Name: crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

Этот проект получил финансирование от научно-исследовательской и инновационной программы Европейского союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 686070 (DD-DeCaf) и 764591 (SynCrop), а также от исследовательской программы «Строительные блоки жизни» с проектом No 737.016.005 Нидерландская организация научных исследований (НВО). T.E.G. была поддержана Королевским обществом (грант UF160357) и BrisSynBio, Исследовательским центром синтетической биологии BBSRC/EPSRC (грант BB/L01386X/1). Мы благодарим Ци Ди и Джеффри ван Wijk за их вклад в дрожжи пятнистость экспериментов для создания дрожжевого пикселя искусства.

<ol>
	<li>Knott, G. J., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+guides+the+future+of+genetic+engineering.">CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering.</a> Science. 361 (6405), 866-869 (2018).</li><li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+metabolic+engineering+using+an+orthogonal+tri-functional+CRISPR+system.">Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system.</a> Nature Communications. 8 (1), 1688 (2017).</li><li>Li, Z. -. H., Liu, M., Lyu, X. -. M., Wang, F. -. Q., Wei, D. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+facilitated+large+fragment+deletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).</li><li>Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+facilitated+multiple-chromosome+fusion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).</li><li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Abudayyeh, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector.">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Makarova, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+evolutionary+classification+of+CRISPR-Cas+systems.">An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).</li><li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovi&#269;, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA.">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae.+using+the+CRISPR/Cas+System.">Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601 (2018).</li><li>Ferreira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+CRISPR/Cas9+genome+editing+and+gene+regulation+using+Csy4+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).</li><li>Swarts, D. C., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+versus+Cas12a/Cpf1:+Structure&#8211;function+comparisons+and+implications+for+genome+editing.">Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure&#8211;function comparisons and implications for genome editing.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481 (2018).</li><li>Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Basis+for+DNA+Target+Specificity+of+CRISPR-Cas12a.">Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a.</a> Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).</li><li>Verwaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+beta-carotene+in+Saccharomyces+cerevisiae.+by+successive+transformation+with+carotenogenic+genes+from+Xanthophyllomyces+dendrorhous.">High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).</li><li>Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+enables+fast+and+simple+genome+editing+of+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).</li><li>Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+advances+engineering+of+microbial+cell+factories.">CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories.</a> Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).</li><li>Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3 (11), 3647 (2008).</li><li>Franklin, R. E., Gosling, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+configuration+in+sodium+thymonucleate.">Molecular configuration in sodium thymonucleate.</a> Nature. 171, 740-741 (1953).</li><li>Watson, J. D., Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structure+for+deoxyribose+nucleic+acid.">A structure for deoxyribose nucleic acid.</a> Nature. 171, 737-738 (1953).</li><li>Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+deoxypentose+nucleic+acids.">Molecular structure of deoxypentose nucleic acids.</a> Nature. 171, 738-740 (1953).</li><li>Young, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+algorithm-guided+design+of+massive+strain+libraries,+applied+to+itaconic+acid+production+in+yeast.">Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast.</a> Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).</li><li>Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cloning Method. , (2013).</li><li>Mandel, M., Higa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+bacteriophage+DNA+infection.">Calcium-dependent bacteriophage DNA infection.</a> Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).</li><li>Van Dijken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interlaboratory+comparison+of+physiological+and+genetic+properties+of+four+Saccharomyces+cerevisiae+strains.">An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains.</a> Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Acids Research. 19 (20), 5791 (1991).</li><li>Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+genomic+DNA+from+yeasts+for+PCR-based+applications.">Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications.</a> Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).</li><li>Tak, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+multiplex+gene+regulation+using+CRISPR-Cpf1-based+transcription+factors.">Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors.</a> Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+editing+by+CRISPR-Cpf1+using+a+single+crRNA+array.">Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array.</a> Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).</li><li>Swiat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FnCpf1:+a+novel+and+efficient+genome+editing+tool+for+Saccharomyces+cerevisiae.">FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cpf1-Assisted+Multiplex+Genome+Editing+and+Transcriptional+Repression+in+Streptomyces.">CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces.</a> Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1.">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell Discovery. 3, 17018 (2017).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).</li><li>Perez, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GuideScan+software+for+improved+single+and+paired+CRISPR+guide+RNA+design.">GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).</li><li>Cox, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Biology+Open+Language+Visual+(SBOL+Visual)+Version+2.0.">Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0.</a> Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).</li></ol>

Авторы заявляют, что существует конфликт интересов. Авторы подали ИС, связанные с представленными методами.

