Name: crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

Bu proje, Avrupa Birliği 'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programı No. 686070 (DD-DeCaf) ve 764591 (SynCrop) altında ve proje numarası 737.016.005 tarafından araştırma programı yaşam taşları yapı tarafından fon aldı Hollanda bilimsel araştırmalar Örgütü (NWO). T.E.G. Royal Society (Grant UF160357) ve BrisSynBio, bir BBSRC/EPSRC sentetik biyoloji araştırma merkezi (Grant BB/L01386X/1) tarafından destekleniyordu. Biz Maya piksel sanatı oluşturmak için Maya lekeleme deneyler için katkısı Zi di ve Jeffrey van Wijk teşekkür ederiz.

<ol>
	<li>Knott, G. J., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+guides+the+future+of+genetic+engineering.">CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering.</a> Science. 361 (6405), 866-869 (2018).</li><li>DiCarlo, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+CRISPR-Cas+systems.">Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.</a> Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+metabolic+engineering+using+an+orthogonal+tri-functional+CRISPR+system.">Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system.</a> Nature Communications. 8 (1), 1688 (2017).</li><li>Li, Z. -. H., Liu, M., Lyu, X. -. M., Wang, F. -. Q., Wei, D. -. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+facilitated+large+fragment+deletion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).</li><li>Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+facilitated+multiple-chromosome+fusion+in+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).</li><li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Abudayyeh, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C2c2+is+a+single-component+programmable+RNA-guided+RNA-targeting+CRISPR+effector.">C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Makarova, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+evolutionary+classification+of+CRISPR-Cas+systems.">An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).</li><li>Mohanraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+evolutionary+roots+and+mechanistic+variations+of+the+CRISPR-Cas+systems.">Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems.</a> Science. 353 (6299), (2016).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Fonfara, I., Richter, H., Bratovi&#269;, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR-associated+DNA-cleaving+enzyme+Cpf1+also+processes+precursor+CRISPR+RNA.">The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA.</a> Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).</li><li>Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae.+using+the+CRISPR/Cas+System.">Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601 (2018).</li><li>Ferreira, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+CRISPR/Cas9+genome+editing+and+gene+regulation+using+Csy4+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae.</a> ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).</li><li>Swarts, D. C., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9+versus+Cas12a/Cpf1:+Structure&#8211;function+comparisons+and+implications+for+genome+editing.">Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure&#8211;function comparisons and implications for genome editing.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481 (2018).</li><li>Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+Basis+for+DNA+Target+Specificity+of+CRISPR-Cas12a.">Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a.</a> Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).</li><li>Verwaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+beta-carotene+in+Saccharomyces+cerevisiae.+by+successive+transformation+with+carotenogenic+genes+from+Xanthophyllomyces+dendrorhous.">High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).</li><li>Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cpf1+enables+fast+and+simple+genome+editing+of+Saccharomyces+cerevisiae.">CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).</li><li>Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+advances+engineering+of+microbial+cell+factories.">CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories.</a> Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).</li><li>Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3 (11), 3647 (2008).</li><li>Franklin, R. E., Gosling, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+configuration+in+sodium+thymonucleate.">Molecular configuration in sodium thymonucleate.</a> Nature. 171, 740-741 (1953).</li><li>Watson, J. D., Crick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structure+for+deoxyribose+nucleic+acid.">A structure for deoxyribose nucleic acid.</a> Nature. 171, 737-738 (1953).</li><li>Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+deoxypentose+nucleic+acids.">Molecular structure of deoxypentose nucleic acids.</a> Nature. 171, 738-740 (1953).</li><li>Young, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+algorithm-guided+design+of+massive+strain+libraries,+applied+to+itaconic+acid+production+in+yeast.">Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast.</a> Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).</li><li>Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cloning Method. , (2013).</li><li>Mandel, M., Higa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+bacteriophage+DNA+infection.">Calcium-dependent bacteriophage DNA infection.</a> Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).</li><li>Van Dijken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+interlaboratory+comparison+of+physiological+and+genetic+properties+of+four+Saccharomyces+cerevisiae+strains.">An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains.</a> Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+transformation+of+intact+yeast+cells+by+the+LiAc/SS-DNA/PEG+procedure.">Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure.</a> Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).</li><li>Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMSO-enhanced+whole+cell+yeast+transformation.">DMSO-enhanced whole cell yeast transformation.</a> Acids Research. 19 (20), 5791 (1991).</li><li>Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+genomic+DNA+from+yeasts+for+PCR-based+applications.">Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications.</a> Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).</li><li>Tak, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+and+multiplex+gene+regulation+using+CRISPR-Cpf1-based+transcription+factors.">Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors.</a> Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+editing+by+CRISPR-Cpf1+using+a+single+crRNA+array.">Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array.</a> Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).</li><li>Swiat, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FnCpf1:+a+novel+and+efficient+genome+editing+tool+for+Saccharomyces+cerevisiae.">FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cpf1-Assisted+Multiplex+Genome+Editing+and+Transcriptional+Repression+in+Streptomyces.">CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces.</a> Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1.">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell Discovery. 3, 17018 (2017).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).</li><li>Perez, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GuideScan+software+for+improved+single+and+paired+CRISPR+guide+RNA+design.">GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).</li><li>Cox, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+Biology+Open+Language+Visual+(SBOL+Visual)+Version+2.0.">Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0.</a> Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).</li></ol>

Yazarlar, bir ilgi çatışması olduğunu beyan ederler. Yazarlar, sunulan yöntemlerle ilgili IP dosyalandı.

