Name: crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

Detta projekt fick finansiering från Europeiska unionens Horisont 2020 forsknings-och innovationsprogram enligt bidragsavtal nr 686070 (DD-DeCaf) och 764591 (SynCrop), och från forskningsprogrammet byggstenar i livet med projektnummer 737.016.005 av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO). T.E.G. stöddes av Royal Society (Grant UF160357) och BrisSynBio, en BBSRC/EPSRC syntetisk biologi Research Centre (Grant BB/L01386X/1). Vi tackar Zi di och Jeffrey van Wijk för deras bidrag till jäst spotting experiment för att skapa jästen pixel konst.

<ol>
	<li>Knott, G. J., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+guides+the+future+of+genetic+engineering.">CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering.</a> Science. 361 (6405), 866-869 (2018).</li><li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+metabolic+engineering+using+an+orthogonal+tri-functional+CRISPR+system.">Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system.</a> Nature Communications. 8 (1), 1688 (2017).</li><li>Li, Z. -. H., Liu, M., Lyu, X. -. M., Wang, F. -. Q., Wei, D. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+facilitated+large+fragment+deletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).</li><li>Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+facilitated+multiple-chromosome+fusion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).</li><li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Abudayyeh, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector.">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Makarova, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+evolutionary+classification+of+CRISPR-Cas+systems.">An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).</li><li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovi&#269;, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA.">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae.+using+the+CRISPR/Cas+System.">Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601 (2018).</li><li>Ferreira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+CRISPR/Cas9+genome+editing+and+gene+regulation+using+Csy4+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).</li><li>Swarts, D. C., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+versus+Cas12a/Cpf1:+Structure&#8211;function+comparisons+and+implications+for+genome+editing.">Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure&#8211;function comparisons and implications for genome editing.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481 (2018).</li><li>Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Basis+for+DNA+Target+Specificity+of+CRISPR-Cas12a.">Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a.</a> Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).</li><li>Verwaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+beta-carotene+in+Saccharomyces+cerevisiae.+by+successive+transformation+with+carotenogenic+genes+from+Xanthophyllomyces+dendrorhous.">High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).</li><li>Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+enables+fast+and+simple+genome+editing+of+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).</li><li>Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+advances+engineering+of+microbial+cell+factories.">CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories.</a> Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).</li><li>Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3 (11), 3647 (2008).</li><li>Franklin, R. E., Gosling, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+configuration+in+sodium+thymonucleate.">Molecular configuration in sodium thymonucleate.</a> Nature. 171, 740-741 (1953).</li><li>Watson, J. D., Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structure+for+deoxyribose+nucleic+acid.">A structure for deoxyribose nucleic acid.</a> Nature. 171, 737-738 (1953).</li><li>Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+deoxypentose+nucleic+acids.">Molecular structure of deoxypentose nucleic acids.</a> Nature. 171, 738-740 (1953).</li><li>Young, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+algorithm-guided+design+of+massive+strain+libraries,+applied+to+itaconic+acid+production+in+yeast.">Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast.</a> Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).</li><li>Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cloning Method. , (2013).</li><li>Mandel, M., Higa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+bacteriophage+DNA+infection.">Calcium-dependent bacteriophage DNA infection.</a> Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).</li><li>Van Dijken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interlaboratory+comparison+of+physiological+and+genetic+properties+of+four+Saccharomyces+cerevisiae+strains.">An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains.</a> Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Acids Research. 19 (20), 5791 (1991).</li><li>Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+genomic+DNA+from+yeasts+for+PCR-based+applications.">Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications.</a> Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).</li><li>Tak, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+multiplex+gene+regulation+using+CRISPR-Cpf1-based+transcription+factors.">Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors.</a> Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+editing+by+CRISPR-Cpf1+using+a+single+crRNA+array.">Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array.</a> Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).</li><li>Swiat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FnCpf1:+a+novel+and+efficient+genome+editing+tool+for+Saccharomyces+cerevisiae.">FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cpf1-Assisted+Multiplex+Genome+Editing+and+Transcriptional+Repression+in+Streptomyces.">CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces.</a> Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1.">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell Discovery. 3, 17018 (2017).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).</li><li>Perez, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GuideScan+software+for+improved+single+and+paired+CRISPR+guide+RNA+design.">GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).</li><li>Cox, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Biology+Open+Language+Visual+(SBOL+Visual)+Version+2.0.">Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0.</a> Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).</li></ol>

Författarna förklarar att det finns en intressekonflikt. Författarna har arkiverat IP relaterade till presenterade metoder.