Представленный протокол описывает редактирование мультиплексного генома S. cerevisiae с использованием Cas12a от бактерии Lachnospiraceae ND2006 в сочетании с единым массивом CRRNA и донорской ДНК. Подробно объясняется дизайн единого массива CRRNA и донорской ДНК. В отличие от хорошо зарекомендовавшей себя системы CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas12a обладает уникальной дополнительной способностью обработки нескольких CRRN, выраженных из одного массива CRRNA13,33. Благодаря этой функции, одновременное редактирование нескольких целей легче настроить и может быть достигнуто в одной трансформации. Этот подход к единому массиву CRRNA был продемонстрирован ранее Цетше идр. 34, которые одновременно редактировали до четырех генов в клетках млекопитающих с помощью AsCas12a, и Swiat и др. 35, которые ввели четыре фрагмента ДНК в геном дрожжей с помощью FnCas12a. Насколько нам известно, большее количество одновременных геномных изменений с использованием системы Cas12a не было зарегистрировано, и максимальный предел целевых показателей на один массив для Cas12a еще не определен. Дальнейшие исследования с использованием одного crRNA массивов в сочетании с Cas12a включает в себя мультиплекс транскрипционной регуляции в широком диапазоне организмов33,36,37.
В представленном протоколе есть несколько важных шагов. Тщательно проектируйте все последовательности ДНК, которые участвуют в эксперименте по редактированию генома Cas12a, особенно в случае введения новых последовательностей ДНК. Определить функциональность новых последовательностей прокладки часть crRNA, например, с помощью эксперимента по редактированию генома singleplex, как описано Verwaal и др. 19 перед объединением их в единый массив crRNA. Следуйте рекомендациям по подготовке буферных решений преобразования, используемых в эксперименте по редактированию Cas12a для достижения хорошей эффективности преобразования дрожжей.
Есть некоторые дополнительные изменения техники. Рекомендуется использовать 1 мкг каждой донорской ДНК, линейную кассету экспрессии массива CRRNA в преобразовании, хотя использование более низкого количества ДНК также, как ожидается, приведет к удовлетворительной эффективности преобразования. Выполните тест преобразования, чтобы определить, можно ли использовать более низкие количества ДНК. Преобразование S. cerevisiae может быть осуществлено с использованием другого метода, чем тот, описанный в этом протоколе, например протокол, описанный Gietz et al. (2007) 38. Направляющий получатель РНК плазмид pRN1120 подходит для выражения одного CRRNA и одногоcrRNA массива различных вариантов Cas12a (например, от Acidaminococcus spp. BV3L6 или Francisella novicida U112), а также для выражения sgRNA в сочетании с Cas919. ДНК донора не должна ограничиваться каротиноидными генными экспрессионными кассетами и фланговыми участками, нацеленными на ДНК донора на описанные участки INT1, INT2 и INT3 в геномной ДНК. Любая ДНК, интересующаяся, может быть введена, в мультиплексном порядке, в геномную ДНК хозяина по принципам проектирования, описанным в этом протоколе, или же донорская ДНК может быть использована для удаления ДНК из генома хозяина. Модульная структура одного массива crRNA облегчает легкую регулировку прокладки и прямых повторяющихся последовательностей. Модификация последовательностей прокладки позволяет изменить предполагаемый интеграционный локус, который может быть разработан одним из инструментов для идентификации геномного целевого объекта, например, программного обеспечения GuideScan 1.039. Вместо использования больших фланговых последовательностей, содержащих последовательности разъемов, 50-bp фланговой области может быть включено в последовательности ДНК донора путем включения этих 50-bp фланговых последовательностей области в грунтовки, используемые в ПЦР. При этом всего для успешного эксперимента по редактированию генома мультиплекса требуется всего три вместо девяти фрагментов ДНК донора.
Таким образом, этот протокол предусматривает пошаговые указания для выполнения редактирования генома мультиплекса в S. cerevisiae с использованием Cas12a в сочетании с единым подходом массива crRNA. Протокол был продемонстрирован путем редактирования генома мультиплекса с использованием 9 фрагментов ДНК донора и кодирования одного массива CRRNA для трех гРНК. Мы показываем высокие общие частоты редактирования между 50% и 94% для трех конструкций деформации сообщили здесь. В заключение, уникальной особенностью Cas12a является возможность обработки одного массива CRRNA в отдельные CRRNA в клетке, что делает Cas12a отличным инструментом для редактирования мультиплексного генома и разработки транскрипционных модулей регулирования, ориентированных на несколько выражение кассеты на одном ходу. В конце концов, три штамма были получены производства каротиноидов на разном уровне и цвета в оттенках между желтым и оранжевым. С этими штаммами и дикого типа штамма, мы показали, как акустические жидкие обработчик может быть использован прямо, чтобы дрожжи пиксель искусства - это в честь Розалинд Франклин, который способствовал открытию структуры ДНК 65 лет назад ее знаменитой фотографии 5123 " /c1.

