Name: crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca Orizzonte 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo n. 686070 (DD-DeCaf) e 764591 (SynCrop), e dal programma di ricerca Building Blocks of Life con il numero del progetto 737.016.005 di l'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO). T.E.G. è stato sostenuto dalla Royal Society (grant UF160357) e BrisSynBio, un centro di ricerca sulla biologia sintetica BBSRC/EPSRC (grant BB/L01386X/1). Ringraziamo i due di i die e Jeffrey van Wijk per il loro contributo agli esperimenti di avvistamento del lievito per la creazione dell'arte del pixel del lievito.

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Gli autori dichiarano che c'è un conflitto di interessi. Gli autori hanno depositato IP relativi ai metodi presentati.

Il protocollo fornito descrive l'editing del genoma multiplex di S. cerevisiae utilizzando Cas12a dal batterio Lachnospiraceae ND2006 in combinazione con un singolo array di crRNA e DNA del donatore. La progettazione del singolo array di crRNA e del DNA del donatore è spiegata in dettaglio. A differenza del sistema CRISPR/Cas9 consolidato, il CRISPR/Cas12a ha l'esclusiva capacità aggiuntiva di elaborare più crRNA espressi da un singolo array di crRNA13,33. Grazie a questa funzione, la modifica simultanea di più obiettivi è più facile da configurare e può essere ottenuta in un'unica trasformazione. Questo approccio a matrice di crRNA singolo è stato dimostrato in precedenza da zetsche et al. 34 che contemporaneamente ha curato fino a quattro geni nelle cellule dei mammiferi utilizzando AsCas12a, e da Swiat et al. 35 che ha introdotto quattro frammenti di DNA in un genoma di lievito usando FnCas12a. A nostra conoscenza, un maggior numero di modifiche genomiche simultanee che utilizzano un sistema Cas12a non è stato segnalato e il limite massimo di bersagli per singolo array per Cas12a deve ancora essere determinato. Ulteriori ricerche che utilizzano singoli array di crRNA in combinazione con Cas12a includono la regolazione trascrizionale multiplex in una vasta gamma di organismi33,36,37.
Ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo presentato. Progettare con attenzione tutte le sequenze di DNA coinvolte nell'esperimento di editing del genoma di Cas12a, specialmente nel caso in cui vengano introdotte nuove sequenze di DNA. Determinare la funzionalità delle nuove sequenze distanziali parte di un crRNA, ad esempio da un esperimento di editing del genoma a singolo plesso come descritto da Verwaal et al. 19 prima di combinarli in un unico array di crRNA. Seguire le raccomandazioni per la preparazione di soluzioni di buffer di trasformazione utilizzate nell'esperimento di editing Cas12a per ottenere una buona efficienza di trasformazione del lievito.
Ci sono alcune modifiche facoltative della tecnica. Si raccomanda di utilizzare 1 g di ciascun DNA del donatore, pRN1120 linearizzato o cassetta di espressione di matrice crRNA singola nella trasformazione, anche se l'uso di una quantità di DNA inferiore dovrebbe anche provocare un'efficienza di trasformazione soddisfacente. Eseguire una trasformazione di test per determinare se è possibile utilizzare quantità di DNA inferiori. La trasformazione di S. cerevisiae potrebbe essere eseguita utilizzando un metodo diverso da quello descritto in questo protocollo, ad esempio il protocollo descritto da Gietz et al. (2007) (2007) 38. La guida del plasmid eplasmid e del veleno di RNA pRN1120 è adatta per l'espressione di una singola matrice di crRNA e di una singola matrice di crRNA di diverse varianti di Cas12a (adesempio, da Acidaminoaminoccus spp. BV3L6 o Francisella novicida U112) e per l'espressione di sgRNA in combinazione con Cas919. Il DNA del donatore non deve essere limitato alle cassette di espressione genica carotenoide e alle regioni di fianco che indirizzano il DNA dei donatori ai siti INT1, INT2 e INT3 descritti nel DNA genomico. Qualsiasi DNA di interesse può essere introdotto, in modo multiplex, nel DNA genomico dell'ospite secondo i principi di progettazione descritti in questo protocollo, o in alternativa il DNA del donatore può essere utilizzato per eliminare il DNA da un genoma ospite. La struttura modulare del singolo array di crRNA facilita la facile regolazione delle sequenze di distanziale e di ripetizione diretta. La modifica delle sequenze distanziali consente un cambiamento del locus di integrazione previsto che può essere progettato da uno degli strumenti per l'identificazione di un sito di destinazione genomica, ad esempio il software GuideScan 1.039. Invece di utilizzare grandi sequenze di fianco che contengono sequenze di connettori, 50 bp della regione di fianco possono essere inclusi nelle sequenze di DNA del donatore incorporando queste sequenze di regioni di fiancheggiamento di 50 bp nei primer utilizzati nella PCR. In questo caso, in totale sono necessari solo tre frammenti di DNA del donatore per un esperimento di editing del genoma multiplex di successo.
