Name: crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
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Este proyecto recibió financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención no 686070 (DD-DeCaf) y 764591 (SynCrop), y del programa de investigación Building Blocks of Life con el número de proyecto 737.016.005 por organización neerlandesa de investigación científica (NWO). T.E.G. contó con el apoyo de la Royal Society (concesión UF160357) y BrisSynBio, un Centro de Investigación en Biología Sintética BBSRC/EPSRC (subvención BB/L01386X/1). Agradecemos a Zi Di y Jeffrey van Wijk por su contribución a los experimentos de detección de levadura para crear el arte de píxeles de levadura.

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Los autores declaran que hay un conflicto de intereses. Los autores han presentado una IP relacionada con los métodos presentados.

El protocolo proporcionado describe la edición del genoma multiplex de S. cerevisiae utilizando Cas12a de la bacteria Lachnospiraceae ND2006 en combinación con una sola matriz de CRRNA y ADN de donante. El diseño de la matriz de crRNA única y el ADN de los donantes se explica en detalle. A diferencia del bien establecido sistema CRISPR/Cas9, el CRISPR/Cas12a tiene la capacidad adicional única de procesar múltiples crRNAs expresados desde una única matriz de crRNA13,33. Debido a esta característica, la edición simultánea de varios destinos es más fácil de configurar y se puede lograr en una sola transformación. Este enfoque de matriz de crRNA único fue demostrado antes por Zetsche et al. 34 que editaron simultáneamente hasta cuatro genes en células de mamíferos usando AsCas12a, y por Swiat et al. 35 que introdujeron cuatro fragmentos de ADN en un genoma de levadura usando FnCas12a. Hasta nuestro punto, no se ha informado de un mayor número de modificaciones genómicas simultáneas utilizando un sistema Cas12a y el límite máximo de objetivos por matriz única para Cas12a está aún por determinar. Investigaciones adicionales utilizando matrices de crRNA individuales en combinación con Cas12a incluye regulación transcripcional multiplex en una amplia gama de organismos33,36,37.
Hay algunos pasos críticos en el protocolo presentado. Diseñe cuidadosamente todas las secuencias de ADN que intervienen en el experimento de edición del genoma Cas12a, especialmente en el caso de que se introduzcan secuencias de ADN novedosas. Determinar la funcionalidad de las nuevas secuencias espaciadoras que forman parte de un crRNA, por ejemplo mediante un experimento de edición del genoma de un solo plex como se describe en Verwaal et al. 19 antes de combinarlos en una sola matriz crRNA. Siga las recomendaciones para la preparación de soluciones de búfer de transformación utilizadas en el experimento de edición Cas12a para lograr una buena eficiencia de transformación de la levadura.
Hay algunas modificaciones opcionales de la técnica. Se recomienda utilizar 1 g de ADN de cada donante, pRN1120 linealizado o casete de expresión de matriz de crRNA único en la transformación, aunque también se espera que el uso de una cantidad de ADN menor resulte en una eficiencia de transformación satisfactoria. Realice una transformación de prueba para determinar si se pueden utilizar cantidades de ADN más bajas. La transformación de S. cerevisiae podría realizarse utilizando un método diferente al descrito en este protocolo, por ejemplo, el protocolo descrito por Gietz et al. (2007) 38. El plásmido receptor de ARN guía pRN1120 es adecuado para la expresión deun solo crRNA y una matriz de crRNA único de diferentes variantes Cas12a (por ejemplo, , de Acidaminococcus spp. BV3L6 o Francisella novicida U112) así como para la expresión de sgRNA en combinación con Cas919. No es necesario limitar el ADN de los donantes a los casetes de expresión génica carotenoides y a las regiones flanqueantes que dirigen el ADN de los donantes a los sitios INT1, INT2 e INT3 descritos en el ADN genómico. Cualquier ADN de interés puede introducirse, de manera multiplexado, en el ADN genómico del huésped mediante los principios de diseño descritos en este protocolo, o alternativamente el ADN del donante se puede utilizar para eliminar el ADN de un genoma del huésped. La estructura modular de la matriz de crRNA simple facilita el ajuste de las secuencias de repetición directa y espaciadora. La modificación de las secuencias de espaciadores permite un cambio del locus de integración previsto que puede ser diseñado por una de las herramientas para la identificación de un sitio de destino genómico, por ejemplo, el software GuideScan 1.039. En lugar de utilizar grandes secuencias de flanqueo que contienen secuencias de conectores, 50-bp de la región de flanqueo se pueden incluir en las secuencias de ADN del donante mediante la incorporación de estas secuencias de región de flanqueo de 50 bp en las imprimaciones utilizadas en el PCR. En este caso, en total sólo se requieren tres en lugar de nueve fragmentos de ADN de donantes para un experimento exitoso de edición del genoma multiplex.