Ферменты CRISPR/Cas, несомненно, произвели революцию в молекулярной биологии и были широко приняты в качестве инструментов для инженерных геномов со скоростью, которая ранее была неосуществимой1. О первой модификации генома Saccharomyces cerevisiae по системе редактирования генома CRISPR/Cas9 сообщили DiCarlo et al. 2, демонстрируя успешное выбивание генов и делая мутации точек используя извне введенные oligonucleotides. Дальнейшие дрожжи CRISPR инструментарий события включены: транскрипционное регулирование путем слияния каталитически неактивных мертвых Cas9 (dCas9) с транскрипционными доменами эффектора, чтобы активация и заглушить транскрипции3, применение для обоих Редактирование генома и регулятивные функции для метаболического пути инженерии путем одновременной активации, репрессии и удаление4, удаление крупных фрагментов из генома S. cerevisiae 5, и многохромные слияния6 .
Системы редактирования генома CRISPR/Cas находят свое происхождение в адаптивной иммунной системе бактерий и археев, и эти системы были адаптированы молекулярными биологами для редактирования генома. Их функциональность основана на кластерных регулярно межпространственных коротких palindromic повторах (CRISPR) областях ДНК, кодирующих РНК, ответственных за распознавание чужеродной ДНК или РНК и связанных с CRISPR генов (Cas), который кодирует РНК-руководствось эндонуклизы1,7,8,9. На основе недавнего анализа генома систем CRISPR/Cas было предложено разделить системы CRISPR/Cas на два класса, пять типов и 16 подтипов10. Эти два класса отличаются на основе организации комплексов-эффекторов, участвующих в расщеплении целей. Как правило, системы CRISPR/Cas с многофункциональной организацией классифицируются как комплексы-эффекторы одного подразделения, в то время как комплексы одного субниунита относятся к классу 210,11. В этой статье мы исследуем класс 2 типа V Cas12a, ранее именовавшийся Cpf110,12, который является альтернативой классу 2 типа II Cas9. Хотя Cas9 хорошо характеризуется и широко используется в исследованиях, Cas12a предлагает дополнительные функции12. Во-первых, Cas12a образует комплекс с CRISPR РНК (crRNA) от 42 до 44 нуклеотидов, не требуя дополнительной трансактивации CRISPR РНК (тракрРНКа). Таким образом, более короткая направляющий РНК может быть использован в редактировании генома с помощью систем CRISPR/Cas12a по сравнению с CRISPR/Cas9. Во-вторых, уникальная эндонуклеаза и эндорибонуклизная деятельность Cas12a позволяет созревания его предварительноcrA13. Это действие RNase позволяет кодировать несколько CRRNA на одном массиве CRISPR crRNA, в то время как Cas9 требует отдельного выражения каждой так называемой однонаправной РНК (sgRNA) или альтернативно, например, выражения дополнительного эндонуклизии ( например, Csy4) в сочетании с мотивами распознавания для Csy4, окружающих каждый sgRNA14,15. В-третьих, Cas12a целевой сайт признания требует протосказер смежных мотив (PAM) в 5 'конец от цели и расщелин после no 18 / 23 позиции от его PAM в результате расщепляется ДНК с липкими концами, в то время как Cas9 требует PAM расположен на 3 'конец от цель и расщелин после -3 позиции создания тупых разрезов конца днк12. В-четвертых, консенсус нуклеотидной последовательности PAM отличается между Cas12a ((T)TTV) и Cas9 (NGG), что делает Cas12a перспективным кандидатом для ориентации T-богатых промоутер и терминатор последовательности16. Наконец, недавнее исследование сообщило больше целевой специфичности для Cas12a, чем для родного Cas917.
Мы представляем протокол для использования системы CRISPR/Cas12a для редактирования генома S. cerevisiae с особым акцентом на внедрение нескольких кассет экспрессии ДНК в независимые геномные локи одновременно (редактирование генома мультиплекса) с использованием единый массив CRRNA. Ключевые этапы протокола изображены на рисунке 1. В качестве доказательства концепции, система CRISPR/Cas12a была применена для введения трех экспресс-кассет в геном S. cerevisiae, которые позволяют производство каротина18, как схематично показано на рисунке 2. Производство каротина влияет на фенотип S. cerevisiae: т.е.при успешном введении всех трех гетерологических генов, необходимых для биосинтеза каротиноидов, белые клетки S. cerevisiae желтеют или оранжевые, в зависимости от силы экспрессии промоутера каждого гена. Благодаря простому визуальному считыванию этого пути, он был введен для разработки передовых систем и методов редактирования генома на основе CRISPR19,20. В этой работе, экспрессионные кассеты, кодируя каротиноидные гены crtE, crtYB и crtI были построены с использованием клонирования Золотые ворота (GGC) подход21 с гетерологическими промоутеров и гомологичных терминаторов используется для привода экспрессии генов. Кассеты выражения окружены уникальными 50-базовыми парами (bp) последовательностями, называемыми разъемами, которые позволяют сборку in vivo с интеграционными фланговыми последовательностями ДНК (фланговые области) с теми же последовательностями 