In sintesi, questo protocollo fornisce indicazioni dettagliate per eseguire l'editing del genoma multiplex in S. cerevisiae utilizzando Cas12a in combinazione con un singolo approccio di array crRNA. Il protocollo è stato dimostrato dall'editing del genoma multiplex utilizzando 9 frammenti di DNA del donatore e la codifica di un singolo array di crRNA per tre gRNA. Mostriamo alte frequenze complessive di editing tra il 50% e il 94% per i tre disegni di deformazione riportati qui. Concludendo, la caratteristica unica di Cas12a è la capacità di elaborare un singolo array di crRNA in singoli crRNA in una cella, il che rende Cas12a uno strumento eccellente per consentire l'editing del genoma multiplex e sviluppare moduli di regolazione trascrizionale mirati più cassette di espressione in una sola volta. Alla fine, sono stati ottenuti tre ceppi producendo carotenoidi a un livello diverso e colori nei toni tra giallo e arancione. Con questi ceppi e un ceppo di tipo selvaggio, abbiamo mostrato come un gestore di liquidi acustici possa essere utilizzato in modo semplice per realizzare l'arte dei pixel di lievito - questo in onore di Rosalind Franklin che ha contribuito alla scoperta della struttura del DNA 65 anni fa con la sua famosa foto 5123. /c1>.

Gli enzimi CRISPR/Cas hanno indubbiamente rivoluzionato la biologia molecolare e sono stati ampiamente adottati come strumenti per ingegnerizzare i genomi ad una velocità che prima era irrealizzabile1. La prima modifica di un genoma di Saccharomyces cerevisiae dal sistema di editing del genoma CRISPR/Cas9 è stata riportata da DiCarlo et al. 2, dimostrando il successo del gene knock-out e facendo mutazioni puntuali utilizzando oligonucleotidi introdotti esternamente. Ulteriori sviluppi della casella torcroma CRISPR includevano: regolazione trascrizionale mediante fusione di Cas9 (dCas9) morte catalitica con domini di effetti trascrizionali per consentire l'attivazione e il silenziamento della trascrizione3, applicazione per entrambi l'editing del genoma e le funzioni regolatorie per l'ingegneria del percorso metabolico mediante attivazione simultanea, repressione ed eliminazione4,cancellazione di grandi frammenti dal genoma del S. cerevisiae 5e fusioni multicromosomiche6 .
I sistemi di editing del genoma CRISPR/Cas trovano la loro origine nei sistemi immunitari adattivi di batteri e archei e questi sistemi sono stati adattati dai biologi molecolari per l'editing del genoma. La loro funzionalità si basa sulle regioni del DNA CRISPRmic Pofomic Repeats (CRISPR) regolarmente interspaziate del Clustered Regularly Interspaced Short Repeats (CRISPR) che codificano l'RNA responsabile del riconoscimento del DNA o dell'RNA estraneo e dei geni associati CRISPR (Cas) che codificano l'RNA guidato endonucleasi1,7,8,9. Sulla base della recente analisi genomica dei sistemi CRISPR/Cas è stato proposto di dividere i sistemi CRISPR/Cas in due classi, cinque tipi e 16 sottotipi10. Le due classi si distinguono in base all'organizzazione di complessi efentità coinvolti nella scissione di destinazione. In genere, i sistemi CRISPR/Cas con un'organizzazione di più sottounità sono classificati come classe 1, mentre i complessi degli effetti delle singole sottounità appartengono alla classe 210,11. In questo articolo viene esplorato il tipo di classe 2 V Cas12a, precedentemente denominato Cpf110,12, che è un'alternativa alla classe 2 di tipo II Cas9. Anche se Cas9 è ben caratterizzato e ampiamente utilizzato nella ricerca, Cas12a offre funzionalità aggiuntive12. In primo luogo, Cas12a forma un complesso con RNA CRISPR (crRNA) di 42-44 nucleotidi senza richiedere un RNA CRISPR (tracrRNA) ad attivare ulteriori. Pertanto, una guida più breve RNA può essere utilizzata nell'editing del genoma con sistemi CRISPR/Cas12a rispetto a CRISPR/Cas9. In secondo luogo, l'esclusiva attività endonucleanoed endoribonucleatolato di Cas12a consente la maturazione del suo pre-crRNA13. Questa attività di RNase consente la codifica di più crRNA su un singolo array di crRNA CRISPR, mentre Cas9 richiede l'espressione separata di ogni cosiddetto RNA a guida singola (sgRNA) o, in alternativa, ad esempio l'espressione di un'endonuclealeato ( ad esempio, Csy4) in combinazione con motivi di riconoscimento per Csy4 che circonda ogni sgRNA14,15. In terzo luogo, il riconoscimento del sito di destinazione Cas12a richiede un motivo adiacente a protostrari (PAM) all'estremità 5' dal bersaglio e fessure dopo la posizione di 18 /23 dollari dal PAM con conseguente DNA fessurato con estremità appiccicose, mentre Cas9 richiede un PAM situato all'estremità del 3' bersaglio e fessure dopo la posizione -3 creando tagli di estremità smussati nel DNA12. In quarto luogo, la sequenza nucleotide di consenso del PAM differisce tra Cas12a ((T)TTV) e Cas9 (NGG), il che rende Cas12a un promettente candidato per il targeting delle sequenze16. Infine, un recente studio ha riportato una maggiore specificità target per Cas12a che per il Cas917nativo.