En resumen, este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para realizar la edición del genoma multiplex en S. cerevisiae utilizando Cas12a en combinación con un enfoque de matriz crRNA único. El protocolo fue demostrado mediante la edición del genoma multiplex utilizando 9 fragmentos de ADN de donantes y codificación de matriz de crRNA única para tres gRNAs. Mostramos altas frecuencias de edición general entre 50% y 94% para los tres diseños de tensión reportados aquí. Concluyendo, la característica única de Cas12a es la capacidad de procesar una sola matriz crRNA en crRNA individuales en una celda, lo que hace de Cas12a una excelente herramienta para permitir la edición del genoma multiplex y desarrollar módulos de regulación transcripcional dirigidos a múltiples expresión casetes de una sola vez. Al final, se obtuvieron tres cepas produciendo carotenoides a un nivel diferente y colores en tonos entre amarillo y naranja. Con esas cepas y una cepa de tipo salvaje, mostramos cómo un manipulador de líquido acústico se puede utilizar directamente para hacer arte de píxeles de levadura - esto en honor de Rosalind Franklin que contribuyó al descubrimiento de la estructura de ADN hace 65 años por su famosa foto 5123< /c1>.

Las enzimas CRISPR/Cas han revolucionado indudablemente la biología molecular y han sido ampliamente adoptadas como herramientas para los genomas de ingeniería a una velocidad que antes era inviable1. La primera modificación de un genoma de Saccharomyces cerevisiae por el sistema de edición del genoma CRISPR/Cas9 fue reportada por DiCarlo et al. 2, demostrando el éxito del knock-out genético y la fabricación de mutaciones puntuales utilizando oligonucleótidos introducidos externamente. Otros desarrollos de la caja de herramientas CRISPR de levadura incluidos: regulación transcripcional por fusión de Cas9 muerto catalíticamente inactivo (dCas9) con dominios efectores transcripcionales para permitir la activación y silenciamiento de la transcripción3, aplicación para ambos la edición del genoma y las funciones reguladoras para la ingeniería de vías metabólicas mediante activación simultánea, represión y eliminación4, eliminación de fragmentos grandes del genomade S. cerevisiae 5, y fusiones de cromosomas múltiples6 .
Los sistemas de edición del genoma CRISPR/Cas encuentran su origen en sistemas inmunes adaptativos de bacterias y arqueas y estos sistemas han sido adaptados por biólogos moleculares para la edición del genoma. Su funcionalidad se basa en las regiones de ADN agrupadas regularmente interespaciales (CRISPR) que codifican el ARN responsable del reconocimiento del ADN o ARN extraño y los genes asociados a CRISPR (Cas) que codifican los genes guiados por ARN endonucleasas1,7,8,9. Sobre la base del reciente análisis del genoma de los sistemas CRISPR/Cas se propuso dividir los sistemas CRISPR/Cas en dos clases, cinco tipos y 16 subtipos10. Las dos clases se distinguen en función de la organización de los complejos de efectos implicados en el escote objetivo. Normalmente, los sistemas CRISPR/Cas con una organización multisubunidad se clasifican como clase 1, mientras que los complejos de efector de subunidad única pertenecen a la clase 210,11. En este artículo, exploramos la clase 2 tipo V Cas12a, anteriormente llamada Cpf110,12, que es una alternativa a la clase 2 tipo II Cas9. Aunque Cas9 está bien caracterizado y ampliamente utilizado en la investigación, Cas12a ofrece características adicionales12. En primer lugar, Cas12a forma un complejo con ARN CRISPR (crRNA) de 42 a 44 nucleótidos sin necesidad de un ARN CRISPR activador adicional (tracrRNA). Por lo tanto, se puede utilizar un ARN guía más corto en la edición del genoma con sistemas CRISPR/Cas12a en comparación con CRISPR/Cas9. En segundo lugar, la actividad única de endonucleasa y endoribonucleasa de Cas12a permite la maduración de su pre-crRNA13. Esta actividad De RNase permite la codificación de múltiples crRNAs en una sola matriz crRNA CRISPR, mientras que Cas9 requiere la expresión separada de cada ARN de guía único (sgRNA) o, alternativamente, por ejemplo, la expresión de una endonucleasa adicional ( porejemplo, Csy4) en combinación con motivos de reconocimiento para Csy4 que rodean cada sgRNA14,15. En tercer lugar, el reconocimiento del sitio objetivo Cas12a requiere un motivo adyacente protoespacial (PAM) en el extremo de 5' del objetivo y se corta después de la posición +18/+23 de su PAM, lo que resulta en ADN de hojalata con extremos pegajosos, mientras que Cas9 requiere un PAM situado en el extremo 3' del extremo 3' del extremo 3' del extremo 3' del extremo 3' del extremo 3' del extremo 3' del extremo 3' del extremo 3' del extremo 3' del extremo 3' del extremo 3' del extremo 3' objetivo y cortes después de la posición -3 creando cortes finales contundentes en el ADN12. En cuarto lugar, la secuencia de nucleótidos de consenso del PAM difiere entre Cas12a ((T)TTV) y Cas9 (NGG), lo que convierte a Cas12a en un candidato prometedor para apuntar a la secuencia16de promotores y terminadores ricos en T. Finalmente, un estudio reciente reportó una mayor especificidad de destino para Cas12a que para el Cas917nativo.