50 bp и последующей интеграцией в геномную ДНК дрожжей в положении, определяемом фланговыми областями. С помощью различных сильных промоутер, штаммы с различными уровнями производства каротиноидов были получены в результате изменения цвета клеток. Эти штаммы - вдохновленный "Дрожжи Арт Проект"22 - были использованы в пятнистость установки с акустической жидкости обработчик для создания 4-цветной высокого разрешения "дрожжевой фотографии" Розалинд Франклин. Франклин (1920-1958) была английский химик и рентгеновский кристаллограф хорошо известен своим вкладом в открытие структуры ДНК фото 5123,24,25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals specific for the protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td style="width:175px;">Selection of E. coli transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">BsaI-HF (20 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R353L</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td style="width:175px;">Transfromation of 
			S. cerevisiae (carrier DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">dNTPs</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethanol absolute for analysis</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethylenediamine-tetraacetic acid</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Histodenz</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D2158&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Yeast pixel art</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100993</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nancy-520 DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>1494</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NEB10 competent E. coli cells</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>C3019H</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nourseothricin</td>
			<td style="width:144px;">Jena Bioscience</td>
			<td>AB102</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Phusion buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Polyethylene glycol 4000</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>7490</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:156px;">Purple loading dye</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td style="width:175px;">Purification of plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">RNase coctail enzyme mix</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>46300-018</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA Ligase (1 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>1705218</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit</td>
			<td style="width:144px;">Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td style="width:175px;">Purification of PCR products and linearized pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Xhol</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Zymolyase 50 mg/ml (5 units/&#181;L)</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1006</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:156px;">Zymolyase storage buffer</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1004-B</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals of general use</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">2*Peptone-Yeast extract (PY) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">2*PY medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Demineralized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">ELFO buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">MQ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Physiological salt solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">YEPD (2% glucose) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microplate 96 wells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 0.5 - 10 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 10 - 200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Pipette tips 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Shake flasks (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Sterile filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Centrifuge (Falcon tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Echo 525 acoustic liquid handler</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">NanoDrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Set for eletrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Table centrifuge (Eppendorfs tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCSN067</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101748</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pRN1120</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101750</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">S. cerevisiae strain 
			CEN.PK113-7D</td>
			<td style="width:144px;">EUROSCARF collection</td>
			<td></td>
			<td>http://www.euroscarf.de</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art