Presentiamo un protocollo per l'utilizzo simultaneo del sistema CRISPR/Cas12a per l'editing genomico di S. cerevisiae con particolare attenzione all'introduzione di più cassette di espressione del DNA nei loci genomici indipendenti (editing del genoma multiplex) utilizzando un singolo array di crRNA. I passaggi chiave del protocollo sono illustrati nella Figura 1. Come prova di concetto, il sistema CRISPR/Cas12a è stato applicato per l'introduzione di tre cassette di espressione nel genoma di S. cerevisiae che consentono la produzione di carotene18 come schematicamente mostrato Figura 2. La produzione di carotene z colpisce il fenotipo di S. cerevisiae: cioè, dopo l'introduzione di successo di tutti e tre i geni eterologi necessari per la biosintesi carotenoidi, le cellule bianche S. cerevisiae diventano gialle o arancioni, a seconda della forza espressiva del promotore di ogni gene. Grazie alla semplice lettura visiva di questo percorso, è stato introdotto per sviluppare avanzati sistemi e metodi basati su CRISPR per l'editing del genoma19,20. In questo lavoro, le cassette di espressione che codificano i geni carotenoidi crtE, crtYB e crtI sono state costruite utilizzando un approccio 21 golden Gate cloning (GGC) con promotori eterologi e terminatori omologhi utilizzato per guidare l'espressione dei geni. Le cassette di espressione sono circondate da sequenze univoche di 50 coppie di basi (bp), chiamate connettori, che consentono l'assemblaggio in vivo con sequenze di DNA di fianco di integrazione (regioni di fianco) con le stesse sequenze di 50 bp e la successiva integrazione nel DNA genomico del lievito nella posizione determinata dalle regioni di fianco. Utilizzando diversi punti di forza del promotore, sono stati ottenuti ceppi con diversi livelli di produzione di carotenoidi, con conseguente variazione di colore delle cellule. Questi ceppi - ispirati al "Yeast Art Project"22 - sono stati utilizzati in un setup di avvistamento con un gestore liquido acustico per creare una "fotografia di lievito" ad alta risoluzione a 4 colori di Rosalind Franklin. Franklin (1920-1958) è stata una chimica e cristallografa inglese nota per il suo contributo alla scoperta della struttura del DNA da parte della Foto 5123,24,25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals specific for the protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td style="width:175px;">Selection of E. coli transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">BsaI-HF (20 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R353L</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td style="width:175px;">Transfromation of 
			S. cerevisiae (carrier DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">dNTPs</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethanol absolute for analysis</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethylenediamine-tetraacetic acid</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Histodenz</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D2158&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Yeast pixel art</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100993</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nancy-520 DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>1494</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NEB10 competent E. coli cells</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>C3019H</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nourseothricin</td>
			<td style="width:144px;">Jena Bioscience</td>
			<td>AB102</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Phusion buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Polyethylene glycol 4000</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>7490</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:156px;">Purple loading dye</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td style="width:175px;">Purification of plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">RNase coctail enzyme mix</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>46300-018</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA Ligase (1 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>1705218</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit</td>
			<td style="width:144px;">Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td style="width:175px;">Purification of PCR products and linearized pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Xhol</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Zymolyase 50 mg/ml (5 units/&#181;L)</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1006</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:156px;">Zymolyase storage buffer</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1004-B</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals of general use</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">2*Peptone-Yeast extract (PY) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">2*PY medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Demineralized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">ELFO buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">MQ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Physiological salt solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">YEPD (2% glucose) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microplate 96 wells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 0.5 - 10 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 10 - 200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Pipette tips 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Shake flasks (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Sterile filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Centrifuge (Falcon tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Echo 525 acoustic liquid handler</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">NanoDrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Set for eletrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Table centrifuge (Eppendorfs tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCSN067</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101748</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pRN1120</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101750</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">S. cerevisiae strain 
			CEN.PK113-7D</td>
			<td style="width:144px;">EUROSCARF collection</td>
			<td></td>
			<td>http://www.euroscarf.de</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art

Alta efficienza, facilità d'uso e versatilità del sistema a ggecarle breve paleindromica a grappolo regolarmente interspaziato/proteina associata a CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) ha facilitato la modificazione genetica avanzata di Saccharomyces cerevisiae,un modello nell'organismo e cavallo di battaglia nella biotecnologia industriale. In questo lavoro viene applicata una endonuclea (Cas12a), una endonucleano guidata dall'RNA con caratteristiche distinguibili da Cas9, che estende ulteriormente la cassetta degli attrezzi molecolare per scopi di modifica del genoma. Un vantaggio del sistema CRISPR/Cas12a è che può essere utilizzato nell'editing del genoma multiplex con RNA a guida multipla espressi da una singola unità trascrizionale (singola unità di RNA CRISPR (crRNA). Presentiamo un protocollo per l'integrazione multiplex di più geni eterologhi in loci indipendenti del genoma di S. cerevisiae utilizzando il sistema CRISPR/Cas12a con più crRNA espressi da un singolo costrutto di array crRNA. Il metodo proposto sfrutta la capacità di S. cerevisiae di eseguire la ricombinazione in vivo di frammenti di DNA per assemblare il singolo array di crRNA in un plasmide che può essere utilizzato per la selezione trasformativa, così come l'assemblaggio del DNA del donatore sequenze che si integrano nel genoma nelle posizioni previste. Cas12a è pre-espresso in modo stitutivo, facilitando la scissione del genoma di S. cerevisiae nelle posizioni previste dopo l'espressione del singolo array di crRNA. Il protocollo prevede la progettazione e la costruzione di un singolo array di crRNA e di cassette di espressione del DNA del donatore, e sfrutta un approccio di integrazione che utilizza sequenze uniche di connettori DNA di 50 bp e sequenze di DNA di fianco separate di integrazione, che semplificano progettazione sperimentale attraverso la standardizzazione e la modularizzazione ed estende la gamma di applicazioni. Infine, dimostriamo una tecnica semplice per la creazione di arte pixel lievito con un gestore di liquidi acustici utilizzando carotenoidi di colore diverso che producono ceppi di lievito che sono stati costruiti.