Det tillhandahållna protokollet beskriver multiplex genom redigering av S. cerevisiae med hjälp av Cas12a från Lachnospiraceae bakterie ND2006 i kombination med en enda crrna array och donator DNA. Utformningen av den enda crRNA-matrisen och givar-DNA förklaras i detalj. I motsats till det väletablerade CRISPR/Cas9-systemet har CRISPR/Cas12a den unika ytterligare förmågan att bearbeta flera crrnas som uttrycks från en enda crrna-matris13,33. På grund av den här funktionen är samtidig redigering av flera mål enklare att ställa in och kan uppnås i en enda omvandling. Denna enda crRNA array tillvägagångssätt visades före av Zetsche et al. 34 som samtidigt redigerade upp till fyra gener i däggdjursceller med hjälp av AsCas12a, och genom Swiat et al. 35 som introducerade fyra DNA-fragment i ett jästgenomet med FnCas12a. Till vår kännedom har ett större antal samtidiga genomiska modifieringar med hjälp av ett Cas12a-system inte rapporterats och den maximala gränsen för mål per enskild matris för Cas12a är ännu inte fastställt. Ytterligare forskning som utnyttjar enstaka crrna matriser i kombination med Cas12a inkluderar multiplex transkriptionell reglering reglering i ett brett spektrum av organismer33,36,37.
Det finns några kritiska steg i det presenterade protokollet. Noggrant utforma alla DNA-sekvenser som är inblandade i Cas12a genom redigering experiment, särskilt i fall när nya DNA-sekvenser introduceras. Bestäm funktionaliteten hos nya spacer sekvenser del av ett crRNA, till exempel genom en singleplex genomredigering experiment som beskrivs av VERWAAL et al. 19 innan du kombinerar dem till en enda crrna array. Följ rekommendationerna för beredning av omvandling buffert lösningar som används i Cas12a redigering experiment för att uppnå en god omvandling effektivitet jäst.
Det finns några valfria modifieringar av tekniken. Det rekommenderas att använda 1 μg av varje givardna, linearized pRN1120 eller enda crRNA array Expression kassett i omvandlingen, även om användningen av ett lägre DNA-belopp förväntas också resultera i en tillfredsställande omvandlings effektivitet. Utför en test omvandling för att avgöra om lägre DNA-mängder kan användas. Omvandlingen av S. cerevisiae kan utföras med en annan metod än den som beskrivs i detta protokoll, till exempel det protokoll som beskrivs av Gietz et al. (2007) 38. guiden RNA-mottagare plasmid pRN1120 lämpar sig för uttrycket av ett enda crrna och ett enda crrna-utbud av olika Cas12a varianter (t. ex.från acidaminococcus spp. BV3L6 eller Francisella novicida U112) as well as för uttryckt av sgRNA i kombination med Cas919. Givaren DNA behöver inte begränsas till karotenoid gen uttrycks kassetter och kompletterande regioner som riktar sig till donator DNA till de beskrivna int1, INT2 och INT3 platser i genomiskt DNA. Alla DNA av intresse kan införas i ett multiplex sätt, till genomiskt DNA av värden av de konstruktionsprinciper som beskrivs i detta protokoll, alternativt kan donator DNA användas för att ta bort DNA från en värd arvsmassa. Den modulära strukturen av Single crRNA array underlättar enkel justering av spacer och direkta upprepningssekvenser. Modifiering av spacer sekvenser möjliggör en ändring av den avsedda integrations Locus som kan utformas med ett av verktygen för identifiering av en genomisk mål plats, t. ex. guidescan programvara 1,039. Istället för att använda stora flanerande sekvenser som innehåller kopplingar sekvenser, 50-BP i kompletterande regionen kan ingå i givaren DNA sekvenser genom att införliva dessa 50-BP kompletterande region sekvenser i primers som används i PCR. I det här fallet, totalt bara tre i stället för nio givare DNA-fragment krävs för en lyckad multiplex Genome redigering experiment.
Sammanfattnings, detta protokoll ger steg-för-steg-anvisningar för att utföra multiplex genom redigering i S. cerevisiae med Cas12a i kombination med en enda crrna array metod. Protokollet demonstrerades av multiplex genom redigering med 9 givardna fragment och en enda crRNA array kodning för tre gRNAs. Vi visar höga övergripande redigerings frekvenser mellan 50% och 94% för de tre stam konstruktioner som rapporteras här. Avslutande, den unika funktionen hos Cas12a är möjligheten att bearbeta en enda crRNA array i enskilda crRNAs i en cell, vilket gör Cas12a ett utmärkt verktyg för att möjliggöra multiplex genom redigering och utveckla transkriptionella förordning moduler inriktning flera uttrycks kassetter på en och samma gå. I slutändan, tre stammar erhölls producera karotenoider på en annan nivå och färger i nyanser mellan gult och orange. Med dessa stammar och en vild-typ stam, vi visade hur en akustisk vätska hanterare kan användas rakt för att göra jäst pixel konst-detta för att hedra Rosalind Franklin som bidrog till upptäckten av DNA-strukturen 65 år sedan av hennes berömda foto 5123 < /C1 >.