Высокая эффективность, простота использования и универсальность кластерных регулярно межпространственных коротких palindromic повторов / CRISPR-ассоциированных белков 9 (CRISPR/Cas9) система способствовала передовой генетической модификации Saccharomyces cerevisiae, модель организмит и рабочая лошадка в промышленной биотехнологии. CRISPR-связанный белок 12a (Cas12a), рнк-направленный эндонуклиз с функциями, отличающимися от Cas9, применяется в этой работе, что еще больше расширяет молекулярный инструментарий для целей редактирования генома. Преимущество системы CRISPR/Cas12a заключается в том, что она может быть использована в редактировании генома мультиплекса с несколькими направляющими РНК, выраженными из одного транскрипционного блока (одиночного массива КРИСП РНК (CRRNA). Мы представляем протокол для мультиплексной интеграции нескольких гетерологических генов в независимые локусы генома S. cerevisiae с помощью системы CRISPR/Cas12a с несколькими CRRN, выраженными из одной конструкции массива crRNA. Предлагаемый метод использует способность S. cerevisiae выполнять in vivo рекомбинацию фрагментов ДНК для сборки одного массива CRRNA в плазмид, который может быть использован для выбора трансформаторов, а также сборки донорской ДНК последовательности, которые интегрируются в геном в намеченных положениях. Cas12a предварительно выражена составно, облегчая расщепление генома S. cerevisiae в предполагаемых позициях при экспрессии одного массива crRNA. Протокол включает в себя проектирование и строительство единого массива CRRNA и кассеты экспрессии донорской ДНК, а также использует интеграционный подход, использующий уникальные 50-bp ДНК-разъемы последовательностей и отдельные интеграционные фланговые последовательности ДНК, что упрощает экспериментальный дизайн путем стандартизации и модульизации и расширяет спектр применений. Наконец, мы демонстрируем простой метод для создания дрожжевого пикселя искусства с акустической жидкости обработчик с использованием разного цвета каротиноидов производства дрожжевых штаммов, которые были построены.