Il protocollo per l'editing del genoma multiplex utilizzando CRISRP/Cas12a è stato dimostrato costruendo tre carotenoidi che producono ceppi S. cerevisiae che esprimono i geni crtE, crtYB e crtI utilizzando promotori eterologi di resistenza alta, media e bassa: ceppo 1, 2 e 3 rispettivamente (Tabella supplementare 3). La costruzione di questi ceppi ha richiesto la generazione di tre cassette di espressione del DNA del donatore e di sei regioni di accompagnamento per ogni ceppo per indirizzarsi a tre loci diversi nel DNA genomico (mostrato figura 2B). Come descritto nel presente indoccazione, promotore, frame di lettura aperto, terminatore e due sequenze di connettori contigue da 50 bp sono state assemblate in una cassetta di espressioni tramite una reazione di clonazione Golden Gate e l'assieme è stato verificato da PCR (Figura 3A). Il singolo array di crRNA è stato ordinato come un frammento di DNA sintetico ed è stato amplificato dalla PCR (Figura3B). Il plasmide del destinatario per il singolo crRNA array (plasmid pRN1120) è stato linearizzato con EcoRI-HF e XhoI e la linearizzazione è stata confermata dall'elettroforesi (Figura 3C). Le sequenze di progettazione e nucleotide delle cassette di espressione del DNA donatore introdotte e delle regioni di accompagnamento sono riportate nella tabella supplementare 3 enella tabella supplementare 4. La sequenza delle singole cassette di espressione della matrice crRNA è riportata nella Tabella supplementare 1. La funzionalità dei distanziali inclusi nel singolo array di crRNA è stata testata in anticipo dall'editing del genoma a singolo pezzetti con singoli crRNA19.
L'efficienza dell'editing del genoma mediante Cas12a è stata valutata in primo luogo in base al numero di colonie colorate ottenute dopo la trasformazione (Tabella 1, Figura 4). L'efficienza di editing delle tre varietà costruite variava dal 50% al 94%. In particolare, l'introduzione di cassette di espressione utilizzate per generare la deformazione 1ha mostrato la più bassa efficienza di editing, probabilmente causata dalla natura del DNA del donatore (cioè, queste cassette di espressione codificano crtE, crtYB e crtI da tre promotori ad alta resistenza). In secondo luogo, la PCR ha confermato la corretta integrazione delle tre cassette di espressione del DNA del donatore presso i loci previsti sul DNA genomico (Figura 5). I Primer sono stati progettati in modo tale che i prodotti PCR siano stati ottenuti quando si è verificata una corretta integrazione del DNA del donatore nel locus previsto. Per ogni esperimento di trasformazione, otto colonie sono state prelevate dalla piastra di trasformazione e testate (si noti che solo tre sono presentate nella Figura 5). In generale, su 8 colonie testate per DNA del donatore, è stata confermata la corretta integrazione del DNA del donatore crtE presso il locus INT1, dell'asilo crtYB presso il locus INT2 e della crtI presso il locus INT3. Questi risultati dimostrano il sistema CRISPR/Cas12a in combinazione con un singolo array di crRNA consente un efficiente editing multiplex del genoma di S. cerevisiae a più loci contemporaneamente.
Inoltre, dimostriamo la creazione di "yeast pixel art" utilizzando i tre ceppi che producono carotenoidi che sono stati costruiti insieme a un ceppo di tipo selvatico non colorato. Partendo da un'immagine in bianco e nero di Rosalind Franklin (Figura6A), è stata creata un'immagine a 4 colori (Figura 6B) ed è stata creata una lista di avvistamento che è stata poi utilizzata per individuare i quattro diversi ceppi di lievito su una micropiastra di agar gestore liquido acustico, con conseguente un "pittura di lievito" ad alta risoluzione di Rosalind Franklin (Figura6C,D,E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig1v5.jpg"> Figura 1 : Flusso di lavoro del protocollo per l'editing del genoma multiplex CRISPR/Cas12a in S. cerevisiae . Il flusso di lavoro include passaggi cruciali del metodo presentato. Per informazioni dettagliate, vedere il protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig2.jpg"> Figura 2 : Schema dell'editing del genoma multiplex CRISPR/Cas12a utilizzando un singolo array di crRNA. (A) Il singolo array crRNA è composto da tre unità crRNA nella loro forma matura, una ripetizione diretta di 20 bp specifica per LbCas12a (quadrati grigi) con una sequenza di guida di 23 bp (diamanti colorati). L'espressione dell'array crRNA è abilitata dal promotore SNR52 e dal terminatore SUP4. La trasformazione di S. cerevisiae con un pRN1120 linearizzato e la cassetta dell'espressione a matrice crRNA singola contenente omologia con pRN1120 (strisce diagonali) consente la ricombinazione in vivo in un plasmide circolare nelle cellule pre-esprimi LbCas12a. Il singolo array di crRNA viene successivamente elaborato da Cas12a. (B) Cas12a è diretto ai siti target genomici INT1, INT2 e INT3 previsti e crea doppie rotture bloccate. Nella miscela di trasformazione, è stato incluso il DNA del donatore costituito da regioni di fianco e la cassetta di espressione genica carotenoide. Gli assiemi di DNA del donatore sono stati indirizzati a un tratto di DNA nel DNA genomico intorno all'INT1 (crtE), INT2 (crtYB) e INT3 (crtI) da ricombinatione in vivo a