Name: crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

Dette prosjektet fikk støtte fra EUs Horizon 2020 forsknings-og innovasjonsprogram i henhold til avtale nr. 686070 (DD-koffeinfri) og 764591 (SynCrop), og fra forskningsprogrammet byggeklosser i livet med prosjektnummer 737.016.005 av Nederland organisasjon for Scientific Research (NWO). T.E.G. ble støttet av Royal Society (Grant UF160357) og BrisSynBio, et BBSRC/EPSRC syntetisk biologi forskningssenter (Grant BB/L01386X/1). Vi takker Zi di og Jeffrey van Wijk for deres bidrag til gjær spotting eksperimenter for å lage gjær pixel kunst.

<ol>
	<li>Knott, G. J., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+guides+the+future+of+genetic+engineering.">CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering.</a> Science. 361 (6405), 866-869 (2018).</li><li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+metabolic+engineering+using+an+orthogonal+tri-functional+CRISPR+system.">Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system.</a> Nature Communications. 8 (1), 1688 (2017).</li><li>Li, Z. -. H., Liu, M., Lyu, X. -. M., Wang, F. -. Q., Wei, D. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+facilitated+large+fragment+deletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).</li><li>Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+facilitated+multiple-chromosome+fusion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).</li><li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Abudayyeh, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector.">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Makarova, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+evolutionary+classification+of+CRISPR-Cas+systems.">An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).</li><li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovi&#269;, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA.">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae.+using+the+CRISPR/Cas+System.">Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601 (2018).</li><li>Ferreira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+CRISPR/Cas9+genome+editing+and+gene+regulation+using+Csy4+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).</li><li>Swarts, D. C., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+versus+Cas12a/Cpf1:+Structure&#8211;function+comparisons+and+implications+for+genome+editing.">Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure&#8211;function comparisons and implications for genome editing.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481 (2018).</li><li>Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Basis+for+DNA+Target+Specificity+of+CRISPR-Cas12a.">Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a.</a> Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).</li><li>Verwaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+beta-carotene+in+Saccharomyces+cerevisiae.+by+successive+transformation+with+carotenogenic+genes+from+Xanthophyllomyces+dendrorhous.">High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).</li><li>Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+enables+fast+and+simple+genome+editing+of+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).</li><li>Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+advances+engineering+of+microbial+cell+factories.">CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories.</a> Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).</li><li>Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3 (11), 3647 (2008).</li><li>Franklin, R. E., Gosling, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+configuration+in+sodium+thymonucleate.">Molecular configuration in sodium thymonucleate.</a> Nature. 171, 740-741 (1953).</li><li>Watson, J. D., Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structure+for+deoxyribose+nucleic+acid.">A structure for deoxyribose nucleic acid.</a> Nature. 171, 737-738 (1953).</li><li>Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+deoxypentose+nucleic+acids.">Molecular structure of deoxypentose nucleic acids.</a> Nature. 171, 738-740 (1953).</li><li>Young, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+algorithm-guided+design+of+massive+strain+libraries,+applied+to+itaconic+acid+production+in+yeast.">Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast.</a> Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).</li><li>Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cloning Method. , (2013).</li><li>Mandel, M., Higa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+bacteriophage+DNA+infection.">Calcium-dependent bacteriophage DNA infection.</a> Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).</li><li>Van Dijken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interlaboratory+comparison+of+physiological+and+genetic+properties+of+four+Saccharomyces+cerevisiae+strains.">An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains.</a> Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Acids Research. 19 (20), 5791 (1991).</li><li>Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+genomic+DNA+from+yeasts+for+PCR-based+applications.">Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications.</a> Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).</li><li>Tak, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+multiplex+gene+regulation+using+CRISPR-Cpf1-based+transcription+factors.">Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors.</a> Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+editing+by+CRISPR-Cpf1+using+a+single+crRNA+array.">Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array.</a> Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).</li><li>Swiat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FnCpf1:+a+novel+and+efficient+genome+editing+tool+for+Saccharomyces+cerevisiae.">FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cpf1-Assisted+Multiplex+Genome+Editing+and+Transcriptional+Repression+in+Streptomyces.">CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces.</a> Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1.">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell Discovery. 3, 17018 (2017).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).</li><li>Perez, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GuideScan+software+for+improved+single+and+paired+CRISPR+guide+RNA+design.">GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).</li><li>Cox, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Biology+Open+Language+Visual+(SBOL+Visual)+Version+2.0.">Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0.</a> Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).</li></ol>

Forfatterne erklærer at det er en interessekonflikt. Forfatterne har arkivert IP relatert til presenterte metoder.

Den oppgitte protokollen beskriver multiplex Genova redigering av S. cerevisiae bruke Cas12a fra Lachnospiraceae bakterien ND2006 i kombinasjon med en enkelt CRRNA array og donor DNA. Design av singelen crRNA array og donor DNA er forklart i detalj. I motsetning til det veletablerte CRISPR/Cas9-systemet har CRISPR/Cas12a den unike tilleggs evnen til å behandle flere crRNAs uttrykt fra en enkelt crRNA array13,33. På grunn av denne funksjonen, er samtidig redigering av flere mål enklere å sette opp og kan oppnås i en enkelt transformasjon. Denne singelen crRNA array tilnærming ble demonstrert før av Zetsche et al. 34 som samtidig redigerte opptil fire gener i pattedyrceller ved hjelp av AsCas12a, og av Swiat et al. 35 som INTRODUSERTE fire DNA-fragmenter til en gjær-Genova ved hjelp av FnCas12a. Til vår kunnskap, et høyere antall samtidige genomisk modifikasjoner ved hjelp av et Cas12a system har ikke blitt rapportert og maksimal grense på mål per enkelt array for Cas12a er ennå ikke bestemt. Videre forskning utnytte single crRNA arrays i kombinasjon med Cas12a inkluderer multiplex transcriptional regulering i et bredt spekter av organismer33,36,37.