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

Система CRISPR/Cas12a в сочетании с единым массивом crRNA позволяет эффективно редактировать мультиплекс геномs S. cerevisiae при нескольких локусовах одновременно. Это продемонстрировано путем построения каротиноидов производства штаммов дрожжей, которые впоследствии используются для создания дрожжевого пикселя искусства.

CRISPR/Cas12a Multiplex Геном Редактирование Saccharomyces cerevisiae и создание дрожжевого искусства пикселей

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Этот протокол демонстрирует новый метод редактирования мультиплексного генома Saccharomyces cerevisiae путем введения нескольких экспрессионных кассет на разных локусах в один шаг преобразования. Такой подход к свободной плазмидной сборке для выражения единого массива crRNA приводит к быстрому, эффективному и гибкому протоколу редактирования генома. Мы будем инженер диких клеток дрожжей типа, для производства каротиноидов путем введения свободных гетерологических генов на свободных геномных локусов.Единый массив crRNA состоит из свободных индивидуальных crRNAs, выраженных из РНК полимеразы бесплатно промоутер. Cas12a обрабатывает в vivo массив crRNA в отдельные CRRNA. CRRNAs направляет Cas12a к локусу цели на геномной ДНК, где Cas12a вводит двойные разрывы нитей.Снижение фрагментов ДНК рекомбинации для рекомбинации in vivo и интеграции в геномную ДНК. Демонстрацией протокола будет Клаудия Тюркот, аспирантка. Джеффри ван Вейк, научный сотрудник.И Бренда Вонк, старший научный сотрудник нашей лаборатории. После получения единого массива crRNA для экспериментов по редактированию генома мультиплекса синтетической ДНК, подготовьте смесь усиления ПЦР и загрузите массив в термоциклер для усиления. Для анализа продуктов ПЦР с помощью электрофорез, запустить образцы на 0,8%агарозный гель при 5 В/см в течение 40 минут.Загрузите лестницу ДНК с фрагментами ДНК, начиная от 100 10000 базовых пар Затем очистите продукты ПЦР с помощью комплекта очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя. Для преобразования дрожжей, начните с предварительного культивирования диких дрожжей типа в 100 мл колбы, содержащей 20 мл дрожжевого экстракта пептон dextrose или YEPD среды. Для ночной инкубации, при 30 градусах по Цельсию, и 250 вращений в минуту На следующее утро, привить 20 мл свежей среды YEPD с рассчитанным объемом ночных до культуры дрожжей.Поместите культуру в трясущимся инкубатором до тех пор, пока не будет достигнута оптическая плотность 1,0, измеряемая на 600 нанометров. Урожай дрожжевых клеток путем центрифугации. Вымойте гранулы дрожжевой клетки в 20 мл комнатной температуры деминерализованной воды, а затем дополнительную центрифугу.Повторно посовестите гранулы в 100 микролитров раствора литиевого ацетата Tris-EDTA и перенесите дрожжи в микроцентрифугную трубку. Смешайте пять микролитров одноклеточной ДНК носителя и один микрограмм плазмидного pCSN067 с подвеской дрожжевых клеток. Затем смешайте с образцом 600 микролитров полиэтиленгликоль LiAc-TE.Инкубировать дрожжевые клетки и плазмид в течение 30 минут при температуре 30 градусов по Цельсию и 450 prm в тепловой блок столешного верха. В конце инкубации смешайте 70 мл диметилсуфсида с раствором преобразования. Тепло удар смеси в течение 15 минут в 42 градусов по Цельсию водяной бане.Перенесите смесь в круглую нижнюю трубку 15 мл. Добавьте 10 мл YEPD в трубку для ночной инкубации при 30 градусах по Цельсию и 250 об/мин. На следующее утро, собирать преобразованные клетки центрифугации, и аспирировать все, кроме окончательного 200 микролитров супернатанта.Resuspend преобразованных дрожжевых клеток гранулы в оставшихся supernatant. Плита 150 микролитров трансформационного смеси и 150 микролитров 20-времени разбавления оставшихся 50 микролитров трансформационной смеси в YEPD, на агарных пластинах YEPD, дополненных 0,2 грамма на литр G418. После 48 до 72 часов при 30 градусах по Цельсию, выберите один трансформант для повторной полосы на новой пластине YEPD агар дополнен 0,2 г/л G418.Для второй трансформации, расти культуры оптической плотности на 600 нанометров 1,0, как только что продемонстрировали. И добавьте 20 микролитров клеток в микроцентрифугную трубку. После центрифугации, повторно поместить клеточные гранулы в 100 микролитров раствора LiAc-TE, и добавить ssDNA.В отдельной трубке объединить один микрограмм одного массива crRNA, один микрограмм линейной плазмиды реципиента для массива crRNA, по одному микрограмму ДНК каждого донора и по одному микрограмму каждой фланговой области. Затем перенесите смесь ДНК в трубку компетентных дрожжевых клеток и завершите вторую трансформацию, как это было продемонстрировано при первой трансформации. На следующее утро, собирать клетки центрифугации и повторно гранулы в небольшой aliquot супернатанта.