causa della presenza di sequenze di connettori omologhi da 50 bp, indicato come 5, A, B, C, D o E. P1–P3, diversi promotori; T1-T3, terminatori diversi. Questa cifra è stata modificata da Verwaal et al. 201819. Costrutti genetici mostrati utilizzando Synthetic Biology Open Language (SBOL) Simboli visivi40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig3.jpg"> Figura 3 : PCR verifica gli esperimenti di editing del genoma. (A) Verifica delle reazioni di Golden Gate Cloning delle cassette del DNA dei donatori assemblati. I risultati ottenuti sono in accordo con le lunghezze previste. (B) PCR del singolo array crRNA. (C) Linearizzazione del pRN1120 plasmide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig4.jpg"> Figura 4 : Piastre di S. cerevisiae trasformazioni utilizzando l'approccio di editing del genoma multiplex. (A) Strain 1 esprime crtE, crtYB e crtI da tre forti promotori (colonie di arancione scuro). (B) Strain 2 esprime crtE, crtYB e crtI da tre promotori di media forza (colonie arancioni). (C) Ceppo 3 che esprime crtE, crtYB e crtI da tre promotori a bassa resistenza (colonie gialle). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig5.jpg"> Figura 5 : PCR verifica l'integrazione delle cassette di espressione del DNA del donatore nei loci previsti all'interno del DNA genomico. (A) Verifica di tre colonie del ceppo 1. (B) Verifica di tre colonie del ceppo 2. (C) Verifica di tre colonie del ceppo 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig6.jpg"> Figura 6 : Arte pixel yeast di Rosalind Franklin. (A) Foto RGB in bianco e nero di 220 x 280 pixel di Rosalind Franklin che è stata utilizzata come modello. (B) Conversione al computer della foto in bianco e nero di Rosalind Franklin in una lista a 4 colori di 64 x 96 pixel. (C) Foto di arte pixel lievito con 64 x 96 colonie di lievito con una sezione ingrandita. (D) Foto di un gestore di liquidi acustici con due piastre coltivate complete. (E) Foto di una micropiastra coltivata a pieno con colonie di lievito 64 x 96. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig6large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>strappo</td>
			<td>Ceppo 2</td>
			<td>Ceppo 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colonie colorate</td>
			<td>16</td>
			<td>279 del sistema di</td>
			<td>220 (in questo da fwlinkin base)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colonie bianche</td>
			<td>16</td>
			<td>18 mi lato</td>
			<td>18 mi lato</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colonie totali</td>
			<td>32 Milia risse</td>
			<td>297 del sistema di</td>
			<td>238 (di sistema)</td>
		</tr>
<tr>
<td>efficienza</td>
			<td>50%</td>
			<td>94%</td>
			<td>92%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Modifica dell'efficienza dell'approccio di editing del genoma multiplex.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>sequenza di matrice crRNAa,b,c,d,e,f</td>
		</tr>
<tr>
<td>
CATGTTTGAGCTTATCATAATCCGGAGCTAGGCGGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCGGGCTGCGCAG TCTTTGAAAA GATAATGTATGATATTATGCTTTCTCTCATCATCATATTTATACAGAAACTTGATGTGTTTTCTTTTMASCHERATATATACAAGG TGATTACATGTGTAGTTTGAAGTACACAACTCTAGATTTGTAGTGCGCCCTAGGTAGGGTAAAGGCGCGCGCA TTTTTCACACCCTACAATGTTCTTGTTCAAAAGATTTGCAAACGCGTAGGaAGTGAAGTGCGC ATGTTTCGGTCGAGAACTTCTCCGCAGTGAAGATAGATAGATCAATTTCTCTAAGTGTAGAT CTGGTGANGAGAGaAGCTGAAATTTCTACTAGTAGTAGATGTGCCGTAC GCCGGAGCCGACGGAATTTCTACTAAGTAGATTGCCTCTCTTATACGATTATATTTTTT TTTTTGTTTTTTGTGTCTGGGGGGCCCGGTACCTTTTGTTCTCTGAGTGAGG GTTAATTCCGAGGTGGCGTAATCATGGTCATAGCTTTCCTGTGTGG
</td>
		</tr>
<tr>
<td>a. Homologia a pRN1120 (grassetto). b. Promotore SNR52 (corsivo). c. Sequenze di destinazione genomica (sottolineate). d. Guida ripetizioni dirette specifiche per LbCas12a (corsivo, grassetto). e. terminatore SUP4 (corsivo). f. Homologia a pRN1120 (grassetto).</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella supplementare 1: Matrice di crRNA singola per LbCas12a contenente omologia con plasmide pRN1120.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>nome</td>
			<td>Sequenzaa</td>
			<td>Descrizioneb</td>
			<td>Utilizzato in punto</td>
		</tr><tr><td>KC-101</td>
			<td>CATGTTTGACAGCTCATCCATC</td>
			<td>Primer FW per amplificazione di un singolo array di crRNA</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-102</td>
			<td>CACACACAGGAAACAGCTATGAC</td>
			<td>RV primer per amplificazione di un singolo array di crRNA</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-103</td>
			<td>AAGCGACTTCCAATCGCTTGC</td>
			<td>FW primer per amplificazione del DNA del donatore con connettore 5</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-104</td>
			<td>AAAGCAAAGGAGGABAAAC</td>
			<td>Numero di motociclista per amplificazione del DNA del donatore con connettore A</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-105</td>
			<td>CGGATCGATGTACAACCG</td>
			<td>Primer FW per amplificazione del DNA del donatore con connettore B</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-106</td>
			<td>CAACAGGAGGGGATGGATATAC</td>
			<td>RV primer per amplificazione del DNA del donatore con connettore C</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-107 (in questo stato del sistema)</td>