Det er noen kritiske trinn i den presenterte protokollen. Nøye designe alle DNA-sekvenser som er involvert i Cas12a Genova redigering eksperiment, spesielt i tilfelle når romanen DNA-sekvenser er innført. Bestem funksjonaliteten til nye spacer sekvenser del av en crRNA, for eksempel ved et singleplex Genova redigering eksperiment som beskrevet av Verwaal et al. 19 før kombinere dem i en enkelt crRNA array. Følg anbefalingene for utarbeidelse av transformasjon buffer løsninger som brukes i Cas12a redigering eksperimentet for å oppnå en god transformasjon effektiviteten av gjær.
Det er noen valgfrie modifikasjoner av teknikken. Det anbefales å bruke 1 μg av hver donor DNA, linearized pRN1120 eller enkelt crRNA array uttrykk kassett i transformasjonen, selv om bruken av et lavere DNA-beløp er også forventet å resultere i en tilfredsstillende transformasjon effektivitet. Utfør en test transformasjon for å bestemme om lavere DNA-beløp kan brukes. Transformasjonen av S. cerevisiae kan utføres ved hjelp av en annen metode enn den som er beskrevet i denne protokollen, for eksempel protokollen beskrevet av Gietz et al. (2007) 38. The guide RNA mottaker plasmider pRN1120 er egnet for uttrykk for en enkelt crRNA og enkelt crRNA rekke forskjellige Cas12a varianter (f. eks, fra Acidaminococcus spp. BV3L6 eller Francisella novicida U112) så vel som for uttrykk for sgRNA i kombinasjon med Cas919. Giveren DNA trenger ikke å være begrenset til karotenoid genuttrykk kassetter og flankerer regioner som mål giver DNA til de beskrevne INT1, INT2 og INT3 steder i genomisk DNA. Enhver DNA av interesse kan innføres, i en multiplex måte, inn genomisk DNA av verten av design prinsipper beskrevet i denne protokollen, eller alternativt donor DNA kan brukes til å slette DNA fra en vert Genova. Den modulære strukturen av enkelt crRNA array forenkler enkel justering av spacer og direkte gjenta sekvenser. Modifisering av avstands sekvenser muliggjør en endring av det tiltenkte integrasjons-stedet som kan utformes av et av verktøyene for identifisering av et genomisk målområde, for eksempel GuideScan programvare 1,039. I stedet for å bruke store flankerer sekvenser som inneholder kontakter sekvenser, 50-BP av flankerer regionen kan inngå i donor DNA-sekvenser ved å innlemme disse 50-BP flankerer regionen sekvenser i primere brukes i PCR. I dette tilfellet, i alt bare tre i stedet for ni donor DNA fragmenter er nødvendig for en vellykket multiplex Genova redigering eksperiment.
Oppsummert denne protokollen gir steg-for-steg retninger for å utføre multiplex Genova redigering i S. cerevisiae bruker Cas12a i kombinasjon med en enkelt crRNA array tilnærming. Protokollen ble demonstrert av multiplex Genova redigering ved hjelp av 9 donor DNA fragmenter og enkelt crRNA array koding for tre gRNAs. Vi viser høy samlet redigering frekvenser mellom 50% og 94% for de tre belastningen design rapportert her. Avsluttende, det enestående ansiktstrekk av Cas12a er evnen å forarbeide en enkelt crRNA oppstille i individ crRNAs inne en cellen, hvilke lager Cas12a en utmerket verktøyet å sette i stand multiplex Genova redigere bort og utvikle transcriptional regulering moduler målretter mangfoldig uttrykks kassetter på én gang. Til slutt ble trestammer oppnådd produsere karotenoider på et annet nivå og farger i nyanser mellom gult og oransje. Med disse stammer og en vill-type belastning, viste vi hvordan en akustisk væske handler kan brukes oversiktlig å gjøre gjær pixel kunst-dette til ære for Rosalind Franklin som bidro til oppdagelsen av DNA-strukturen 65 år siden av hennes berømte bilde 5123 < /c1>.

CRISPR/CAS enzymer har utvilsomt revolusjonert molekylærbiologi og vært allment vedtatt som verktøy for Engineering genomer med en hastighet som tidligere var unfeasible1. Det for det første modifisering av en Saccharomyces cerevisiae Genova av det CRISPR/Cas9 Genova redigere bort system var rapportere av DiCarlo et al. 2, demonstrere vellykket gen knock-out og gjøre punkt mutasjoner bruker eksternt innført oligonukleotider. Videre gjær CRISPR verktøykasse utviklingen inkludert: transcriptional regulering av fusjon av katalytisk inaktive døde Cas9 (dCas9) med transcriptional effektor domener for å muliggjøre aktivering og deaktivering av transkripsjon3, søknad for både Genova redigering og regulatoriske funksjoner for metabolske banen Engineering ved samtidig aktivering, undertrykking og sletting4, sletting av store fragmenter fra S. cerevisiae Genova5, og flere-kromosom fusjoner6 .