CRISPR/CAS-enzymer har otvivelaktigt revolutionerat molekylärbiologi och antagits i stor utsträckning som verktyg för ingenjörs genom i en hastighet som tidigare inte var genomförbar1. Den första modifieringen av en Saccharomyces cerevisiae genom genom redigering av CRISPR/Cas9 Genome rapporterades av DiCarlo et al. 2, demonstrera framgångsrik gen knock-out och göra punktmutationer med hjälp av externt introducerade oligonukleotides. Ytterligare jäst CRISPR Toolbox utveckling ingår: transkriptionell reglering genom fusion av katalytiskt inaktiva Dead Cas9 (dCas9) med transkriptionella effektordomäner för aktivering och ljuddämpning av transkription3, ansökan för både genom redigering och reglerande funktioner för metabolisk vägteknik genom samtidig aktivering, förtryck och radering4, radering av stora fragment från S. cerevisiae Genome5, och multipel-kromosom fusioner6 .
CRISPR/CAS genom redigering system hitta sitt ursprung i adaptiva immunsystem av bakterier och arkéer och dessa system har anpassats av molekylär biologer för genomredigering. Deras funktionalitet är baserad på de grupperade regelbundet Interfördelade korta Palindromic repetitioner (CRISPR) DNA regioner kodning RNA som ansvarar för erkännandet av den främmande DNA eller RNA och CRISPR associerade gener (CAS) som kodar RNA-guidad endonukleaser1,7,8,9. Baserat på den senaste genomanalys av CRISPR/CAS-system föreslogs det att dela upp CRISPR/CAS-systemen i två klasser, fem typer och 16 subtyper10. De två klasserna är framstående baserat på organisationen av effektor komplex inblandade i mål klyvning. Vanligtvis kategoriseras CRISPR/CAS-system med en organisation med flera subenheter som klass 1, medan enstaka subenhet effektor-komplex tillhör klass 210,11. I detta dokument utforskar vi klass 2 typ V Cas12a, tidigare kallad Cpf110,12, vilket är ett alternativ till klass 2 typ II Cas9. Även om Cas9 är väl kännetecknas och ofta används i forskning, Cas12a erbjuder ytterligare funktioner12. För det första, Cas12a bildar ett komplex med CRISPR RNA (crRNA) av 42 till 44 nukleotider utan att kräva en ytterligare trans-aktiverande CRISPR RNA (tracrRNA). Därför kan ett kortare guide-RNA utnyttjas i genomredigering med CRISPR/Cas12a-system jämfört med CRISPR/Cas9. För det andra, den unika Endonuklease och endoribonuclease aktivitet Cas12a möjliggör mognad av dess pre-crRNA13. Denna RNase aktivitet möjliggör kodning av flera crRNAs på en enda CRISPR crRNA array, medan Cas9 kräver separat uttryck för varje så kallade Single-guide RNA (sgRNA) eller alternativt till exempel uttryck för en ytterligare Endonuklease ( t. ex.Csy4) i kombination med igenkännings motiv för Csy4 kring varje sgrna14,15. För det tredje kräver Cas12a mål plats erkännande ett protospacer angränsande motiv (PAM) vid 5 ' från målet och klyver efter + 18/+ 23 position från sin PAM resulterar i klyvs DNA med klibbiga ändar, medan Cas9 kräver en PAM ligger på 3 ' slutet från mål och klyver efter-3 position skapa trubbiga slutet nedskärningar i DNA12. För det fjärde, den konsensus nukleotid sekvens av PAM skiljer mellan Cas12a ((T) TTV) och Cas9 (NGG), vilket gör Cas12a en lovande kandidat för inriktning T-Rich promotor och Terminator sekvenser16. Slutligen rapporterade en nyligen studie större mål specificitet för Cas12a än för de infödda Cas917.
Vi presenterar ett protokoll för användning av CRISPR/Cas12a-systemet för genomredigering av S. cerevisiae med särskilt fokus på införandet av flera DNA-uttryckskassetter i oberoende genomisk loci samtidigt (multiplex genom redigering) med hjälp av en enda crRNA array. Protokollets viktigaste steg återges i figur 1. Som ett konceptbevis tillämpades CRISPR/Cas12a-systemet för införande av tre uttrycks kassetter i genomet hos S. cerevisiae som möjliggör framställning av β-karoten18 som schematiskt visas i figur 2. Produktion av β-karoten påverkar fenotyp av s. cerevisiae: dvs., efter en lyckad introduktion av alla tre heterologa gener som krävs för karotenoider biosyntes, vita S. cerevisiae celler blir gula eller orange, beroende på uttrycks styrkan hos varje gen promotor. På grund av den enkla visuella uppläsning av denna väg, har det införts för att utveckla avancerade CRISPR-baserade system och metoder för genomredigering19,20. I detta arbete, uttrycks kassetter kodning av karotenoid gener crte, crtyb och crti har konstruerats med hjälp av en Golden Gate kloning (GGC) Approach21 med heterologa initiativtagare och homolog Terminators används för att framföra geners uttryck. Uttrycket kassetter är omgivna av unika 50-Base par (BP) sekvenser, kallas anslutningar, som möjliggör in vivo montering med integration flank DNA-sekvenser (Flanking regioner) med samma 50-BP sekvenser, och efterföljande integration i det genomiska DNA av jäst vid den position som bestäms av kompletterande regioner. Genom att använda olika promotor styrkor, stammar med olika nivåer av karotenoider produktionen erhölls resulterar i variation i färgen på cellerna. Dessa stammar-inspirerad av "Jästkonstprojektet"22 -användes i en spotting setup med en akustisk flytande hanterare för att skapa en 4-färg högupplöst "jäst fotografi" av Rosalind Franklin. Franklin (1920-1958) var en engelsk kemist och röntgenkristallograf välkänd för sitt bidrag till upptäckten av DNA-strukturen genom foto 5123,24,25.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals specific for the protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td style="width:175px;">Selection of E. coli transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">BsaI-HF (20 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R353L</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td style="width:175px;">Transfromation of 
			S. cerevisiae (carrier DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">dNTPs</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethanol absolute for analysis</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethylenediamine-tetraacetic acid</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Histodenz</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D2158&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Yeast pixel art</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100993</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nancy-520 DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>1494</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NEB10 competent E. coli cells</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>C3019H</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nourseothricin</td>
			<td style="width:144px;">Jena Bioscience</td>
			<td>AB102</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Phusion buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Polyethylene glycol 4000</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>7490</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:156px;">Purple loading dye</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td style="width:175px;">Purification of plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">RNase coctail enzyme mix</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>46300-018</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA Ligase (1 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>1705218</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit</td>
			<td style="width:144px;">Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td style="width:175px;">Purification of PCR products and linearized pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Xhol</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Zymolyase 50 mg/ml (5 units/&#181;L)</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1006</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:156px;">Zymolyase storage buffer</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1004-B</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals of general use</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">2*Peptone-Yeast extract (PY) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">2*PY medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Demineralized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">ELFO buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">MQ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Physiological salt solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">YEPD (2% glucose) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microplate 96 wells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 0.5 - 10 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 10 - 200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Pipette tips 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Shake flasks (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Sterile filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Centrifuge (Falcon tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Echo 525 acoustic liquid handler</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">NanoDrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Set for eletrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Table centrifuge (Eppendorfs tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCSN067</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101748</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pRN1120</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101750</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">S. cerevisiae strain 
			CEN.PK113-7D</td>
			<td style="width:144px;">EUROSCARF collection</td>
			<td></td>
			<td>http://www.euroscarf.de</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art