			<td>AACGTTGTCCAGGTTTGTATCC</td>
			<td>Primer FW per amplificazione del DNA del donatore con connettore D</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-108</td>
			<td>AGGTACACaCAAGCACGG</td>
			<td>RV primer per amplificazione del DNA del donatore con connettore E</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-109</td>
			<td>CACTATAGCAATCTGGATGH</td>
			<td>FW primer per amplificazione di INT1 5' con connettore 5</td>
			<td>4.4 (in questo stato del documento)</td>
		</tr><tr><td>KC-110</td>
			<td>
AAACGCCTGGGGGGGGGGTAC TGGATATGCAAGCGATTGGAA GTCGCTTGACTCCTCTGCCGTC ATTCC</td>
			<td>Numero di ingrandimento RV per amplificazione di INT1 5' con connettore 5</td>
			<td>4.4 (in questo stato del documento)</td>
		</tr><tr><td>KC-111</td>
			<td>
TTGCCCATCGAACGTACAAG TACTCCTCTCTCTCTCTCTTCCTCTT TGCTTTAAGCGTTGAAGTTTCCTC TTTG</td>
			<td>FW primer per amplificazione di INT1 3' con connettore A</td>
			<td>4.4 (in questo stato del documento)</td>
		</tr><tr><td>KC-112</td>
			<td>TGTCAACTGGAGAGCTCG</td>
			<td>Numero di primer RV per amplificazione di INT1 3' con connettore A</td>
			<td>4.4 (in questo stato del documento)</td>
		</tr><tr><td>KC-113</td>
			<td>AGAAGATTCTCTCTCTCTCTC</td>
			<td>Introduzione FW per amplificazione di INT2 5' con connettore B</td>
			<td>4.4 (in questo stato del documento)</td>
		</tr><tr><td>KC-114</td>
			<td>
TGCTAAGATGGtTGTTCGTT TGGGTGCAGTCGGTTGTGtACAT CGATCCGCCCTATCAAGGATACC TGGTTG</td>
			<td>Numero di primer RV per amplificazione di INT2 5' con connettore B</td>
			<td>4.4 (in questo stato del documento)</td>
		</tr><tr><td>KC-115</td>
			<td>
ACGCTTTTCCGGCTCTCCA GACCACAGTATCCATCCCTCCCTCT CCTGTTGGGCGATTACACAGCGG GTGG (in QUESTO Modo)</td>
			<td>FW primer per amplificazione di INT2 3' con connettore C</td>
			<td>4.4 (in questo stato del documento)</td>
		</tr><tr><td>KC-116</td>
			<td>TCTCTCTCTCTCGATGACCGGG</td>
			<td>RV primer per amplificazione di INT2 3' con connettore C</td>
			<td>4.4 (in questo stato del documento)</td>
		</tr><tr><td>KC-117</td>
			<td>GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTG</td>
			<td>FW primer per amplificazione di INT3 5' con connettore D</td>
			<td>4.4 (in questo stato del documento)</td>
		</tr><tr><td>KC-118</td>
			<td>
GCGGAATATTGGCGGAACGG ACACACGTGGATACAACCTG GACAACGTTTTCCAAGGAGG AAGAACG</td>
			<td>Numero di ingrandimento RV per amplificazione di INT3 5' con connettore D</td>
			<td>4.4 (in questo stato del documento)</td>
		</tr><tr><td>KC-119</td>
			<td>
AAATAACCACAAACATCT CCCATATGCTCGGTCGTGCTTGTT GTACCTGATGGGACGTCAGCACT GTAC (Informazioni in base al</td>
			<td>FW primer per amplificazione di INT3 3' con connettore E</td>
			<td>4.4 (in questo stato del documento)</td>
		</tr><tr><td>KC-120</td>
			<td>GAGCTTACTCTATATATCCATTC</td>
			<td>RV primer per amplificazione di INT3 3' con connettore E</td>
			<td>4.4 (in questo stato del documento)</td>
		</tr><tr><td>KC-121</td>
			<td>GTTACTAAACTGGAACTCCG</td>
			<td>Primer FW per la verifica dell'integrazione di con5-crtE-conA a INT1 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-122</td>
			<td>CACTGCTAACTACGTCTCTCTCTC</td>
			<td>Primer FW per la verifica dell'integrazione di con5-crtE-conA a INT1 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-123</td>
			<td>CACTGGAACTTGAGCTTMA</td>
			<td>Primer FW per la verifica dell'integrazione di conB-crtYB-conC a INT2 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-124</td>
			<td>GTCTCCAGCTGAATTGTCC</td>
			<td>Primer FW per la verifica dell'integrazione di conB-crtYB-conC a INT2 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-125</td>
			<td>CTCTCATGAAGCAGTCAGTC</td>
			<td>Primer FW per la verifica dell'integrazione di conD-crtI-conE a INT3 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-126</td>
			<td>GATCGGTCAATTAGGTGAAG</td>
			<td>Primer FW per la verifica dell'integrazione di conD-crtI-conE a INT3 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-127</td>
			<td>CCTTGTCCAAGTAGGTGTCC</td>
			<td>RV primer per la verifica dell'integrazione di con5-crtE-conA a INT1 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-128</td>
			<td>GCTGTCATGATGatGATGATAAC</td>
			<td>RV primer per la verifica dell'integrazione di con5-crtE-conA a INT1 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-129</td>
			<td>CTGGCAATGTTACCAATTGC</td>
			<td>Primer RV per la verifica dell'integrazione di conB-crtYB-conC a INT2 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-130</td>
			<td>CCAACGTGCCTTAAAGTCTG</td>
			<td>Primer RV per la verifica dell'integrazione di conB-crtYB-conC a INT2 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-131</td>
			<td>CCTTACCTTTGGGGAGCAGCAG</td>
			<td>Primer RV per la verifica dell'integrazione di conD-crtI-conE a INT3 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-132</td>
			<td>CTGGTTACTTCCCTAAGACTG</td>
			<td>Primer RV per la verifica dell'integrazione di conD-crtI-conE a INT3 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>a. Le sequenze in grassetto indicano le sequenze di connettore. b. I primer avanti e indietro sono designati rispettivamente come FW e RV.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabella supplementare 2: Sequenze di primer.