CRISPR/CAS Genova redigering systemer finner sin opprinnelse i adaptive immun systemer av bakterier og Archaea og disse systemene har blitt tilpasset av molekylær biologer for Genova redigering. Deres funksjonalitet er basert på gruppert regelmessig oppdelt Short Palindromic gjentar (CRISPR) DNA regioner koding RNA ansvarlig for anerkjennelse av det utenlandske DNA eller RNA og CRISPR tilhørende gener (CAS) som koder RNA-guidet endonucleases1,7,8,9. Basert på de siste Genova analyse av CRISPR/CAS systemer ble det foreslått å dele CRISPR/CAS systemer i to klasser, fem typer og 16 under typer10. De to klassene skilles basert på organiseringen av effektor komplekser involvert i mål kløften. Vanligvis kategoriseres CRISPR/CAS-systemer med en multi-delenhet organisasjon som klasse 1, mens enkelt delenhet effektor komplekser tilhører klasse 210,11. I dette dokumentet, Utforsker vi klasse 2 type V Cas12a, tidligere kalt Cpf110,12, som er et alternativ til klasse 2 type II Cas9. Selv om Cas9 er godt preget og mye brukt i forskning, Cas12a tilbyr flere funksjoner12. For det første danner Cas12a et kompleks med CRISPR RNA (crRNA) på 42 til 44 nukleotider uten å kreve ytterligere trans-aktivering CRISPR RNA (tracrRNA). Derfor kan en kortere guide RNA benyttes i Genova redigering med CRISPR/Cas12a systemer sammenlignet med CRISPR/Cas9. For det andre, den unike endonuclease og endoribonuclease aktivitet av Cas12a muliggjør modning av sin pre-crRNA13. Dette RNase aktivitet tillater koding av flere crRNAs på en enkelt CRISPR crRNA array, mens Cas9 krever separate uttrykk for hver såkalte single-guide RNA (sgRNA) eller alternativt for eksempeluttrykk for en ekstra endonuclease ( f. eksCsy4) i kombinasjon med anerkjennelse motiver for Csy4 rundt hver sgRNA14,15. For det tredje, Cas12a mål sted gjenkjennelse behøver en protospacer tilstøtende motiv (PAM) for det 5 ' end fra målet og kløyver etter det 18/+ 23 holdning fra dens PAM resulterer inne kløyvde DNA med klebrig ender, mens Cas9 behøver en PAM lokalisert på 3 ' end fra det mål og kløyver etter at-3 posisjon skaper sløv ende kutt i DNA12. Det fjerde, er konsensus nukleotid sekvensen av PAM forskjellig mellom Cas12a ((T) TTV) og Cas9 (NGG), som gjør Cas12a en lovende kandidat for målretting T-rik promoter og Terminator sekvenser16. Endelig, en fersk studie rapportert større mål spesifisitet for Cas12a enn for de innfødte Cas917.
Vi presenterer en protokoll for bruk av CRISPR/Cas12a system for Genova redigering av S. cerevisiae med et spesielt fokus på innføring av flere DNA-uttrykk kassetter i uavhengige genomisk Loci samtidig (multiplex Genova redigering) ved hjelp en enkelt crRNA array. De viktigste trinnene i protokollen er avbildet i figur 1. Som et bevis på konseptet ble CRISPR/Cas12a systemet søkt om innføring av tre uttrykk kassetter i Genova av S. cerevisiae som muliggjør produksjon av β-karoten18 som skjematisk vist i figur 2. Produksjon av β-karoten påvirker fenotype av S. cerevisiae: dvs, etter vellykket innføring av alle tre heterologous gener som kreves for karotenoider biosyntesen, den hvite S. cerevisiae celler blir gule eller oransje, avhengig av uttrykket styrke hvert gen promoter. På grunn av den enkle visuelle lese-ut av denne veien, har det blitt innført for å utvikle avanserte CRISPR-baserte systemer og metoder for Genova redigering19,20. I dette arbeidet, uttrykks kassetter koding av karotenoid gener crtE, crtYB og crtI har blitt bygget ved hjelp av en Golden Gate kloning (GGC) tilnærming21 med heterologous arrangører og homologe terminatorer brukes til å lede uttrykk for genene. Uttrykket kassetter er omgitt av unike 50-base par (BP) sekvenser, kalt kontakter, som tillater in vivo forsamling med integrering flanke DNA-sekvenser (flankerer regioner) med samme 50-BP sekvenser, og påfølgende integrering inn i genomisk DNA av gjær på posisjonen bestemmes av flankerer regioner. Ved å bruke ulike promoter styrker, ble stammer med ulike nivåer av karotenoider produksjon oppnådd resulterer i variasjon i fargen på cellene. Disse stammer-inspirert av "gjær Art Project"22 -ble brukt i en spotting oppsett med en akustisk flytende handler å lage en 4-fargers høyoppløselig "gjær fotografi" av Rosalind Franklin. Franklin (1920-1958) var en engelsk kjemiker og X-ray crystallographer kjent for sitt bidrag til oppdagelsen av DNA-strukturen ved bilde 5123,24,25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals specific for the protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td style="width:175px;">Selection of E. coli transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">BsaI-HF (20 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R353L</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td style="width:175px;">Transfromation of 
			S. cerevisiae (carrier DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">dNTPs</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethanol absolute for analysis</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethylenediamine-tetraacetic acid</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Histodenz</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D2158&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Yeast pixel art</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100993</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nancy-520 DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>1494</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NEB10 competent E. coli cells</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>C3019H</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nourseothricin</td>
			<td style="width:144px;">Jena Bioscience</td>
			<td>AB102</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Phusion buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Polyethylene glycol 4000</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>7490</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:156px;">Purple loading dye</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td style="width:175px;">Purification of plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">RNase coctail enzyme mix</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>46300-018</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA Ligase (1 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>1705218</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit</td>