Затем пластина 150 микролитров преобразования смеси, и 150 микролитров 20 разбавления преобразования смеси в yepD среды, на YEPD агар пластины дополнены 0,2 г / л G418, и 0,2 г / л nourseothricin После 48 до 72 часов, при 30 градусах по Цельсию, выбрать один цветной трансформант для повторной полосы на новой пластине YEPD для получения одного цвета колоний. Чтобы определить эффективность редактирования генома, подсчитайте количество цветных и белых колоний на пластинах преобразования и разделите количество цветных колоний на общее количество колоний. Для создания дрожжей пиксель искусства, привить отдельные 500 мл встряхнуть колбы, содержащие 100 мл среды YEPD с тремя разноцветными каротиноида производства штаммов S.cerevisiae, и дикий тип CEN.Штамм PK113-7D. Инкубировать культур ночь на 30 градусов по Цельсию с тряской на 250 об / мин. Передача 0,5 мл каждой ночной культуры в отдельные трубки, содержащие 0,5 мл стерильной, неионной плотности градиента среды на трубку, и кратко смешивать решения вихрем.Передача клеточных суспензий в отдельные, квалифицированные резервуары 2 на 3 скважины. Используйте csv файл с настройками калибровки жидкости 6RES_AQ_GPSA2 на акустическом инструменте обработчика жидкости, чтобы обнаружить 25 нанолитров каждого штамма S.cerevisiae от соответствующей квалифицированной пластины источника резервуара на микроплюйте 6144, содержащей 50 мл агара YEPD. Когда все скважины были замечены, инкубировать микроплюрат при 30 дегресс по Цельсию в течение 48 часов.Чтобы усилить цвета штаммов, хранить агар пластин при 4 градусах по Цельсию, по крайней мере 72 часов. На тарелке появилась фотография Розалинд Франклин. Как попродемонстрировано, промоутер, открытый читальный каркас, терминатор и две смежные последовательности разъемов 50 bp могут быть собраны в кассету выражения с помощью реакции клонирования Золотых Ворот и проверены ПЦР.После усиления единого массива CRRNA ПЦР плазмида получателя для одного массива crRNA линейно подтверждается электрофорезом. Эффективность редактирования мультиплексного генома может быть рассчитана по проценту цветных колоний после преобразования, а также по результатам ПЦР-анализов, которые подтверждают интеграцию донорской ДНК в предполагаемых геномных местах ДНК. Например, начиная с черно-белой картины Розалинд Франклин, четыре цветные изображения и пятнистость список был создан, который затем был использован для выявления четырех различных штаммов дрожжей на агар микроплюе через акустический обработчик жидкости, как попродемонстрировано, в результате чего с высоким разрешением дрожжевой живописи ученого.Для этой трансформации используйте свежеприготовленные растворы и фрагменты ДНК высокого качества. Этот метод также может быть применен для мультиплексного введения определенных удалений и точечных мутаций в геномную ДНК. Кроме того, могут быть проведены эксперименты по регулированию CRISPR.Этот метод может быть изменен, чтобы ввести больше, чем бесплатные CRRNAs в массиве, чтобы увеличить количество одновременных изменений, которые могут быть сделаны.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Высокая профилирования микроРНК Производительность: Оптимизированная Мультиплекс QRT-PCR на шкале Nanoliter на Fluidigm Динамический МФХБ ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Плазменные литографии поверхности паттернов для создания сотовых сетей

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Lensfree On-чип томографический микроскопии Используя Multi-угол освещения и Pixel супер-разрешение

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Непрерывная высокого разрешения Микроскопическое исследование репликативного старения у почкующихся дрожжей

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Методы эволюции Robust пентозы брожения дрожжей для биоконверсии лигноцеллюлозы к этанолу

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Создание сердечной ткани, обеспечивающей механическую интеграцию сфероидов с использованием 3D-биопреобразования

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Эффективное создание и редактирование фидер свободный IPSCs от человеческих клеток поджелудочной железы, с использованием системы ТРИФОСФАТЫ Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Оптимизация мультиплекс на базе РНК выражение Assay, с использованием архивных материалов рака молочной железы

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Микроинъекции Западной кукуруза Rootworm, под эгидой содействие, эмбрионы для преобразования микрофлорой, или изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Чистый метод, основанный на плесень, создания эшафот бесплатный трехмерный сердечной ткани

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...