<img alt="Supplementary Table 3" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable3.jpg"> Tabella supplementare 3: Progettazione di ceppi costruiti.
<img alt="Supplementary Table 4" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable4.jpg"> Tabella supplementare 4: Sequenze di cassette di espressione del DNA del donatore e regioni di sfaldamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/Suppl_Table_4.docx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

Il sistema CRISPR/Cas12a in combinazione con un singolo array di crRNA consente un efficiente editing multiplex del genoma di S. cerevisiae a più loci contemporaneamente. Ciò è dimostrato dalla costruzione di ceppi di carotenoidi che producono ceppi di lievito che vengono successivamente utilizzati per creare arte pixel lievito.

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing di Saccharomyces cerevisiae e la creazione di Yeast Pixel Art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Questo protocollo dimostra un nuovo metodo per l'editing del genoma multiplex di Saccharomyces cerevisiae introducendo più cassette di espressione su loci diversi in un unico passaggio di trasformazione. Questo approccio di assemblaggio plasmide libero dalla clonazione per esprimere un singolo array di crRNA, porta a un protocollo di editing del genoma rapido, efficiente e flessibile. Ingegnericheremo cellule di lievito di tipo selvatico, per produrre carotenoidi introducendo geni eterologi liberi su loci genomici liberi.Il singolo array crRNA è composto da crRNA individuali liberi espressi dal promotore libero dell'RNA polimerasi. Cas12a elabora in vivo l'array crRNA in singoli crRNA. I crRNA guidano Cas12a verso il loci bersaglio sul DNA genomico dove Cas12a introduce rotture a doppio filamento.Frammenti di DNA verso il basso si ricombinano per la ricombinazione in vivo e si integrano nel DNA genomico. A dimostrare il protocollo sarà Klaudia Ciurkot, dottoranda. Jeffery van Wijk, scienziato associato.E Brenda Vonk, una scienziata associata senior del nostro laboratorio. Dopo aver ottenuto un singolo array di crRNA per esperimenti multiplex genome editing di DNA sintetico, preparare il mix di amplificazione PCR e caricare l'array nel termociclo per l'amplificazione. Per analizzare i prodotti PCR per elettroforesi, eseguire i campioni su un gel di agarosio dello 0,8% a 5 V/cm per 40 minuti.Caricare la scala del DNA con i frammenti di DNA che vanno da 100 10000 coppie di basi Quindi purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Per la trasformazione del lievito, iniziare pre-coltivando lievito di tipo selvatico in un pallone da 100 ml contenente 20 ml di estratto di lievito peptone destrosio o mezzo YEPD. Per un'incubazione notturna, a 30 gradi Celsius e 250 rotazioni al minuto La mattina successiva, inoculare 20 mL di mezzo YEPD fresco con un volume calcolato di lievito pre-coltura notturno.Posizionare la coltura in un incubatore di scuotimento fino a raggiungere una densità ottica di 1,0, misurata a 600 nanometri. Raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione. Lavare il pellet di cellule di lievito in 20 mL di acqua demineralizzata a temperatura ambiente, seguita da un'ulteriore centrifugazione.Rimescolare il pellet in 100 microlitri di soluzione tris-EDTA di acetato di litio e trasferire il lievito in un tubo di microcentrifugo. Mescolare cinque microlitri di DNA portante a singolo filamento e un microgrammo di pCSN067 plasmide con la sospensione cellulare del lievito. Quindi mescolare 600 microlitri di soluzione di polietilene glicole LiAc-TE con il campione.Incubare le cellule di lievito e il plasmide per 30 minuti a 30 gradi Celsius e 450 prm in un blocco di calore superiore del tavolo. Al termine dell'incubazione, mescolare 70 mL di solfossido di dimetile con la soluzione di trasformazione. Scaldare la miscela per 15 minuti in un bagno d'acqua di 42 gradi Celsius.Trasferire la miscela su un tubo inferiore rotondo da 15 ml. Aggiungere 10 ml di YEPD al tubo per un'incubazione notturna a 30 gradi Celsius e 250 giri/min. La mattina seguente, raccogli le cellule trasformate per centrifugazione e aspira tutti tranne gli ultimi 200 microlitri del supernatante.Rimescolare il pellet cellulare di lievito trasformato nel supernatante rimanente. Piastra 150 microlitri del mix di trasformazione e 150 microlitri di una diluizione 20 volte superiore dei restanti 50 microlitri di mix di trasformazione in YEPD, su piastre di agar YEPD, integrati con 0,2 grammi per litro di G418. Dopo 48-72 ore a 30 gradi Celsius, scegli un singolo trasformatore per ristriature su una nuova piastra di agar YEPD integrata con 0,2 g / L di G418.Per la seconda trasformazione, far crescere la cultura a una densità ottica a 600 nanometri di 1,0, come appena dimostrato. E aggiungere 20 microlitri di cellule a un tubo