			<td style="width:144px;">Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td style="width:175px;">Purification of PCR products and linearized pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Xhol</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Zymolyase 50 mg/ml (5 units/&#181;L)</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1006</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:156px;">Zymolyase storage buffer</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1004-B</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals of general use</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">2*Peptone-Yeast extract (PY) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">2*PY medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Demineralized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">ELFO buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">MQ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Physiological salt solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">YEPD (2% glucose) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microplate 96 wells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 0.5 - 10 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 10 - 200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Pipette tips 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Shake flasks (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Sterile filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Centrifuge (Falcon tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Echo 525 acoustic liquid handler</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">NanoDrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Set for eletrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Table centrifuge (Eppendorfs tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCSN067</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101748</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pRN1120</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101750</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">S. cerevisiae strain 
			CEN.PK113-7D</td>
			<td style="width:144px;">EUROSCARF collection</td>
			<td></td>
			<td>http://www.euroscarf.de</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art

Høy effektivitet, brukervennlighet og allsidighet av gruppert regelmessig oppdelt korte palindromic repetisjoner/CRISPR-assosiert protein 9 (CRISPR/Cas9) systemet har tilrettelagt avansert genetisk modifisering av Saccharomyces cerevisiae, en modell organisme og arbeidshest i industriell bioteknologi. CRISPR-assosiert protein 12a (Cas12a), en RNA-styrt endonuclease med funksjoner som kan skilles fra Cas9 brukes i dette arbeidet, og videre utvide den molekylære verktøykasse for bruk i Genova. En fordel av CRISPR/Cas12a system er det alt den kan brukes inne multiplex Genova redigere bort med mangfoldig guide RNAs uttrykt fra en enkelt transcriptional enhet (enkelt CRISPR RNA (crRNA) oppstille). Vi presenterer en protokoll for multiplex integrering av flere heterologous gener i uavhengige Loci av S. cerevisiae Genova ved hjelp av CRISPR/Cas12a system med flere crRNAs uttrykt fra en enkelt crRNA array konstruere. Den foreslåtte metoden utnytter evnen til S. cerevisiae å utføre in vivo rekombinasjon av DNA-fragmenter å montere singelen crRNA array i en plasmider som kan brukes til transformant utvalg, samt montering av donor DNA sekvenser som integreres i Genova ved tiltenkte posisjoner. Cas12a er pre-uttrykt constitutively, tilrettelegge kløft av S. cerevisiae Genova på de tiltenkte stillingene ved uttrykk for singelen crRNA array. Protokollen omfatter design og bygging av en enkelt crRNA array og donor DNA-uttrykk kassetter, og utnytter en integrerings tilnærming som gjør bruk av unike 50-BP DNA-kontakter sekvenser og egen integrasjon flanke DNA-sekvenser, noe som forenkler eksperimentell design gjennom standardisering og Modularisering og utvider utvalget av applikasjoner. Til slutt viser vi en grei teknikk for å lage gjær pixel kunst med en akustisk flytende handler med forskjellig fargede karotenoid produsere gjær stammer som ble konstruert.

Protokollen for multiplex Genova redigering ved hjelp av CRISRP/Cas12a ble demonstrert ved å konstruere tre karotenoid produsere S. cerevisiae stammer uttrykker crtE, crtYB og crtI gener ved hjelp av heterologous arrangører av høy, middels og lav styrke: stamme 1, 2 og 3 henholdsvis (supplerende tabell 3). Byggingen av disse stammene kreves generasjon av tre donor DNA-uttrykk og seks flankerer regioner per stamme for målretting til tre forskjellige Loci i genomisk DNA (vist i figur 2B). Som beskrevet heri, arrangøren, åpen lesing ramme, Terminator og to sammenhengende 50-BP kontakter sekvenser ble samlet inn i et uttrykk kassett via en Golden Gate kloning reaksjon og forsamlingen ble verifisert av PCR (Figur 3a). Singelen crRNA array ble bestilt som et syntetisk DNA-fragment og ble forsterket av PCR (Figur 3B). Mottakeren plasmider for singelen crRNA array (plasmider pRN1120) ble linearized med Ecori-HF og Xhoi og linearization ble bekreftet av elektroforese (Figur 3C). Design og nukleotid sekvenser av de innførte donor DNA uttrykks kassetter og flankerer regioner er vist i supplerende tabell 3 og supplerende tabell 4. Sekvensen av enkelt crRNA array uttrykks kassetter er gitt i supplerende tabell 1. Funksjonaliteten til avstandsstykker inkludert i singelen crRNA array ble testet på forhånd av singleplex Genova redigering med individuelle crRNAs19.
Effektiviteten av Genova redigere bort benytter Cas12a var for det første vurdert basert på antallet av farget kolon oppnådd etter transformasjon (bord 1, skikkelsen 4). Redigering effektiviteten av de tre konstruerte stammene varierte fra 50% til 94%. Spesielt, innføring av uttrykks kassetter som brukes til å generere belastning 1 vist lavest redigering effektivitet, muligens forårsaket av arten av donor DNA (dvs.disse uttrykks kassetter kode crtE, crtYB og crtI fra tre høy styrke arrangører). For det andre, korrekt integrering av de tre donor DNA-uttrykks kassettene på den tiltenkte Loci på genomisk DNA ble bekreftet av PCR (figur 5). Primere ble utformet på en slik måte at PCR-produkter ble innhentet når korrekt integrering av donor DNA på det tiltenkte geometriske sted inntraff. For hver transformasjon eksperiment ble åtte kolonier plukket fra transformasjon plate og testet (Merk at bare tre er presentert i figur 5). Generelt, av 8 kolonier testet per giver DNA, korrekt integrering av crtE donor DNA på INT1-geometrisk, crtYB ved INT2-geometrisk og crtI ved INT3, ble bekreftet i > 90% av transformants. Disse resultatene demonstrere CRISPR/Cas12a systemet i kombinasjon med en enkelt crRNA array muliggjør effektiv multiplex redigering av S. cerevisiae Genova på flere Loci samtidig.