Presentamos un protocolo para utilizar el sistema CRISPR/Cas12a para la edición del genoma de S. cerevisiae con un enfoque particular en la introducción de múltiples casetes de expresión de ADN en loci genómicos independientes simultáneamente (edición del genoma multiplex) utilizando una sola matriz de crRNA. Los pasos clave del protocolo se describen en la Figura1. Como prueba de concepto, se aplicó el sistema CRISPR/Cas12a para la introducción de tres casetes de expresión en el genoma de S. cerevisiae que permiten la producción de caroteno18 como se muestra esquemáticamente en la Figura2. La producción de caroteno afecta al fenotipo de S. cerevisiae: esdecir, tras la introducción exitosa de los tres genes hetrólogos necesarios para la biosíntesis de carotenoides, las células blancas de S. cerevisiae se vuelven amarillas o anaranjadas, dependiendo de la fuerza de expresión del promotor de cada gen. Debido a la simple lectura visual de esta vía, se ha introducido para desarrollar sistemas avanzados basados en CRISPR y métodos para la edición del genoma19,20. En este trabajo, los casetes de expresión que codifican los genes carotenoides crtE, crtYB y crtI se han construido utilizando un enfoque de clonación Golden Gate (GGC)21 con promotores heterólogos y terminadores homólogos para impulsar la expresión de los genes. Los casetes de expresión están rodeados por secuencias únicas de pares de 50 bases (bp), llamadas conectores, que permiten el montaje in vivo con secuencias de ADN de flanco de integración (regiones de flanqueo) con las mismas secuencias de 50 bp, y la posterior integración en el ADN genómico de la levadura en la posición determinada por las regiones flanqueantes. Mediante el uso de diferentes fortalezas promotoras, se obtuvieron cepas con diferentes niveles de producción de carotenoides dando como resultado la variación en el color de las células. Estas cepas - inspiradas en el "Proyecto de Arte de levadura"22 - se utilizaron en una configuración de detección con un manipulador de líquido acústico para crear una "fotografía de levadura" de alta resolución de 4 colores de Rosalind Franklin. Franklin (1920-1958) fue una química inglesa y cristalógrafa de rayos X muy conocida por su contribución al descubrimiento de la estructura de ADN por Photo 5123,24,25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals specific for the protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td style="width:175px;">Selection of E. coli transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">BsaI-HF (20 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R353L</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td style="width:175px;">Transfromation of 
			S. cerevisiae (carrier DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">dNTPs</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethanol absolute for analysis</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethylenediamine-tetraacetic acid</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Histodenz</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D2158&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Yeast pixel art</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100993</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nancy-520 DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>1494</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NEB10 competent E. coli cells</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>C3019H</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nourseothricin</td>
			<td style="width:144px;">Jena Bioscience</td>
			<td>AB102</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Phusion buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Polyethylene glycol 4000</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>7490</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:156px;">Purple loading dye</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td style="width:175px;">Purification of plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">RNase coctail enzyme mix</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>46300-018</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA Ligase (1 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>1705218</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit</td>
			<td style="width:144px;">Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td style="width:175px;">Purification of PCR products and linearized pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Xhol</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Zymolyase 50 mg/ml (5 units/&#181;L)</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1006</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:156px;">Zymolyase storage buffer</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1004-B</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals of general use</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">2*Peptone-Yeast extract (PY) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">2*PY medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Demineralized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">ELFO buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">MQ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Physiological salt solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">YEPD (2% glucose) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microplate 96 wells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 0.5 - 10 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 10 - 200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Pipette tips 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Shake flasks (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Sterile filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Centrifuge (Falcon tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Echo 525 acoustic liquid handler</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">NanoDrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Set for eletrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Table centrifuge (Eppendorfs tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCSN067</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101748</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pRN1120</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101750</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">S. cerevisiae strain 
			CEN.PK113-7D</td>
			<td style="width:144px;">EUROSCARF collection</td>
			<td></td>
			<td>http://www.euroscarf.de</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art

Alta eficiencia, facilidad de uso y versatilidad del sistema agrupado regularmente interespacilado de repeticiones palindrómicas cortas/proteína asociada a CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) ha facilitado la modificación genética avanzada de Saccharomyces cerevisiae,un modelo organismo y caballo de batalla en biotecnología industrial. En este trabajo se aplica la proteína 12a asociada a CRISPR (Cas12a), una endonucleasa guiada por ARN con características distinguibles de Cas9, extendiendo aún más la caja de herramientas molecular es para fines de edición del genoma. Una ventaja del sistema CRISPR/Cas12a es que se puede utilizar en la edición del genoma multiplex con múltiples ARN guía expresados a partir de una sola unidad transcripcional (matriz de ARN CRISPR único (crRNA). Presentamos un protocolo para la integración múltiple de múltiples genes hetólogos en loci independientes del genoma de S. cerevisiae utilizando el sistema CRISPR/Cas12a con múltiples crRNAs expresados a partir de una sola construcción de matriz crRNA. El método propuesto aprovecha la capacidad de S. cerevisiae para realizar la recombinación in vivo de fragmentos de ADN para ensamblar la matriz de crRNA única en un plásmido que se puede utilizar para la selección transformadora, así como el montaje de ADN de donante secuencias que se integran en el genoma en las posiciones previstas. Cas12a se expresa de forma pre-expresada, facilitando el escisión del genoma de S. cerevisiae en las posiciones previstas tras la expresión de la matriz de crRNA única. El protocolo incluye el diseño y la construcción de una única matriz de crRNA y casetes de expresión de ADN de donantes, y aprovecha un enfoque de integración que hace uso de secuencias únicas de conectores de ADN de 50 bp y secuencias de ADN de flanco de integración separadas, lo que simplifica diseño experimental a través de la estandarización y modularización y amplía la gama de aplicaciones. Por último, demostramos una técnica sencilla para crear arte de píxeles de levadura con un controlador de líquido acústico que utiliza cepas de levadura de producción de carotenoides de diferentes colores que se construyeron.

