכניקה פשוטה ליצירת פיקסל אמנות שמרים עם מטפל נוזלי אקוסטי באמצעות שונה בצבע קרוטנאיד הפקת זנים שמרים שנבנו.

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

מערכת CRISPR/Cas12a בשילוב עם מערך crRNA יחיד מאפשר עריכה משולבת יעילה של הגנום S. cerevisiae ס בבית מרובים בו זמנית. זה הפגינו על ידי בניית קרוטנאיד הפקת זנים שמרים אשר משמשים לאחר מכן כדי ליצור פיקסל ארט שמרים.

CRISPR/Cas12a מולטיפלקס עריכת הגנום של סכביקוע cerevisiae ס ויצירת שמרים אמנות פיקסל

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

פרוטוקול זה מדגים שיטה חדשנית לעריכת גנום מולטיפלקס של Cerevisiae Saccharomyces על ידי החדרת קלטות ביטוי מרובות על loci שונים בשלב טרנספורמציה אחת. גישת הרכבה פלסמידית חופשית לשיבוט להבעת מערך crRNA יחיד, מובילה לפרוטוקול עריכת גנום מהיר, יעיל וגמיש. אנו מהנדסים תאי שמרים מסוג בר, כדי לייצר קרוטנואידים על ידי החדרת גנים הטרולוגיים בחינם על לוקוסים גנומיים בחינם.מערך crRNA יחיד מורכב crRNAs בודדים חינם לידי ביטוי מיזם RNA פולימראז חינם. Cas12a מעבד ב vivo מערך crRNA לתוך crRNAs בודדים. CRRNAs מדריך Cas12a אל לוצי היעד על ה-DNA הגנומי שבו Cas12a מציג שבירות גדיל כפול.שברי דנ"א כלפי מטה משתלבים מחדש לשילוב מחדש של vivo ומשתלבים בדנ"א גנומי. הפגנת הפרוטוקול תהיה קלאודיה Ciurkot, סטודנט לדוקטורט. ג'פרי ואן ווייק, מדען שותף.וברנדה וונק, מדענית עמיתה בכירה מהמעבדה שלנו. לאחר קבלת מערך crRNA יחיד לניסויים בעריכת גנום מולטיפלקס של דנ"א סינתטי, הכינו את תערובת ההגברה של PCR, וטען את המערך לתוך התרמוצ'ילר להגברה. כדי לנתח את מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה, הפעל את הדגימות על ג'ל 0.8% agarose ב 5 V / cm במשך 40 דקות.לטעון את סולם ה-DNA עם שברי ה-DNA החל 100 10000 זוגות בסיס ואז לטהר את מוצרי PCR באמצעות ערכת טיהור PCR על פי ההוראות של היצרן. עבור טרנספורמציה שמרים, להתחיל על ידי טרום culturing סוג בר שמרים בבקבוק 100 מ"ל המכיל 20 מ"ל של תמצית שמרים פפטון דקסטרוז או YEPD בינוני. עבור דגירה לילה, ב 30 מעלות צלזיוס, ו 250 סיבובים לדקה למחרת בבוקר, לחסן 20 מ"ל של מדיום YEPD טרי עם נפח מחושב של שמרים טרום תרבות לילה.מניחים את התרבות באינקובטור רועד עד צפיפות אופטית של 1.0, נמדד ב 600 ננומטר הוא הגיע. לקצור את תאי השמרים על ידי צנטריפוגה. לשטוף את גלולת תא שמרים ב 20 מ"ל של מים demineralized טמפרטורת החדר, ואחריו צנטריפוגה נוספת.תן את גלולה ב 100 microliters של פתרון ליתיום אצטט טריס-EDTA, ולהעביר את השמרים לצינור microcentrifuge. מערבבים חמישה מיקרוליטרים של דנ"א נושא חד-גדילי ומיקרוגרם אחד של pCSN067 פלסמיד עם ההשעיה של תאי השמרים. לאחר מכן מערבבים 600 מיקרוליטרים של פתרון פוליאתילן גליקול LiAc-TE עם הדגימה.דגירה תאי שמרים פלסמיד במשך 30 דקות ב 30 מעלות צלזיוס ו 450 prm בבלוק חום העליון שולחן. בסוף הדגירה, מערבבים 70 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד עם פתרון הטרנספורמציה. החום מזעזע את התערובת במשך 15 דקות באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס.מעבירים את התערובת לצינור תחתון עגול 15 מ"ל. הוסף 10 מ"ל של YEPD לצינור עבור דגירה לילה ב 30 מעלות צלזיוס ו 250 סל"ד. למחרת בבוקר, לאסוף את התאים שהשתנו על ידי צנטריפוגה, ושואפים את כל מלבד 200 microliters הסופי של supernatant.תן מחדש את גלולת תאי השמרים שהשתנתה בשארית העל-טבעית. צלחת 150 microliters של תערובת הטרנספורמציה, ו 150 microliters של דילול 20 פעמים של 50 microliters הנותרים של תערובת טרנספורמציה ב YEPD, על צלחות אגר YEPD, בתוספת 0.2 גרם לליטר של G418. לאחר 48 עד 72 שעות ב-30 מעלות צלזיוס, בחרו טרנספורמנט יחיד לפסים מחדש על צלחת אגר חדשה של YEPD בתוספת 0.2 גר'/ל' של G418.עבור השינוי השני, להגדיל את התרבות לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר של 1.0, כפי שהוכח רק. ולהוסיף 20 מיקרוליטרים של תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, תן שימוש חוזר לכדור התא ב- 100 מיקרוליטרים של פתרון LiAc-TE והוסף ssDNA.