I tillegg viser vi opprettelsen av "gjær pixel kunst" ved hjelp av tre karotenoid produsere stammer som ble konstruert sammen med en ikke-farget vill-type belastning. Starter fra et svart-hvitt bilde av Rosalind Franklin (figur 6a), en 4-farge bilde (figur 6B) og spotting listen ble opprettet som deretter ble brukt til å oppdage de fire forskjellige gjær stammer på en agar mikroplate ved hjelp av en akustisk væske handler, noe som resulterer i en høyoppløselig "gjær Maleri" av Rosalind Franklin (figur 6C, D, E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig1v5.jpg"> Figur 1 : Arbeidsflyt av protokollen for CRISPR/Cas12a multiplex Genova redigering i S. cerevisiae. Arbeidsflyten inneholder viktige trinn i den presenterte metoden. Se protokoll for mer informasjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig2.jpg"> Figur 2 : Scheme av CRISPR/Cas12a multiplex Genova redigering ved hjelp av en enkelt crRNA array. (A) singelen crRNA array består av tre crRNAs enheter i sin modne form, en 20-BP direkte gjenta spesifikke for LbCas12a (grå firkanter) med en 23-BP guide sekvens (fargede diamanter). Uttrykk for crRNA-matrisen er aktivert av SNR52 promoter og SUP4 Terminator. Transformasjon av S. cerevisiae med en linearized pRN1120 og singelen crRNA array uttrykk kassett som inneholder homologi med pRN1120 (Diagonal striper) gjør det mulig for in vivo rekombinasjon i en sirkulær plasmider i cellene pre-uttrykker LbCas12a. Den enkle crRNA-matrisen behandles deretter av Cas12a. (B) Cas12a er rettet til den tiltenkte INT1, INT2 og INT3 genomisk målområder og skaper doble strandet pauser. I overgangs blandingen ble donor DNA bestående av flankerer regioner og karotenoid gen uttrykks kassett inkludert. Donor DNA forsamlinger var rettet mot en strekning av DNA i genomisk DNA rundt INT1 (crtE), INT2 (CRTYB) og INT3 (crtI) Loci av in vivo rekombinasjon på grunn av tilstedeværelsen av 50-BP homologe kontakter sekvenser, indikert som 5, A, B, C, D eller E. P1 – P3, ulike arrangører; T1 – T3, forskjellige terminatorer. Dette tallet er blitt modifisert fra Verwaal et al. 201819. Genetiske konstruksjoner vist ved hjelp av syntetisk biologi Open Language (SBOL) visuelle symboler40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig3.jpg"> Figur 3 : PCR bekrefter redigerings forsøkene for Genova. (A) verifisering av Golden Gate kloning reaksjoner av MONTERTE donor DNA-kassetter. Oppnådde resultater er i overensstemmelse med forventet lengde. (B) PCR av singelen crRNA array. (C) linearization av plasmider pRN1120. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig4.jpg"> Figur 4 : Plater av S. cerevisiae transformasjoner bruker multiplex Genova redigering tilnærming. (A) stamme 1 uttrykker crtE, crtYB og crtI fra tre sterke arrangører (Dark Orange kolonier). (B) stamme 2 uttrykker crtE, crtYB og crtI fra tre middels styrke arrangører (oransje kolonier). (C) stamme 3 uttrykker crtE, crtYB og crtI fra tre lav styrke arrangører (gule kolonier). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig5.jpg"> Figur 5 : PCR bekrefter integreringen av DNA-Loci i donor-kassettene i den tiltenkte GENOMISK DNA-en. (A) verifikasjon av tre kolonier av stammen 1. (B) verifikasjon av tre kolonier av stammen 2. (C) verifikasjon av tre kolonier av stammen 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig6.jpg"> Figur 6 : Gjær pixel kunst av Rosalind Franklin. (A) svart og hvitt RGB bilde av 220 × 280 piksler av Rosalind Franklin som ble brukt som en mal. (B) computer konvertering av svart og hvitt bilde av Rosalind Franklin i en 4-fargers 64 × 96 pixel liste. (C) bilde av gjær pixel kunst med 64 × 96 gjær kolonier med en zoomet inn delen. (D) bilde av en akustisk væske handler med to fulle vokst plater. (E) bilde av en full vokst mikroplate med 64 × 96 gjær kolonier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Stamme 1</td>
			<td>Stamme 2</td>
			<td>Stamme 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fargede kolonier</td>
			<td>16</td>
			<td>279</td>
			<td>220</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hvite kolonier</td>
			<td>16</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antall kolonier</td>
			<td>32</td>
			<td>297</td>
			<td>238</td>
		</tr>
<tr>
<td>Effektivitet</td>
			<td>50 prosent</td>
			<td>94 prosent</td>
			<td>92 prosent</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: redigering effektiviteten av multiplex Genova redigering tilnærming.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>crRNA array sekvensa, b, c, d, e, f</td>
		</tr>
<tr>
<td>
CATGTTTGACAGCTTATCATCGATAATCCGGAGCTAGCATGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAG TCTTTGAAAA GATAATGTATGATTATGCTTTCACTCATATTTATACAGAAACTTGATGTTTTCTTTCGAGTATATACAAGG TGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCA TTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGC ATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCAATTTCTACTAAGTGTAGAT CTGGTGGGAGAGAAAGCTTATGAAATTTCTACTAAGTGTAGATGTGCCGTAC GCCGGAGCCGACGGAATTTCTACTAAGTGTAGATTGCCCCTCTTATACGATTATATTTT TTTTTGTTTTTTATGTCTGGGGGGCCCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGG GTTAATTCCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG
</td>
		</tr>
<tr>
<td>a. homologi til pRN1120 (fet). b. SNR52 promoter (kursiv). c. genomisk mål sekvenser (understreket). d. guide direkte gjentar spesifikke for LbCas12a (kursiv, fet). e. SUP4 Terminator (kursiv). f. homologi til pRN1120 (fet).</td>
		</tr>
</tbody></table>Supplerende tabell 1: enkel crRNA array for LbCas12a inneholder homologi med plasmider pRN1120.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>navn</td>
			<td>Sekvensa</td>
			<td>Beskrivelseb</td>
			<td>Brukes i punkt</td>
		</tr><tr><td>KC-101</td>
			<td>CATGTTTGACAGCTTATCATC</td>