Hög effektivitet, användarvänlighet och mångsidighet av de grupperade regelbundet interfördelade korta palindrom repetitioner/CRISPR-Associated protein 9 (CRISPR/Cas9) systemet har underlättat avancerad genetisk modifiering av Saccharomyces cerevisiae, en modell organism och arbetshäst i industriell bioteknik. CRISPR-associerat protein 12a (Cas12a), en RNA-guidad endonukleas med funktioner som skiljer sig från Cas9 tillämpas i detta arbete, ytterligare utvidga den molekylära verktygslådan för genom redigering ändamål. En fördel med CRISPR/Cas12a-systemet är att den kan användas i multiplex genom redigering med flera RNAs-ledare som uttrycks från en enda transkriptionell enhet (Single CRISPR RNA (crRNA) array). Vi presenterar ett protokoll för multiplex integration av flera heterologa gener i oberoende loci av S. cerevisiae genomet med hjälp av CRISPR/Cas12a systemet med flera crRNAs uttrycks från en enda crrna array konstruera. Den föreslagna metoden utnyttjar förmågan hos S. cerevisiae att utföra in vivo rekombination av DNA-fragment för att montera den enda crrna matrisen i en Plasmid som kan användas för transformant urval, samt montering av givar-DNA sekvenser som integreras i genomet vid avsedda positioner. Cas12a är pre-uttryckt konstitutivt, underlätta klyvning av S. cerevisiae genomet vid de avsedda positionerna vid uttryck av den enda crrna array. Protokollet omfattar utformning och konstruktion av en enda crRNA array och givare DNA-uttryck kassetter, och utnyttjar en integrationsstrategi som använder sig av unika 50-BP DNA-kopplingar sekvenser och separata integration flank DNA-sekvenser, vilket förenklar experimentell design genom standardisering och modularisering och utökar utbudet av applikationer. Slutligen, vi visar en enkel teknik för att skapa jäst pixel konst med en akustisk flytande hanterare med olikfärgade karotenoid producerar jäst stammar som konstruerades.