El protocolo para la edición del genoma multiplex utilizando CRISRP/Cas12a se demostró mediante la construcción de tres cepas de carotenoides que producen S. cerevisiae que expresan los genes crtE, crtYB y crtI utilizando promotores heterólogos de alta, media y baja resistencia: cepa 1, 2 y, 3 respectivamente (Tablacomplementaria 3). La construcción de estas cepas requirió la generación de tres casetes de expresión de ADN de donantes y seis regiones flanqueantes por cepa para apuntar a tres loci diferentes en el ADN genómico (mostrado en la Figura 2B). Como se describe en el presente documento, el promotor, el marco de lectura abierto, el terminador y dos secuencias de conectores contiguas de 50 bps se ensamblaron en un casete de expresión a través de una reacción de clonación de Golden Gate y el montaje fue verificado por PCR (Figura3A). La matriz de crRNA única fue ordenada como un fragmento de ADN sintético y fue amplificada por PCR (Figura3B). El plásmido receptor para la matriz de crRNA única (plasmio pRN1120) se erigió con EcoRI-HF y XhoI y la linealización se confirmó mediante electroforesis (Figura3C). El diseño y las secuencias de nucleótidos de los casetes de expresión de ADN de donantes introducidos y las regiones flanqueantes se muestran en la Tabla Suplementaria 3 yen la Tabla Suplementaria 4. La secuencia de casetes de expresión de matriz crRNA únicos se proporciona en la Tabla Suplementaria 1. La funcionalidad de los espaciadores incluidos en la matriz de crRNA única fue probada previamente por la edición del genoma de un solo plex con crRNAsindividuales 19.
La eficiencia de la edición del genoma utilizando Cas12a se evaluó en primer lugar en función del número de colonias de colores obtenidas después de la transformación (Tabla1, Figura 4). La eficiencia de edición de las tres cepas construidas varió del 50% al 94%. En particular, la introducción de casetes de expresión utilizados para generar la tensión 1 mostró la menor eficiencia de edición, posiblemente causada por la naturaleza del ADN del donante (esdecir, estos casetes de expresión codifican crtE, crtYB y crtI de tres promotores de alta resistencia). En segundo lugar, la PCR (Figura 5) confirmó la correcta integración de los tres casetes de expresión de ADN de los donantes en los loci previstos en el ADN genómico (Figura 5). Los imprimadores se diseñaron de tal manera que se obtuvieron productos de PCR cuando se produjo la correcta integración del ADN del donante en el locus previsto. Para cada experimento de transformación, se recogieron ocho colonias de la placa de transformación y se probaron (tenga en cuenta que solo tres se presentan en la Figura5). En general, de las 8 colonias probadas por ADN de donante, se confirmó la correcta integración del ADN del donante crtE en el locus INT1, crtYB en el locus INT2 y crtI en el locus INT3 en >90% de los transformadores. Estos resultados demuestran que el sistema CRISPR/Cas12a en combinación con una sola matriz crRNA permite la edición multiplexación eficiente del genoma de S. cerevisiae a múltiples loci simultáneamente.