			<td>FW primer for forsterkning av enkelt crRNA array</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-102</td>
			<td>CACACAGGAAACAGCTATGAC</td>
			<td>RV primer for forsterkning av enkelt crRNA array</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-103</td>
			<td>AAGCGACTTCCAATCGCTTTGC</td>
			<td>FW primer for forsterkning av donor DNA med kontakt 5</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-104</td>
			<td>AAAGCAAAGGAAGGAGAGAAC</td>
			<td>RV primer for forsterkning av donor DNA med kontakt A</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-105</td>
			<td>CGGATCGATGTACACAACCG</td>
			<td>FW primer for forsterkning av donor DNA med kontakt B</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-106</td>
			<td>CAACAGGAGGCGGATGGATATAC</td>
			<td>RV primer for forsterkning av donor DNA med kontakt C</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-107</td>
			<td>AACGTTGTCCAGGTTTGTATCC</td>
			<td>FW primer for forsterkning av giver DNA med kontakt D</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-108</td>
			<td>AGGTACAACAAGCACGACCG</td>
			<td>RV primer for forsterkning av donor DNA med kontakt E</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-109</td>
			<td>CACTATAGCAATCTGGCTATATG</td>
			<td>FW primer for forsterkning av INT1 5 ' med kontakt 5</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-110</td>
			<td>
AAACGCCTGTGGGTGTGGTAC TGGATATGCAAAGCGATTGGAA GTCGCTTGACTCCTCTGCCGTC ATTCC</td>
			<td>RV primer for forsterkning av INT1 5 ' med kontakt 5</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-111</td>
			<td>
TTGCCCATCGAACGTACAAG TACTCCTCTGTTCTCTCCTTCCTT TGCTTTAAGCGTTGAAGTTTCCTC TTTG</td>
			<td>FW primer for forsterkning av INT1 3 ' med kontakt A</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-112</td>
			<td>TGTCAACTGGAGAGCTATCG</td>
			<td>RV primer for forsterkning av INT1 3 ' med kontakt A</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-113</td>
			<td>AGAAGATTTCTCTTCAATCTC</td>
			<td>FW primer for forsterkning av INT2 5 ' med kontakt B</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-114</td>
			<td>
TGCTAAGATTTGTGTTCGTT TGGGTGCAGTCGGTTGTGTACAT CGATCCGCCCTTATCAAGGATACC TGGTTG</td>
			<td>RV primer for forsterkning av INT2 5 ' med kontakt B</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-115</td>
			<td>
ACGCTTTCCGGCATCTTCCA GACCACAGTATATCCATCCGCCT CCTGTTGGGCGATTACACAAGCG GTGG</td>
			<td>FW primer for forsterkning av INT2 3 ' med kontakt C</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-116</td>
			<td>TCTCCTCTTCGATGACCGGG</td>
			<td>RV primer for forsterkning av INT2 3 ' med kontakt C</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-117</td>
			<td>GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTG</td>
			<td>FW primer for forsterkning av INT3 5 ' med kontakt D</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-118</td>
			<td>
GCGGAATATTGGCGGAACGG ACACACGTGGATACAAACCTG GACAACGTTTTCCAAGGAGGTG AAGAACG</td>
			<td>RV primer for forsterkning av INT3 5 ' med kontakt D</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-119</td>
			<td>
AAATAACCACAAACATCCTT CCCATATGCTCGGTCGTGCTTGTT GTACCTGATGGGACGTCAGCACT GTAC</td>
			<td>FW primer for forsterkning av INT3 3 ' med kontakt E</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-120</td>
			<td>GAGCTTACTCTATATATTCATTC</td>
			<td>RV primer for forsterkning av INT3 3 ' med kontakt E</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-121</td>
			<td>GTTACTAAACTGGAACTGTCCG</td>
			<td>FW primer for verifisering av integrering av con5-crtE-conA til INT1 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-122</td>
			<td>CACTGCTAACTACGTTTACTTC</td>
			<td>FW primer for verifisering av integrering av con5-crtE-conA til INT1 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-123</td>
			<td>CACTGGAACTTGAGCTTGAG</td>
			<td>FW primer for verifisering av integrering av conB-crtYB-conC til INT2 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-124</td>
			<td>GTCTCCAGCTGAATTGGTCC</td>
			<td>FW primer for verifisering av integrering av conB-crtYB-conC til INT2 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-125</td>
			<td>CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC</td>
			<td>FW primer for verifisering av integrering av crtI-conE til INT3 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-126</td>
			<td>GATCGGTCAATTAGGTGAAG</td>
			<td>FW primer for verifisering av integrering av crtI-conE til INT3 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-127</td>
			<td>CCTTGTCCAAGTAGGTGTCC</td>
			<td>RV primer for verifisering av integrering av con5-crtE-conA til INT1 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-128</td>
			<td>GCTGTCATGATCTGTGATAAC</td>
			<td>RV primer for verifisering av integrering av con5-crtE-conA til INT1 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-129</td>
			<td>CTGGCAATGTTGACCAATTGC</td>
			<td>RV primer for verifisering av integrering av conB-crtYB-conC til INT2 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-130</td>
			<td>CCAACGTGCCTTAAAGTCTG</td>
			<td>RV primer for verifisering av integrering av conB-crtYB-conC til INT2 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-131</td>
			<td>CCTTACCTTCTGGAGCAGCAG</td>
			<td>RV primer for verifisering av integrering av crtI-conE til INT3 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-132</td>
			<td>CTGGTTACTTCCCTAAGACTG</td>
			<td>RV primer for verifisering av integrering av crtI-conE til INT3 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>a. fet sekvenser betegner koblings sekvenser. b. forover og bakover primere er utpekt som FW og RV, henholdsvis.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Supplerende tabell 2: primer sekvenser.