Protokollet för multiplex genom redigering med crisrp/Cas12a demonstrerades genom att konstruera tre karotenoidproducerande S. cerevisiae stammar uttrycker crte, crtyb och crti gener med heterologa främjare av hög, medelhög och låg hållfasthet: stam 1, 2 respektive 3 (tilläggstabell 3). Byggandet av dessa stammar krävs generering av tre givare DNA-uttryck kassetter och sex kompletterande regioner per stam för inriktning på tre olika loci i genomiskt DNA (visas i figur 2B). Som beskrivs häri, promotor, öppen läsram, Terminator och två sammanhängande 50-BP kontakter sekvenser samlades till en Expression kassett via en Golden Gate kloning reaktion och församlingen kontrollerades av PCR (figur 3a). Den enda crRNA-matrisen beställdes som ett syntetiskt DNA-fragment och förstärdrades med PCR (figur 3B). Mottagaren plasmid för den enda crRNA array (plasmid pRN1120) var linearized med EcoRI-HF och xhoI och linearisering bekräftades genom elektrofores (figur 3C). Utformningen och nukleotidsekvenserna hos de införda kassetterna av givar-DNA-uttrycket och de kompletterande regionerna visas i tabell 3 och kompletterande tabell 4. Sekvensen av enstaka crRNA array uttrycks kassetter finns i kompletterande tabell 1. Funktionaliteten hos spacerarna som ingick i den enda crRNA-matrisen testades i förväg av singleplex genom redigering med individuella crRNAs19.
Effektiviteten i genomredigering med Cas12a utvärderades först baserat på antalet färgade kolonier som erhållits efter omvandling (tabell 1, figur 4). Redigerings effektiviteten hos de tre konstruerade stammarna varierade från 50% till 94%. Särskilt införandet av uttrycks kassetter som används för att generera stam 1 visade den lägsta redigeringen effektivitet, möjligen orsakad av arten av givaren DNA (dvs.dessa uttrycks kassetter koda crte, Crtyb och crti från tre höghållfasta promotorer). För det andra bekräftades korrekt integrering av de tre kassetterna av givar-DNA-uttrycket vid den avsedda loci på genomiskt DNA med PCR (figur 5). Primers utformades på ett sådant sätt att PCR-produkter erhölls när korrekt integrering av givar-DNA vid den avsedda Locus inträffade. För varje omvandlings experiment plockades åtta kolonier från omvandlings plattan och testades (Observera att endast tre presenteras i figur 5). I allmänhet, av 8 kolonier testade per donator DNA, korrekt integration av Crte givare DNA på int1 Locus, CRTYB vid INT2 Locus och crti vid INT3 Locus bekräftades i > 90% av omvandlare. Dessa resultat visar CRISPR/Cas12a systemet i kombination med en enda crRNA array möjliggör effektiv multiplex redigering av S. cerevisiae genomet på flera loci samtidigt.
Dessutom visar vi skapandet av "jäst pixel art" med hjälp av de tre karotenoid som producerar stammar som konstruerades tillsammans med en icke-färgad vildtyp stam. Från en svartvit bild av Rosalind Franklin (figur 6a), en 4-färg bild (figur 6B) och spotting lista skapades som sedan användes för att upptäcka de fyra olika jäststammar på en agar mikrotiterplattor med en akustisk vätske hanterare, vilket resulterar i en högupplöst "jäst målning" av Rosalind Franklin (figur 6C, D, E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig1v5.jpg"> Figur 1 : Arbetsflöde för protokollet för CRISPR/Cas12a multiplex genom redigering i S. cerevisiae. Arbetsflödet innehåller viktiga steg i den presenterade metoden. Mer information finns i protokollet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig2.jpg"> Figur 2 : Schema för CRISPR/Cas12a multiplex genom redigering med en enda crRNA array. (A) den enda crrna matrisen består av tre crRNAs enheter i sin mogna form, en 20-BP direkt upprepa specifika för LbCas12a (grå kvadrater) med en 23-BP guide sekvens (färgade diamanter). Uttrycket för crRNA-matrisen aktiveras av SNR52 promotorn och SUP4 terminatorn. Omvandling av S. cerevisiae med en linearized pRN1120 och den enda crrna array Expression kassett innehållande homologi med pRN1120 (Diagonala ränder) möjliggör in vivo rekombination i en cirkulär plasmid i celler pre-uttrycker LbCas12a. Den enda crRNA array bearbetas därefter av Cas12a. (B) Cas12a riktar sig till avsedda int1, INT2 och INT3 genomiska målplatser och skapar dubbla strandsatta raster. I omvandlings blandningen ingick donator-DNA som bestod av flanerande regioner och karotenoid gen uttrycks kassett. Givare DNA-sammansättningar riktade sig till en sträcka av DNA i genomisk DNA runt int1 (crte), INT2 (crtyb) och INT3 (crti) loci genom in vivo rekombination på grund av närvaron av 50-BP homolog kopplingar sekvenser, anges som 5, A, B, C, D eller E. P1 – P3, olika projektansvariga. T1 – T3, olika Terminators. Denna siffra har modifierats från VERWAAL et al. 201819. Genetiska konstruktioner visas med hjälp av syntetiska biologi öppna språk (SBOL) visuella symboler40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig3.jpg"> Figur 3 : PCR som verifierar genomredigeringsexperimenten. Averifiering av gyllene Gatens klonings reaktioner hos monterade GIVAR-DNA-kassetter. Erhållna resultat är i samförstånd med förväntade längder. BPCR för den enda crrna-matrisen. CLinearisering av plasmid pRN1120. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig4.jpg"> Figur 4 : Plattor av S. cerevisiae omvandlingar med hjälp av multiplex Genome redigering metod. (A) stam 1 uttrycker crte, Crtyb och crti från tre starka initiativtagare (mörkt orange kolonier). B) stam 2 som uttrycker crte, Crtyb och crti från tre medelstarka promotorer (orangefärgade kolonier). C) stam 3 som uttrycker crte, Crtyb och crti från tre lågstyrke-promotorer (gula kolonier). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig5.jpg"> Figur 5 : PCR som verifierar integrationen av donatorns DNA-uttryckkassetter på den avsedda loci inom genomiskt DNA. Akontroll av tre kolonier av stammen 1. Bkontroll av tre kolonier av stammen 2. Ckontroll av tre kolonier av stammen 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig6.jpg"> Figur 6 : Jäst pixel konst av Rosalind Franklin. (A) svartvit RGB-bild av 220 × 280 pixlar av Rosalind Franklin som användes som mall. (B) dator omvandling av svartvita foto av Rosalind Franklin i en 4-färg 64 × 96 pixel lista. (C) foto av jäst pixel konst med 64 × 96 jästkolonier med en inzoomad sektion. Dfoto av en akustisk vätske hanterare med två fullvuxna plattor. (E) foto av en fullvuxen mikrotiterplattor med 64 × 96 jästkolonier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Stam 1</td>
			<td>Stam 2</td>
			<td>Stam 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Färgade kolonier</td>
			<td>16</td>
			<td>279</td>
			<td>220</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vita kolonier</td>
			<td>16</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totalt antal kolonier</td>
			<td>32</td>
			<td>297</td>
			<td>238</td>
		</tr>
<tr>
<td>Effektivitet</td>
			<td>50%</td>
			<td>94%</td>
			<td>92%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: redigera effektiviteten i multiplex genomredigeringsmetoden.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>crRNA array sekvensa, b, c, d, e, f</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Catgtttgacagcttatcatcgataatccggagctagcatgcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcag Tctttgaaaa GATAATGTATGATTATGCTTTCACTCATATTTATACAGAAACTTGATGTTTTCTTTCGAGTATATACAAGG TGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCA TTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGC ATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCAatttctactaagtgtagat CTGGTGGGAGAGAAAGCTTATGAAatttctactaagtgtagatgtgccgtac GCCGGAGCCGACGGAatttctactaagtgtagattgcccctcttatacgattatatttt TTTTTGTTTTTTATGTCTggggggcccggtacccagcttttgttccctttagtgagg GTTAATTCCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG
</td>
		</tr>
<tr>
<td>a. homologi till pRN1120 (fet). b. SNR52 promotor (kursiv stil). c. genomiska målsekvenser (understrukna). d. guide direkt upprepar specifika för LbCas12a (kursiv, fet). e. SUP4 Terminator (kursiv stil). f. homologi till pRN1120 (fet).</td>
		</tr>
</tbody></table>Tilläggstabell 1: Single crRNA array för LbCas12a innehållande homologi med plasmid pRN1120.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>Namn</td>
			<td>Sekvensa</td>
			<td>Beskrivningb</td>
			<td>Som används i punkt</td>
		</tr><tr><td>KC-101</td>
			<td>CATGTTTGACAGCTTATCATC</td>
			<td>FW primer för amplifiering av Single crRNA array</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-102</td>
			<td>CACACAGGAAACAGCTATGAC</td>
			<td>RV primer för amplifiering av Single crRNA array</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-103</td>
			<td>AAGCGACTTCCAATCGCTTTGC</td>
			<td>FW primer för förstärkning av givar-DNA med kontakt 5</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-104</td>
			<td>AAAGCAAAGGAAGGAGAGAAC</td>
			<td>RV primer för förstärkning av givar-DNA med kontakt A</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-105</td>
			<td>CGGATCGATGTACACAACCG</td>
			<td>FW primer för förstärkning av givar-DNA med kontakt B</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-106</td>
			<td>CAACAGGAGGCGGATGGATATAC</td>
			<td>RV primer för förstärkning av givar-DNA med kontakt C</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-107</td>
			<td>AACGTTGTCCAGGTTTGTATCC</td>
			<td>FW primer för förstärkning av givar-DNA med kontakt D</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-108</td>
			<td>AGGTACAACAAGCACGACCG</td>
			<td>RV primer för förstärkning av givar-DNA med kontakt E</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-109</td>
			<td>CACTATAGCAATCTGGCTATATG</td>
			<td>FW primer för amplifiering av INT1 5 ' med kontakt 5</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-110</td>
			<td>
AAACGCCTGTGGGTGTGGTAC TGGATATGCAAAGCGATTGGAA GTCGCTTgactcctctgccgtc ATTCC</td>
			<td>RV primer för amplifiering av INT1 5 ' med kontakt 5</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-111</td>