Además, demostramos la creación de "arte de píxeles de levadura" utilizando las tres cepas de producción de carotenoides que fueron construidas junto con una cepa de tipo salvaje no coloreado. A partir de una imagen en blanco y negro de Rosalind Franklin (Figura6A), se creó una imagen de 4 colores (Figura6B) y una lista de manchas que luego se utilizó para detectar las cuatro cepas de levadura diferentes en una microplaca de agar usando un manipulador de líquidos acústicos, lo que resulta en una "pintura de levadura" de alta resolución de Rosalind Franklin (Figura6C,D,E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig1v5.jpg"> Figura 1 : Flujo de trabajo del protocolo para la edición del genoma multiplex CRISPR/Cas12a en S. cerevisiae. El flujo de trabajo incluye pasos cruciales del método presentado. Para obtener más información, consulte el Protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig2.jpg"> Figura 2 : Esquema de edición del genoma multiplex CRISPR/Cas12a utilizando una sola matriz crRNA. (A) La matriz de crRNA única se compone de tres unidades crRNAs en su forma madura, una repetición directa de 20 bp específica para LbCas12a (cuadrados grises) con una secuencia guía de 23 bp (diamantes de color). La expresión de la matriz crRNA está habilitada por el promotor SNR52 y el terminador SUP4. Transformación de S. cerevisiae con un pRN1120 linealizado y el casete de expresión de matriz de crRNA único que contiene homología con pRN1120 (rayas diagonales) permite la recombinación in vivo en un plásmido circular en células que pre-expresan LbCas12a. La matriz de crRNA única es procesada posteriormente por Cas12a. (B) Cas12a se dirige a los sitios de destino genómicos INT1, INT2 e INT3 previstos y crea roturas de doble cadena. En la mezcla de transformación, se incluyó el ADN de los donantes que consiste en regiones flanqueantes y el casete de expresión génica carotenoides. Los conjuntos de ADN de donantes se dirigió a un tramo de ADN en ADN genómico alrededor del INT1 (crtE), INT2 (crtYB) e INT3 (crtI) loci por recombinación in vivo debido a la presencia de secuencias de conectores homólogos de 50 bp, 5, A, B, C, D o E. P1–P3, diferentes promotores; T1–T3, diferentes terminadores. Esta cifra ha sido modificada de Verwaal et al. 201819. Construcciones genéticas mostradas utilizando símbolos visuales de biología sintética (SBOL)40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig3.jpg"> Figura 3 : PCR verificando los experimentos de edición del genoma. (A) Verificación de las reacciones de clonación de Golden Gate de los casetes de ADN de donantes ensamblados. Los resultados obtenidos están de acuerdo con las longitudes esperadas. (B) PCR de la matriz crRNA única. (C) Linealización del plásmido pRN1120. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig4.jpg"> Figura 4 : Placas de transformaciones de S. cerevisiae utilizando el enfoque de edición del genoma multiplex. (A) Cepa 1 que expresa crtE, crtYB y crtI de tres promotores fuertes (colonias de naranja oscura). (B) Cepa 2 que expresa crtE, crtYB y crtI de tres promotores de resistencia media (colonias naranjas). (C) Cepa 3 que expresa crtE, crtYB y crtI de tres promotores de baja resistencia (colonias amarillas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig5.jpg"> Figura 5 : PCR verificando la integración de los casetes de expresión de ADN del donante en los loci previstos dentro del ADN genómico. (A) Verificación de tres colonias de la cepa 1. (B) Verificación de tres colonias de la cepa 2. (C) Verificación de tres colonias de la cepa 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig6.jpg"> Figura 6 : Arte de píxeles de levadura de Rosalind Franklin. (A) Foto RGB en blanco y negro de 220 x 280 píxeles de Rosalind Franklin que se utilizó como plantilla. (B) Conversión por ordenador de la foto en blanco y negro de Rosalind Franklin en una lista de 4 colores de 64 x 96 píxeles. (C) Foto del arte de píxeles de levadura con 64 colonias de levadura de 96 x con una sección ampliada. (D) Foto de un manipulador de líquidos acústicos con dos placas completamente cultivadas. (E) Foto de una microplaca completamente cultivada con 64 colonias de levadura de 96. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Tensión 1</td>
			<td>Tensión 2</td>
			<td>Tensión 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colonias de colores</td>
			<td>16</td>
			<td>279</td>
			<td>220</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colonias blancas</td>
			<td>16</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colonias totales</td>
			<td>32</td>
			<td>297</td>
			<td>238</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eficiencia</td>
			<td>50%</td>
			<td>94%</td>
			<td>92%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Eficiencia de edición del enfoque de edición del genoma multiplex.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>secuencia de matriz crRNAa,b,c,d,e,f</td>
		</tr>
<tr>
<td>
CATGTTTGACAGCTTATCATCATCATATCCGGAGCTAGCATGCCCCCTCTCTAGAACTAGTAGATCCCCGCGGCAG TCTTTGAAAA GATAATGTATATGCTTTCACTCATATTATACAGAACTTGATGTTTTCTTTCATGTATATACAAGG TGATTACATGTACGTGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCA TTTTTTTCCCTACTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTTTTTTGT-AAACGCTGTAAAGTAT ATGTTTCGGCTCTCTCTCGAAACTTCCCCAGTAAAGATAAATGATCAATTTCTAAGTGTAGAT CTGGTGGGAGAGAAAGCTTATGAAATTTCTAAGTGTAGATGTGCCGTAC GCCGGAGCCGACGGAATTTCTAAGTGTAGATTGCCCCTCTTATACGATTATATTTT TTTTTTGTTTTTTATGTCTGGGGGGCCCGGTACCCAGCTTTTTTCCCTTTAGTGAGG GTTAATTCCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTTCCTGTGTG
</td>
		</tr>
<tr>
<td>a. Homología a pRN1120 (valiente). b. Promotor SNR52 (en cursiva). c. Secuencias de destino genómicas (subrayadas). d. Guía de repeticiones directas específicas para LbCas12a (en cursiva, negrita). e. Terminador SUP4 (en cursiva). f. Homología a pRN1120 (negrita).</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla Suplementaria 1: Matriz de crRNA única para LbCas12a que contiene homología con plásmido pRN1120.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>Nombre</td>
			<td>Secuenciaa</td>
			<td>Descripciónb</td>
			<td>Utilizado en el punto</td>