<img alt="Supplementary Table 3" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable3.jpg"> Supplerende tabell 3: design av konstruerte stammer.
<img alt="Supplementary Table 4" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable4.jpg"> Supplerende tabell 4: sekvenser av DONOR DNA uttrykks kassetter og flass regioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/Suppl_Table_4.docx" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a-systemet i kombinasjon med en enkelt crRNA-matrise muliggjør effektiv multiplex redigering av S. cerevisiae -Genova på flere Loci samtidig. Dette er demonstrert ved å konstruere karotenoid produsere gjær stammer som senere brukes til å lage gjær piksel kunst.

CRISPR/Cas12a multiplex Genova redigering av Saccharomyces cerevisiae og opprettelse av gjær pixel art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Denne protokollen demonstrerer en ny metode for Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae ved å introdusere flere uttrykkskassetter på forskjellige loci i et enkelt transformasjonstrinn. Denne kloning gratis plasmid montering tilnærming for å uttrykke en enkelt crRNA array, fører til en rask, effektiv og fleksibel genom redigeringsprotokoll. Vi vil konstruere ville type gjærceller, for å produsere karotenoider ved å introdusere gratis heterologgener på fri genomisk loci.Den enkle crRNA array består av gratis individuelle crRNAs uttrykt fra RNA polymerase gratis promotor. Cas12a prosesser in vivo crRNA array i individuelle crRNAs. CrRNAs guide Cas12a til målet loci på genomisk DNA der Cas12a introduserer dobbel tråd pauser.Nedadgående DNA fragmenter rekombin for in vivo rekombinasjon og integreres i genomisk DNA. Å demonstrere protokollen vil være Klaudia Ciurkot, en ph.d.-student. Jeffery van Wijk, en førsteamanuensis.Og Brenda Vonk, en senior førsteamanuensis fra laboratoriet vårt. Etter å ha fått en enkelt crRNA array for Multiplex Genome Editing eksperimenter av syntetisk DNA, forberede PCR forsterkning blanding, og laste matrisen inn i termocycler for forsterkning. For å analysere PCR-produktene ved elektroforese, kjør prøvene på en 0,8% agarose gel ved 5 V / cm i 40 minutter.Last DNA-stigen med DNA-fragmenter fra 100 10000 basispar Deretter renser du PCR-produktene ved hjelp av et PCR-rensesett i henhold til produsentens instruksjoner. For gjær transformasjon, begynne med pre-culturing vill type gjær i en 100 ml kolbe som inneholder 20 ml gjær ekstrakt pepton dextrose eller YEPD medium. For en overnatting inkubasjon, på 30 grader Celsius, og 250 rotasjoner per minutt Neste morgen, inokulere 20 ml fersk YEPD medium med et beregnet volum av natten pre-kultur gjær.Plasser kulturen i en ristende inkubator til en optisk tetthet på 1,0, målt ved 600 nanometer er nådd. Høst gjærcellene ved sentrifugering. Vask gjærcellepelleten i 20 ml romtemperatur demineralisert vann, etterfulgt av en ekstra sentrifugering.Resuspend pellet i 100 mikroliter litiumacetat Tris-EDTA løsning, og overføre gjær til en mikrocentrifuge tube. Bland fem mikroliter av entrådet bærer DNA og ett mikrogram plasmid pCSN067 med gjær celle suspensjon. Bland deretter 600 mikroliter polyetylenglykol LiAc-TE-løsning med prøven.Inkuber gjærcellene og plasmid i 30 minutter ved 30 grader Celsius og 450 prm i en bordplate varmeblokk. På slutten av inkubasjonen blander du 70 ml dimetylsulfoksid med transformasjonsløsningen. Varm sjokk blandingen i 15 minutter i et 42 grader Celsius vannbad.Overfør blandingen til et 15 ml rundt bunnrør. Legg 10 ml YEPD til røret for en overnatting inkubasjon ved 30 grader Celsius og 250 rpm. Neste morgen samler du de forvandlede cellene ved sentrifugering, og aspirerer alle unntatt de siste 200 mikroliter av det overnaturante.Resuspend den forvandlede gjær celle pellet i de resterende supernatant. Plate 150 mikroliter av transformasjonsblandingen, og 150 mikroliter av en 20 ganger fortynning av de resterende 50 mikroliter transformasjonsblandingen i YEPD, på YEPD agarplater, supplert med 0,2 gram per liter G418. Etter 48 til 72 timer ved 30 grader Celsius, velg en enkelt transformant for re-streaking på en ny YEPD agar plate supplert med 0,2 g / L G418.For den andre transformasjonen, vokse kulturen til en optisk tetthet på 600 nanometer på 1,0, som nettopp demonstrert. Og tilsett 20 mikroliter celler til et mikrocentrifugerør. Etter sentrifugering, resuspend cellepellet i 100 mikroliter av LiAc-TE løsning, og legge ssDNA.I et eget rør kombinerer du ett mikrogram av den enkle crRNA-matrisen, ett mikrogram av den