			<td>
TTGCCCATCGAACGTACAAG TACTCCTGTTCTCTCCTTCCTT TGCTTTaagcgttgaagtttcctc TTTG</td>
			<td>FW primer för amplifiering av INT1 3 ' med kontakt A</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-112</td>
			<td>TGTCAACTGGAGAGCTATCG</td>
			<td>RV primer för amplifiering av INT1 3 ' med kontakt A</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-113</td>
			<td>AGAAGATTTCTCTTCAATCTC</td>
			<td>FW primer för amplifiering av INT2 5 ' med kontakt B</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-114</td>
			<td>
TGCTAAGATTTGTGTTCGTT TGGGTGCAGTCGGTTGTGTACAT CGATCCGcccttatcaaggatacc TGGTTG</td>
			<td>RV primer för amplifiering av INT2 5 ' med kontakt B</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-115</td>
			<td>
ACGCTTTCCGGCATCTTCCA GACCACAGTATATCCATCCGCCT CCTGTTGggcgattacacaagcg GTGG</td>
			<td>FW primer för amplifiering av INT2 3 ' med kontakt C</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-116</td>
			<td>TCTCCTCTTCGATGACCGGG</td>
			<td>RV primer för amplifiering av INT2 3 ' med kontakt C</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-117</td>
			<td>GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTG</td>
			<td>FW primer för amplifiering av INT3 5 ' med kontakt D</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-118</td>
			<td>
GCGGAATATTGGCGGAACGG ACACACGTGGATACAAACCTG Mer från GACAACGTTttccaaggaggtg AAGAACG</td>
			<td>RV primer för amplifiering av INT3 5 ' med kontakt D</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-119</td>
			<td>
AAATAACCACAAACATCCTT CCCATATGCTCGGTCGTGCTTGTT GTACCTgatgggacgtcagcact GTAC</td>
			<td>FW primer för amplifiering av INT3 3 ' med kontakt E</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-120</td>
			<td>GAGCTTACTCTATATATTCATTC</td>
			<td>RV primer för amplifiering av INT3 3 ' med kontakt E</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-121</td>
			<td>GTTACTAAACTGGAACTGTCCG</td>
			<td>FW primer för verifiering av integrationen av con5-crtE-conA till INT1 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-122</td>
			<td>CACTGCTAACTACGTTTACTTC</td>
			<td>FW primer för verifiering av integrationen av con5-crtE-conA till INT1 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-123</td>
			<td>CACTGGAACTTGAGCTTGAG</td>
			<td>FW primer för verifiering av integrationen av conB-crtYB-conC till INT2 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-124</td>
			<td>GTCTCCAGCTGAATTGGTCC</td>
			<td>FW primer för verifiering av integrationen av conB-crtYB-conC till INT2 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-125</td>
			<td>CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC</td>
			<td>FW primer för verifiering av integrationen av conD-crtI-conE till INT3 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-126</td>
			<td>GATCGGTCAATTAGGTGAAG</td>
			<td>FW primer för verifiering av integrationen av conD-crtI-conE till INT3 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-127</td>
			<td>CCTTGTCCAAGTAGGTGTCC</td>
			<td>RV primer för verifiering av integrationen av con5-crtE-conA till INT1 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-128</td>
			<td>GCTGTCATGATCTGTGATAAC</td>
			<td>RV primer för verifiering av integrationen av con5-crtE-conA till INT1 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-129</td>
			<td>CTGGCAATGTTGACCAATTGC</td>
			<td>RV primer för verifiering av integrationen av conB-crtYB-conC till INT2 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-130</td>
			<td>CCAACGTGCCTTAAAGTCTG</td>
			<td>RV primer för verifiering av integrationen av conB-crtYB-conC till INT2 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-131</td>
			<td>CCTTACCTTCTGGAGCAGCAG</td>
			<td>RV primer för verifiering av integrationen av conD-crtI-conE till INT3 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-132</td>
			<td>CTGGTTACTTCCCTAAGACTG</td>
			<td>RV primer för verifiering av integrationen av conD-crtI-conE till INT3 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>a. djärva sekvenser betecknar kopplingssekvenser. b. forward och reverse primers betecknas som FW respektive RV.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tilläggstabell 2: primer-sekvenser.
<img alt="Supplementary Table 3" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable3.jpg"> Tilläggstabell 3: utformning av konstruerade stammar.
<img alt="Supplementary Table 4" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable4.jpg"> Kompletterande tabell 4: sekvenser av donatorns DNA-uttryckskassetter och flagande områden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/Suppl_Table_4.docx" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a-systemet i kombination med en enda crRNA-array möjliggör effektiv multiplex-redigering av S. cerevisiae -genomet vid flera loci samtidigt. Detta demonstreras genom att konstruera karotenoid producerar jäststammar som sedan används för att skapa jäst pixel konst.