בצינור נפרד, שלבו מיקרוגרם אחד של מערך ה-CRRNA הבודד, מיקרוגרם אחד של פלסמיד הנמען ליניארי עבור מערך ה-CRRNA, מיקרוגרם אחד של כל דנ"א תורם, ומיקרוגרם אחד של כל אזור איגוף. לאחר מכן להעביר את תערובת ה-DNA לצינור של תאי שמרים מוסמכים ולהשלים את השינוי השני כפי שהוכח עבור השינוי הראשון. למחרת בבוקר, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולתלות מחדש את גלולה ב aliquot קטן של על טבעי.ואז צלחת 150 microliters של תערובת טרנספורמציה, ו 150 microliters של דילול 20 פעמים של תערובת הטרנספורמציה במדיום YEPD, על צלחות אגר YEPD בתוספת 0.2 g/ L G418, ו 0.2 g / L nourseothricin לאחר 48 עד 72 שעות, ב 30 מעלות צלזיוס, לבחור טרנספורמנט בצבע אחד עבור פסים מחדש על צלחת YEPD חדשה כדי להשיג מושבות צבעוניות בודדות. כדי לקבוע את יעילות עריכת הגנום, ספור את מספר המושבות הצבעוניות והלבנות על לוחות השינוי, וחלק את מספר המושבות הצבעוניות במספר המושבות הכולל. ליצירת אמנות פיקסל שמרים, יש לחסן בקבוקוני טלטול בודדים של 500 מ"ל המכילים 100 מ"ל של מדיום YEPD עם שלושה זני קרוטנואידים בצבעים שונים המייצרים זני S.cerevisiae, וסוג פראי CEN.זן PK113-7D. הדגירה את התרבויות לילה ב 30 מעלות צלזיוס עם רועד ב 250 סל"ד. העבר 0.5 מ"ל של כל תרבות לילה לצינורות בודדים המכילים 0.5 מ"ל של בינוני שיפוע סטרילי ולא יוני לכל צינור, ומערבבים בקצרה את הפתרונות על ידי מערבולת.העבר את המתלים התא בודדים, מאגר מוסמך 2 על ידי 3 בארות. השתמש בקובץ csv עם הגדרת כיול נוזלים 6RES_AQ_GPSA2 על מכשיר מטפל בנוזל אקוסטי כדי לזהות 25 ננוליטרים של כל זן S.cerevisiae מצלחת המקור המתאימה של המאגר המוסמך למיקרופלאט יעד 6144 המכיל 50 מ"ל של אגר YEPD. כאשר כל בארות כבר הבחינו, דגירה microplate ב 30 degress צלזיוס במשך 48 שעות.כדי להגביר את הצבעים של הזנים, לאחסן את צלחות אגר ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 72 שעות. תמונה של רוזלינד פרנקלין הופיעה על הצלחת. כפי שהוכח, ניתן להרכיב מקדם, מסגרת קריאה פתוחה, שליחות קטלנית ושני רצפי מחברים רציפים של 50 bp לקלטת ביטוי באמצעות תגובת שיבוט שער הזהב, ולאמת אותם על-ידי PCR.לאחר הגברה של מערך crRNA יחיד על ידי PCR, פלסמיד הנמען עבור מערך crRNA יחיד הוא ליניארי כפי שאושר על ידי אלקטרופורזה. היעילות של עריכת הגנום מולטיפלקס ניתן לחשב על ידי אחוז המושבות הצבעוניות לאחר השינוי, ועל ידי התוצאות של ניתוחי PCR המאשרים את השילוב של DNA התורם במקומות DNA גנומי המיועד. לדוגמה, החל מתמונה בשחור לבן של רוזלינד פרנקלין, נוצרה תמונה בארבעה צבעים ורשימת איתור ששימשה אז כדי לזהות את ארבעת זנים שמרים שונים על מיקרופלסטיק אגר באמצעות מטפל נוזלי אקוסטי, כפי שהוכח, וכתוצאה מכך ציור שמרים ברזולוציה גבוהה של המדען.לשינוי זה, השתמש בפתרונות טריים ובשברי דנ"א באיכות גבוהה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם עבור כניסת מולטיפלקס של מחיקות מוגדרות מוטציות הצבע לתוך DNA גנומי. בנוסף, ניתן לבצע ניסויי ויסות CRISPR.ניתן לשנות שיטה זו כדי להציג יותר crRNAs חינם בתוך מערך כדי להגדיל את מספר שינויים בו זמנית שניתן לבצע.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

תפוקה גבוהה פרופיל MicroRNA: Multiplex אופטימליים qRT-PCR בקנה מידה Nanoliter על IFCs דינמי Fluidigm ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Lensfree על שבב טומוגרפית מיקרוסקופית העסקת רב זווית תאורה פיקסל סופר רזולוציה

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

תצפית מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה מתמשכת של replicative הזדקנות בשמרי הנצה

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

טכניקות האבולוציה של שמרי פנטוז-תוסס יציבים לשם bioconversion של lignocellulose כדי אתנול

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

אופטימיזציה של וזמינותו הביטוי מבוסס-RNA מולטיפלקס באמצעות חומר ארכיוני של סרטן השד

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

שיטה המבוססת על עובש נטו הבריאה ברקמת הלב לגרדום ללא תלת מימדי

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...