lineariserte mottakeren plasmid for crRNA-arrayet, ett mikrogram av hvert donor-DNA og ett mikrogram av hvert flankerende område. Deretter overfører DU DNA-blandingen til røret av kompetente gjærceller og fullfører den andre transformasjonen som demonstrert for den første transformasjonen. Neste morgen, samle cellene ved sentrifugering og resuspend pellet i en liten aliquot av supernatant.Deretter plate 150 mikroliter av transformasjonsblandingen, og 150 mikroliter av en 20 ganger fortynning av transformasjonsblandingen i YEPD medium, på YEPD agarplater supplert med 0,2 g/L G418, og 0,2 g/l nourseothricin Etter 48 til 72 timer, ved 30 grader Celsius, velg en enkelt farget transformant for re-streaking på en ny YEPD plate for å få ensfarget kolonier. For å bestemme genomredigeringseffektiviteten, telle antall fargede og hvite kolonier på transformasjonsplatene, og dele antall fargede kolonier med totalt antall kolonier. For å lage gjærpikselkunst, inokulerer individuelle 500 ml risteflasker som inneholder 100 ml YEPD-medium med tre forskjellig fargede karotenoid som produserer S.cerevisiae-stammer, og en vill type CEN.PK113-7D belastning. Inkuber kulturene over natten på 30 grader Celsius med risting på 250 rpm. Overfør 0,5 ml av hver kultur over natten til individuelle rør som inneholder 0,5 ml sterilt, ikke-ionisk tetthetsgradient medium per rør, og bland løsningene kort ved å virvle.Overfør cellesuspensjonene til individuelle, kvalifiserte reservoar 2 av 3 brønner. Bruk en csv-fil med væskekalibreringsinnstillingen 6RES_AQ_GPSA2 på et akustisk væskebehandlingsinstrument for å oppdage 25 nanoliter av hver S.cerevisiae-stamme fra riktig kvalifisert reservoarkildeplate på en 6144-brønndestibplate som inneholder 50 ml YEPD-agar. Når alle brønnene er oppdaget, inkuber mikroplaten ved 30 degress Celsius i 48 timer.For å intensivere fargene på stammene, lagre agarplatene ved 4 grader Celsius i minst 72 timer. Et bilde av Rosalind Franklin har dukket opp på tallerkenen. Som demonstrert kan promotor, åpen leseramme, terminator og to sammenhengende 50 bp-koblingssekvenser monteres til en uttrykkskassett via en Golden Gate kloningsreaksjon, og verifiseres av PCR.Etter forsterkning av enkelt crRNA array av PCR, mottakeren plasmid for enkelt crRNA array er linearisert som bekreftet av elektroforese. Effektiviteten til Multiplex Genome Editing kan beregnes av prosentandelen av fargede kolonier etter transformasjonen, og av resultatene av PCR-analyser som bekrefter integreringen av donor-DNA på de tiltenkte genomiske DNA-stedene. For eksempel, fra et svart-hvitt bilde av Rosalind Franklin, ble det opprettet et firefargebilde og spotting liste som deretter ble brukt til å oppdage de fire forskjellige gjærstammene på en agarmikroplate via en akustisk flytende handler, som demonstrert, noe som resulterte i et høyoppløselig gjærmaleri av forskeren.For denne transformasjonen, bruk nyberederte løsninger og DNA-fragmenter av høy kvalitet. Denne metoden kan også brukes for multipleks innføring av definerte slettinger og punktmutasjoner i genomisk DNA. I tillegg kan CRISPR-reguleringseksperimenter utføres.Denne metoden kan endres for å introdusere mer enn gratis crRNAs i en matrise for å øke antall samtidige modifikasjoner som kan gjøres.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Lensfree On-chip tomographic Mikroskopi Ansette Multi-angle Belysning og Pixel Super-oppløsning

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Kontinuerlig høy oppløsning Mikroskopisk Observasjon av replicative Aldring i Spirende Gjær

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Teknikker for utviklingen av Robust Pentose-fermen gjær for biokonversjon av lignocellulose til Etanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Opprettelse av hjertevæv som viser mekanisk integrasjon av sfæroider ved hjelp av 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv generasjon og redigering av mater-gratis IPSCs fra menneskelige bukspyttkjertelen celler ved hjelp av CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Optimalisering av en Multiplex RNA-baserte uttrykk analysen bruker bryst kreft arkivmateriale

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection Western mais Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryo for Germline transformasjon eller CRISPR/Cas9 genomet redigering

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

En netto Mold-basert metode skaperverket stillaset-fri tredimensjonale hjerte vev

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...