		</tr><tr><td>KC-101</td>
			<td>CATGTTTGACAGCTTATCATC</td>
			<td>Imprimación FW para amplificación de matriz de crRNA única</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-102</td>
			<td>CACACAGGAAACAGCTATGAC</td>
			<td>Imprimación RV para amplificación de una sola matriz crRNA</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-103</td>
			<td>AAGCGACTTCCAATCGCTTTGC</td>
			<td>Imprimación FW para amplificación del ADN del donante con conector 5</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-104</td>
			<td>AAAGCAAAGGAAGGAGAGAAC</td>
			<td>Imprimación RV para amplificación del ADN del donante con conector A</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-105</td>
			<td>CGGATCGATGTACACAACCG</td>
			<td>Imprimación FW para amplificación del ADN del donante con conector B</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-106</td>
			<td>CAACAGGAGGCGGATGGATATAC</td>
			<td>Imprimación RV para amplificación del ADN del donante con conector C</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-107</td>
			<td>AACGTTGTCCAGGTTTGTATCC</td>
			<td>Imprimación FW para amplificación del ADN del donante con conector D</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-108</td>
			<td>AGGTACAACAAGCACGACCG</td>
			<td>Imprimación RV para amplificación del ADN del donante con conector E</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-109</td>
			<td>CACTATAGCAATCTGGCTATATG</td>
			<td>Imprimación FW para amplificación de INT1 5' con conector 5</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-110</td>
			<td>
AAACGCCTGTGGGTGGTAC TGGATATGCAAAGCGATTGGAA GTCGCTTGACTCCTCTGCCGTC ATTCC</td>
			<td>Imprimación RV para amplificación de INT1 5' con conector 5</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-111</td>
			<td>
TTGCCCATCGAACGTACAAG TACTCCTCTGTCTCTCCTTCCTCCTTTT TGCTTTAAGCGTTGAAGTTCCTC TTTG</td>
			<td>Imprimación FW para amplificación de INT1 3' con conector A</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-112</td>
			<td>TGTCAACTGGAGAGCTATCG</td>
			<td>Imprimación RV para amplificación de INT1 3' con conector A</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-113</td>
			<td>AGAAGATTTCTCTCTCAATCTC</td>
			<td>Imprimación FW para amplificación de INT2 5' con conector B</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-114</td>
			<td>
TGCTAAGATTTGTGTGTGTT TGGGTGCAGTCGGTTGTACAT CGATCCGCCCTTATCAAGGATACC TGGTTG</td>
			<td>Imprimación RV para amplificación de INT2 5' con conector B</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-115</td>
			<td>
ACGCTTTCCGGCATCTTCCA GACCACAGTATATCCATCCGCCT CCTGTTGGGCGATTACACAAGCG GTGG</td>
			<td>Imprimación FW para amplificación de INT2 3' con conector C</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-116</td>
			<td>TCTCCTCTTCGATCGCGGG</td>
			<td>Imprimación RV para amplificación de INT2 3' con conector C</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-117</td>
			<td>GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTG</td>
			<td>Imprimación FW para amplificación de INT3 5' con conector D</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-118</td>
			<td>
GCGGAATATTGGCGGAACGG ACACACGTGGATACAAACCTG GACAACGTTTTCCAAGGAGGTG AAGAACG</td>
			<td>Imprimación RV para amplificación de INT3 5' con conector D</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-119</td>
			<td>
AAATAACCACAAACCTT CCCATATGCTCGGTCGTGCTTGTT GTACCTGATGGGACGTCAGCACT GTAC</td>
			<td>Imprimación FW para amplificación de INT3 3' con conector E</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-120</td>
			<td>GAGCTTACTCTATATTCATTC</td>
			<td>Imprimación RV para amplificación de INT3 3' con conector E</td>
			<td>4.4</td>
		</tr><tr><td>KC-121</td>
			<td>GTTACTAAACTGGAACTCCCCG</td>
			<td>Imprimación FW para la verificación de la integración de con5-crtE-conA a INT1 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-122</td>
			<td>CACTGCTAACTACGTTACTTC</td>
			<td>Imprimación FW para la verificación de la integración de con5-crtE-conA a INT1 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-123</td>
			<td>CACTGGAACTTGAGCTTGAG</td>
			<td>Imprimación FW para la verificación de la integración de conB-crtYB-conC a INT2 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-124</td>
			<td>GTCTCCAGCTGAATTGGTCC</td>
			<td>Imprimación FW para la verificación de la integración de conB-crtYB-conC a INT2 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-125</td>
			<td>CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC</td>
			<td>Imprimación FW para la verificación de la integración de conD-crtI-conE a INT3 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-126</td>
			<td>GATCGGTCAATTAGGTGAAG</td>
			<td>Imprimación FW para la verificación de la integración de conD-crtI-conE a INT3 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-127</td>
			<td>CCTTGTCCAAGTAGGTCC</td>
			<td>Imprimación RV para la verificación de la integración de con5-crtE-conA a INT1 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-128</td>
			<td>GCTGTCATGATCTGTGATAAC</td>
			<td>Imprimación RV para la verificación de la integración de con5-crtE-conA a INT1 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-129</td>
			<td>CTGGCAATGTTGACCAATTGC</td>
			<td>Imprimación RV para la verificación de la integración de conB-crtYB-conC a INT2 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-130</td>
			<td>CCAACGTGCCTTAAAGTCTG</td>
			<td>Imprimación RV para la verificación de la integración de conB-crtYB-conC a INT2 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-131</td>
			<td>CCTTACCTTCTGGAGCAGCAG</td>
			<td>Imprimación RV para la verificación de la integración de conD-crtI-conE a INT3 5'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-132</td>
			<td>CTGGTTACTTCCCTAAGACTG</td>
			<td>Imprimación RV para la verificación de la integración de conD-crtI-conE a INT3 3'</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>a. Las secuencias en negrita denotan secuencias de conectores. b. Los imprimadores delanteros y inversos se designan como FW y RV, respectivamente.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabla Suplementaria 2: Secuencias de imprimación.