di microcentrifugo. Dopo la centrifugazione, rimescolare il pellet cellulare in 100 microlitri di soluzione LiAc-TE e aggiungere ssDNA.In un tubo separato, combinare un microgrammo del singolo array di crRNA, un microgrammo del plasmide ricevente linearizzato per l'array di crRNA, un microgrammo di ogni DNA donatore e un microgrammo di ogni regione di fianco. Quindi trasferire la miscela di DNA nel tubo di cellule di lievito competenti e completare la seconda trasformazione come dimostrato per la prima trasformazione. La mattina seguente, raccogliere le cellule per centrifugazione e rimescolare il pellet in una piccola aliquota di supernatante.Quindi placcare 150 microlitri del mix di trasformazione, e 150 microlitri di una diluizione 20 volte superiore del mix di trasformazione in mezzo YEPD, su piastre di agar YEPD integrate con 0,2 g/L G418 e 0,2 g/L nourseothricin Dopo 48-72 ore, a 30 gradi Celsius, scelgono un singolo trasformatore colorato per ristriature su una nuova piastra YEPD per ottenere singole colonie colorate. Per determinare l'efficienza di modifica del genoma, contare il numero di colonie colorate e bianche sulle placche di trasformazione e dividere il numero di colonie colorate per il numero totale di colonie. Per creare pixel art di lievito, inoculare singoli flaconi di frullato da 500 mL contenenti 100 mL di mezzo YEPD con tre carotenoidi di colore diverso che producono ceppi di S.cerevisiae e un CEN di tipo selvaggio.Ceppo PK113-7D. Incubare le colture durante la notte a 30 gradi Celsius con tremori a 250 giri/min. Trasferire 0,5 mL di ogni coltura notturna su singoli tubi contenenti 0,5 ml di mezzo di gradiente di densità sterile non ionico per tubo e mescolare brevemente le soluzioni mediante vortice.Trasferire le sospensioni cellulari in singoli serbatoi qualificati 2 per 3 pozzi. Utilizzare un file CSV con l'impostazione di calibrazione del fluido 6RES_AQ_GPSA2 su uno strumento di gestione del liquido acustico per individuare 25 nanolitri di ogni ceppo S.cerevisiae dalla piastra di sorgente del serbatoio qualificata appropriata su una micropiastra di destinazione del pozzo 6144 contenente 50 mL di agar YEPD. Quando tutti i pozzi sono stati avvistati, incubare la micropiatta a 30 gradi Celsius per 48 ore.Per intensificare i colori dei ceppi, conservare le piastre di agar a 4 gradi Celsius per almeno 72 ore. Una foto di Rosalind Franklin è apparsa sul piatto. Come dimostrato, promotore, frame di lettura aperto, terminatore e due sequenze contigue di connettori da 50 bp possono essere assemblate in una cassetta di espressione tramite una reazione di clonazione golden gate e verificate da PCR.Dopo l'amplificazione del singolo array di crRNA da parte della PCR, il plasmide ricevente per il singolo array di crRNA viene linearizzato come confermato dall'elettroforesi. L'efficienza del Multiplex Genome Editing può essere calcolata dalla percentuale di colonie colorate dopo la trasformazione e dai risultati delle analisi PCR che confermano l'integrazione del DNA del donatore nelle posizioni del DNA genomico previsto. Ad esempio, partendo da un'immagine in bianco e nero di Rosalind Franklin, è stata creata un'immagine a quattro colori e una lista di avvistamenti che è stata poi utilizzata per individuare i quattro diversi ceppi di lievito su una micropiatta di agar tramite un gestore liquido acustico, come dimostrato, con conseguente pittura di lievito ad alta risoluzione dello scienziato.Per questa trasformazione, utilizzare soluzioni preparate al momento e frammenti di DNA di alta qualità. Questo metodo può anche essere applicato per l'introduzione multiplex di deduzioni definite e mutazioni puntili nel DNA genomico. Inoltre, è possibile eseguire esperimenti di regolazione CRISPR.Questo metodo può essere modificato per introdurre più di crRNA liberi all'interno di una matrice per aumentare il numero di modifiche simultanee che possono essere apportate.

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Tecniche per l&#39;evoluzione della robusta lievito Pentoso-fermentazione per bioconversione della lignocellulosa a etanolo

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Creazione di tessuto cardiaco che mostra l&#39;integrazione meccanica degli spheroidi usando la biopittura 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Ottimizzazione di un'analisi di espressione di RNA-ha basato multisala usando materiale archivistico di cancro al seno

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microiniezione di Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embrioni per la trasformazione di Germline o CRISPR/Cas9 Editing genomico

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Un metodo basato su stampo netto della creazione senza impalcatura tridimensionale del tessuto cardiaco

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...