CRISPR/Cas12a multiplex genom redigering av Saccharomyces cerevisiae och skapandet av jäst pixel art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Detta protokoll visar en ny metod för Multiplex Genomredigering av Saccharomyces cerevisiae genom att införa flera uttryck kassetter på olika lokus i en enda omvandling steg. Denna kloning gratis plasmid montering strategi för att uttrycka en enda crRNA array, leder till en snabb, effektiv och flexibel genomet redigeringsprotokoll. Vi kommer att konstruera vilda typ jästceller, att producera karotenoider genom att införa gratis heterologa gener på fri genomisk loci.Den enda crRNA array består av fria enskilda crRNAs uttryckt från RNA polymeras gratis promotor. Cas12a bearbetar crRNA-arrayen in vivo till enskilda crRNAs. CrRNAs guidar Cas12a till målloben på det genomiska DNA där Cas12a introducerar dubbelsträngsbrott.Nedåtgående DNA-fragment rekombin för in vivo-rekombination och integreras i genomisk DNA. Att demonstrera protokollet blir Klaudia Ciurkot, doktorand. Jeffery van Wijk, en biträdande forskare.Och Brenda Vonk, en Senior Associate Scientist från vårt laboratorium. Efter att ha erhållit en enda crRNA-array för Multiplex Genomredigeringsexperiment av syntetiskt DNA, förbered PCR-förstärkningsmixen och laddar matrisen i termocyklern för förstärkning. För att analysera PCR-produkterna genom elektrofores, kör proverna på en 0,8%agarosgel vid 5 V/cm i 40 minuter.Ladda DNA-stegen med DNA-fragmenten som sträcker sig från 100 10000 baspar Sedan rena PCR-produkterna med hjälp av en PCR-reningssats enligt tillverkarens anvisningar. För jäst omvandling, börja med pre-culturing vild typ jäst i en 100 mL kolv som innehåller 20 mL jästextrakt peptone dextros eller YEPD medium. För en övernattning inkubation, vid 30 grader Celsius, och 250 rotationer per minut Nästa morgon, inokulera 20 mL färskt YEPD medium med en beräknad volym av natten före odling jäst.Placera kulturen i en skakande inkubator tills en optisk densitet på 1,0, mätt vid 600 nanometer nås. Skörda jästcellerna genom centrifugeringen. Tvätta jästcellen pelleten i 20 mL av rumstemperatur demineraliserat vatten, följt av en extra centrifugering.Resuspend pelleten i 100 mikroliter av litiumacetat Tris-EDTA lösning, och överföra jästen till en microcentrifug röret. Blanda fem mikroliter av enkelsträngat bärar-DNA och ett mikrogram plasmid pCSN067 med jästcellsupphängningen. Blanda sedan 600 mikroliter av polyetylenglykol LiAc-TE-lösning med provet.Inkubera jästcellerna och plasmiden i 30 minuter vid 30 grader Celsius och 450 prm i ett bordsskiva värmeblock. Vid slutet av inkubationen, blanda 70 mL dimetylsulfoxid med omvandlingslösningen. Värme chock blandningen i 15 minuter i en 42 grader Celsius vattenbad.Överför blandningen till ett 15 mL rund bottenrör. Tillsätt 10 mL YEPD till röret för en inkubation över natten vid 30 grader Celsius och 250 rpm. Nästa morgon, samla de omvandlade cellerna genom centrifugering, och aspirera alla utom de sista 200 mikroliter av supernatanten.Resuspend den transformerade jästcellpellet i den återstående supernatanten. Plate 150 mikroliter av omvandlingen mix, och 150 mikroliter av en 20 gånger utspädning av de återstående 50 mikroliter av omvandling mix i YEPD, på YEPD agar plattor, kompletterat med 0,2 gram per liter G418. Efter 48 till 72 timmar vid 30 grader Celsius, välj en enda transformant för re-streaking på en ny YEPD agar platta kompletterad med 0,2 g / L av G418.För den andra omvandlingen, odla kulturen till en optisk densitet vid 600 nanometer på 1,0, som just visat. Och tillsätt 20 mikroliter celler till ett mikrocentrifugrör. Efter centrifugeringen, resuspend cell pelleten i 100 mikroliter av LiAc-TE lösning, och lägg ssDNA.I ett separat rör, kombinera ett mikrogram av den enda crRNA-matrisen, ett mikrogram av den linjäriserade mottagarplasmiden för crRNA-arrayen, ett mikrogram av varje givar-DNA och ett mikrogram av varje flankerande region. Överför sedan DNA-blandningen till röret av kompetenta jästceller och slutföra den andra omvandlingen som visats för den första omvandlingen. Nästa morgon, samla cellerna genom centrifugeringen och resuspend pelleten i en liten alikvot av supernatant.Sedan platta 150 mikroliter av omvandlingen mix, och 150 mikroliter av en 20 gånger utspädning av omvandlingen mix i YEPD medium, på YEPD agar plattor kompletterade med 0,2 g / L G418, och 0,2 g / L nourseothricin Efter 48 till 72 timmar, vid 30 grader Celsius, plocka en enda färgad transformant för re-strimning på en ny YEPD platta för att erhålla enfärgade kolonier. För att bestämma genomredigeringseffektiviteten, räkna antalet färgade och vita kolonier på omvandlingsplattorna, och dela antalet färgade kolonier med det totala antalet kolonier. För att skapa jäst pixel konst, inokulera enskilda 500 mL skaka kolvar som innehåller 100 mL yepd medium med tre olikfärgade karotenoid producerar S.cerevisiae stammar, och en vild typ CEN.PK113-7D stam. Inkubera kulturerna över natten vid 30 grader Celsius med skakningar vid 250 rpm. Överför 0,5 mL av varje övernattningskultur till enskilda rör som innehåller 0,5 mL steril, icke-jonisk densitetsgradientmedium per rör, och blanda kort lösningarna genom att virvelning.Överför cellupphängena till individuell, kvalificerad reservoar 2 med 3 brunnar. Använd en csv-fil med inställningen för vätskekalibrering 6RES_AQ_GPSA2 på ett akustiskt vätskehanterarinstrument för att upptäcka 25 nanoliter av varje S.cerevisiae-stam från lämplig kvalificerad reservoarkällaplatta på en 6144 brunnsdestinationsmikroplatta som innehåller 50 mL YEPD-agar. När alla brunnar har setts, inkubera mikroplattan vid 30 degress Celsius i 48 timmar.För att intensifiera färgerna på stammarna, förvara agarplattorna vid 4 grader Celsius i minst 72 timmar. En bild på Rosalind Franklin har dykt upp på tallriken. Som visat, promotorn, öppen läsning ram, terminator, och två sammanhängande 50 bp connector sekvenser kan monteras till ett uttryck kassett via en Golden Gate kloning reaktion, och verifieras av PCR.Efter förstärkning av den enda crRNA-arrayen genom PCR, är mottagaren plasmid för den enda crRNA-arrayen linjäriserad som bekräftas av elektrofores. Effektiviteten hos Multiplex genomredigeringen kan beräknas med andelen färgade kolonier efter omvandlingen, och genom resultaten av PCR-analyser som bekräftar integreringen av donator-DNA på de avsedda genomiska DNA-platserna. Till exempel, med utgångspunkt från en svartvit bild av Rosalind Franklin, en fyra färg bild och spotting lista skapades som sedan användes för att upptäcka de fyra olika jäst stammar på en agar mikroplatta via en akustisk vätska hanterare, som visat, vilket resulterar i en högupplöst jäst målning av vetenskapsmannen.För denna omvandling, använd nyberedda lösningar och DNA-fragment av hög kvalitet. Denna metod kan också tillämpas för multiplex införande av definierade borttagningar och punktmutationer i arvsmassans DNA. Dessutom kan CRISPR-regleringsexperiment utföras.Denna metod kan ändras för att införa mer än gratis crRNAs inom en matris för att öka antalet samtidiga ändringar som kan göras.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Hög genomströmning MikroRNA Profilering: Optimerad Multiplex QRT-PCR vid metod i nanoliter Skala på Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plasma Litografi Surface Mönstring för att skapa Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Lensfree On-chip tomografiska Mikroskopi Använda Multi-vinkel belysning och Pixel Super upplösning

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Kontinuerlig Högupplöst mikroskopisk observation av Replikativ Aging i knoppande jäst

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Tekniker för evolutionen av Robust pentosjäsande jäsa Jäst för bioomvandlingen av Lignocellulosa till etanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Skapande av hjärtvävnad som visar mekanisk integration av sfäroider med 3D bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv produktion och redigering av Feeder-fri IPSCs från mänsklig bukspottkörtelns celler med hjälp av CRISPR-Cas9-systemet

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Optimering av en Multiplex RNA-baserade uttryck analysen använder Breast Cancer arkivmaterial

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Mikroskop västra havren Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryon för könsceller omvandling eller CRISPR/Cas9 gen editering

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

En netto mögel-baserade metod byggnadsställning-fri tredimensionella hjärtvävnad skapelsens

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...