<img alt="Supplementary Table 3" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable3.jpg"> Tabla Complementaria 3: Diseño de cepas construidas.
<img alt="Supplementary Table 4" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable4.jpg"> Tabla Suplementaria 4: Secuencias de casetes de expresión de ADN de donantes y regiones de descamación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/Suppl_Table_4.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

El sistema CRISPR/Cas12a en combinación con una sola matriz crRNA permite la edición multiplexación eficiente del genoma de S. cerevisiae a múltiples loci simultáneamente. Esto se demuestra mediante la construcción de carotenoides que producen cepas de levadura que posteriormente se utilizan para crear arte de píxeles de levadura.

CRISPR/Cas12a Multiplex Genoma Edición de Saccharomyces cerevisiae y la creación de Arte de píxeles de levadura

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Este protocolo demuestra un método novedoso para multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae mediante la introducción de varios casetes de expresión en diferentes loci en un solo paso de transformación. Este enfoque de ensamblaje de plásmido libre de clonación para expresar una sola matriz de crRNA, conduce a un protocolo de edición del genoma rápido, eficiente y flexible. Diseñaremos células de levadura de tipo salvaje, para producir carotenoides mediante la introducción de genes heterólogos libres en loci genómico libre.La matriz de crRNA única se compone de crRNAs individuales libres expresados desde el promotor libre de ARN polimerasa. Cas12a procesa in vivo la matriz crRNA en crRNA individuales. Los crRNAs guían a Cas12a a los loci objetivos en el ADN genómico donde Cas12a introduce roturas de doble hebra.Los fragmentos de ADN hacia abajo se recombinan para la recombinación in vivo y se integran en el ADN genómico. Demostrar el protocolo estará Klaudia Ciurkot, una estudiante de doctorado. Jeffery van Wijk, Científico Asociado.Y Brenda Vonk, científica asociada sénior de nuestro laboratorio. Después de obtener una sola matriz de crRNA para experimentos de edición del genoma multiplex de ADN sintético, prepare la mezcla de amplificación de PCR y cargue la matriz en el termociclador para la amplificación. Para analizar los productos de PCR por electroforesis, ejecute las muestras en un gel de 0,8% de agarosa a 5 V/cm durante 40 minutos.Cargar la escalera de ADN con los fragmentos de ADN que van desde 100 10000 pares de base Luego purificar los productos PCR utilizando un kit de purificación de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la transformación de la levadura, comience por pre-cultivar levadura de tipo silvestre en un matraz de 100 ml que contiene 20 ml de extracto de levadura de sintona dextrosa o medio YEPD. Para una incubación durante la noche, a 30 grados centígrados, y 250 rotaciones por minuto La mañana siguiente, inocular 20 ml de medio YEPD fresco con un volumen calculado de levadura pre-cultivo durante la noche.Coloque el cultivo en una incubadora de agitación hasta que se alcance una densidad óptica de 1,0, medida a 600 nanómetros. Cosecha las células de levadura por centrifugación. Lavar el pellet de célula de levadura en 20 ml de agua desmineralizada a temperatura ambiente, seguido de una centrifugación adicional.Resuspender el pellet en 100 microlitros de acetato de litio Solución Tris-EDTA, y transferir la levadura a un tubo de microcentrífuga. Mezclar cinco microlitros de ADN portador de una sola cadena y un microgramo de plásmido pCSN067 con la suspensión de la célula de levadura. A continuación, mezcle 600 microlitros de solución de polietilenglicol LiAc-TE con la muestra.Incubar las células de levadura y el plásmido durante 30 minutos a 30 grados celsius y 450 prm en un bloque de calor de mesa. Al final de la incubación, mezclar 70 mL de dimetilsólfóxido con la solución de transformación. Caliente la mezcla durante 15 minutos en un baño de agua de 42 grados Centígrados.Transfiera la mezcla a un tubo inferior redondo de 15 ml. Añadir 10 mL de YEPD al tubo para una incubación nocturna a 30 grados centígrados y 250 rpm. A la mañana siguiente, recoger las células transformadas por centrifugación, y aspirar todos menos los 200 microlitros finales del sobrenadante.Resuspender el pellet de célula de levadura transformada en el sobrenadante restante. Placa 150 microlitros de la mezcla de transformación, y 150 microlitros de una dilución 20 veces de los 50 microlitros restantes de mezcla de transformación en YEPD, en placas de agar YEPD, complementado con 0,2 gramos por litro de G418. Después de 48 a 72 horas a 30 grados Celsius, elija un solo transformador para volver a rayar en una nueva placa de agar YEPD complementada con 0,2 g/L de G418.Para la segunda transformación, haga crecer el cultivo a una densidad óptica a 600 nanómetros de 1,0, como acaba de demostrar. Y añadir 20 microlitros de células a un tubo de microcentrífuga. Después de la centrifugación, resuspender el pellet celular en 100 microlitros de la solución LiAc-TE, y añadir ssDNA.En un tubo separado, combine un microgramo de la matriz de ARNrN, un microgramo del plásmido de receptor linealizado para la matriz de CRRNA, un microgramo de cada ADN de donante y un microgramo de cada región de flanqueo. A continuación, transfiera la mezcla de ADN al tubo de células de levadura competentes y complete la segunda transformación como se demostró para la primera transformación. A la mañana siguiente, recoger las células por centrifugación y resuspender el pellet en una pequeña alícuota de sobrenadante.A continuación, la placa 150 microlitros de la mezcla de transformación, y 150 microlitros de una dilución 20 veces de la mezcla de transformación en el medio YEPD, sobre placas de agar YEPD suplementadas con 0,2 g/L G418, y 0,2 g/L de nourseothricina Después de 48 a 72 horas, a 30 grados centígrados, elija un solo transformador de color para re-rayar en una nueva placa YEPD para obtener colonias de un solo color. Para determinar la eficiencia de edición del genoma, cuente el número de colonias de color y blancas en las placas de transformación, y divida el número de colonias de colores por el número total de colonias. Para crear arte de píxeles de levadura, inocular matraces individuales de batido de 500 ml que contienen 100 ml de medio YEPD con tres carotenoides de diferentes colores que producen cepas S.cerevisiae, y un tipo salvaje CEN.Cepa PK113-7D. Incubar los cultivos durante la noche a 30 grados centígrados con temblores a 250 rpm. Transfiera 0,5 ml de cada cultivo nocturno a tubos individuales que contengan 0,5 ml de medio de gradiente de densidad estéril no iónico por tubo, y mezcle brevemente las soluciones por vórtice.Transfiera las suspensiones celulares a un depósito individual y calificado 2 por 3 pozos. Utilice un archivo csv con el ajuste de calibración de fluidos 6RES_AQ_GPSA2 en un instrumento de manipulador de líquido acústico para detectar 25 nanolitros de cada cepa S.cerevisiae desde la placa de origen de depósito calificada adecuada hasta una microplaca de destino de pozo 6144 que contenga 50 ml de agar YEPD. Cuando todos los pozos hayan sido vistos, incubar la microplaca a 30 grados Celsius durante 48 horas.Para intensificar los colores de las cepas, guarde las placas de agar a 4 grados Centígrados durante al menos 72 horas. Una foto de Rosalind Franklin ha aparecido en el plato. Como se ha demostrado, el promotor, el marco de lectura abierto, el terminador y dos secuencias de conectores contiguos de 50 bp se pueden ensamblar en un casete de expresión a través de una reacción de clonación de Golden Gate y verificarse por PCR.Después de la amplificación de la matriz de crRNA única por PCR, el plásmido receptor para la matriz de crRNA única se linealiza según lo confirmado por la electroforesis. La eficiencia de la Edición del Genoma Multiplex se puede calcular por el porcentaje de colonias de color después de la transformación, y por los resultados de los análisis de PCR que confirman la integración del ADN de los donantes en las ubicaciones de ADN genómico previstas. Por ejemplo, a partir de una imagen en blanco y negro de Rosalind Franklin, se creó una lista de imágenes y manchas de cuatro colores que luego se utilizó para detectar las cuatro cepas de levadura diferentes en una microplaca de agar a través de un manipulador de líquido acústico, como se demostró, lo que resultó en una pintura de levadura de alta resolución del científico.Para esta transformación, utilice soluciones recién preparadas y fragmentos de ADN de alta calidad. Este método también se puede aplicar para la introducción multiplex de deleciones definidas y mutaciones puntuales en el ADN genómico. Además, se pueden realizar experimentos de regulación CRISPR.Este método se puede modificar para introducir más que crRNAs libres dentro de una matriz para aumentar el número de modificaciones simultáneas que se pueden realizar.

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Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Optimización de un análisis de la expresión Multiplex basados en ARN usando Material de archivo de cáncer de mama

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Un método basado en el molde neto creación libre de andamio tridimensional de tejido cardiaco

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...