Sağlanan protokol, tek bir crrna dizisi ve donör DNA 'sı ile birlikte lachnospiraceae bakteri ND2006 Cas12a kullanarak S. cerevisiae Multiplex genom düzenleme açıklar. Tek crRNA dizi ve donör DNA tasarımı ayrıntılı olarak açıklanmıştır. İyi kurulan Crispr/Cas9 sisteminin aksine, Crispr/Cas12a tek bir crrna dizisi13,33tarafından ifade edilen birden fazla crrnas işleme benzersiz ek yeteneği vardır. Bu özellik nedeniyle, birden çok hedefin eşzamanlı olarak düzenlenmesi daha kolaydır ve tek bir dönüşümde elde edilebilir. Bu tek crRNA dizi yaklaşımı önce Zetsche et altarafından gösterildi. 34 aynı anda AsCas12a kullanarak memeli hücrelerde dört gen kadar düzenlenmiş ve Swiat et al. 35 kullanarak FnCas12a bir Maya genomu IÇINE dört DNA parçaları tanıttı. Bilgimize göre, Cas12a sistemi kullanılarak eşzamanlı genomik değişikliklerin daha yüksek bir sayısı bildirilmemiştir ve Cas12a için tek bir dizi başına hedeflerin maksimal sınırı henüz belirlenemez. Cas12a ile birlikte tek crrna dizileri kullanan daha fazla araştırma organizmaların geniş bir yelpazede Multiplex transkripsiyon Yönetmeliği içerir33,36,37.
Sunulan protokolde bazı kritik adımlar vardır. Dikkatle Cas12a genom düzenleme deneyinde yer alan tüm DNA dizileri tasarlayın, özellikle yeni DNA dizileri tanıtıldı durumda. Yeni spacer dizileri bir crRNA parçası işlevselliğini belirlemek, örneğin bir singleplex genom düzenleme deneme tarafından açıklandığı gibi Verwaal ve Al. 19 onları tek bir crrna dizisine birleştirmeden önce. Maya iyi bir dönüşüm verimliliği elde etmek için Cas12a düzenleme denemede kullanılan dönüşüm tampon çözümleri hazırlanması için önerileri izleyin.
Teknik bazı isteğe bağlı değişiklikler vardır. Daha düşük bir DNA miktarının kullanımı da tatmin edici bir dönüşüm verimliliğine neden olması beklenmesine karşın, her bir donör DNA 'sının 1 μg 'sini, dönüşümde pRN1120 veya tek crRNA dizi ifade kaseti kullanmak tavsiye edilir. Daha düşük DNA miktarlarının kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için bir test dönüşümü gerçekleştirin. S. cerevisiae 'nin dönüşümü, örneğin Gietz et al tarafından açıklanan protokol gibi, bu protokolde açıklanan farklı bir yöntem kullanılarak gerçekleştirilebilir. (2007) 38. kılavuz RNA alıcısı Plasmid pRN1120, tek bir crrna ve farklı Cas12a türevleri (Örneğin, Acidaminococcus spp. ) tek bir crrna dizisinin ifadesi için uygundur. BV3L6 veya Francisella novicida U112) yanı sıra Cas919Ile birlikte sgrna ifadesi için. Donör DNA 'sı, genomik DNA 'daki INT1, INT2 ve INT3 sitelerine donör DNA 'yı hedefleyen karotenoid gen ifade kasetleri ve çevrelerle sınırlı olmak zorunda değildir. İlgi herhangi bir DNA, çok katmanlı bir şekilde, bu protokolde açıklanan tasarım ilkeleri ile ev sahibinin genomik DNA, ya da alternatif olarak bağışçı DNA bir ev sahibi genom DNA silmek için kullanılabilir sunulabilir. Tek crRNA dizisinin modüler yapısı, spacer ve doğrudan tekrarlama sıralarının kolay ayarlanmasını kolaylaştırır. Spacer dizileri modifikasyon bir genomik hedef sitenin tanımlanması için araçlardan biri tarafından tasarlanmış olabilir amaçlanan entegrasyon Locus bir değişiklik için izin verir, Örneğin guidescan yazılım 1,039. Bağlayıcı dizileri içeren büyük yan dizileri kullanmak yerine, 50-BP yan bölgenin bu 50-BP yan bölge sıraları PCR kullanılan primerler ekleyerek donör DNA dizileri dahil edilebilir. Bu durumda, başarılı bir Multiplex genom düzenleme deneyi için dokuz donör DNA parçası yerine Toplam sadece üç tane gereklidir.
Özetle, bu protokol, tek bir crRNA dizi yaklaşımı ile birlikte Cas12a kullanarak S. cerevisiae 'de Multiplex genom düzenlemeyi gerçekleştirmek için adım adım yönergeler sağlar. Protokol, 9 bağışçı DNA parçaları ve üç gRNAs için tek crRNA dizi kodlaması kullanılarak Multiplex genom düzenleme tarafından gösterilmiştir. Burada bildirilen üç gerinim tasarımları için% 50 ile% 94 arasında yüksek genel düzenleme frekansları gösteriyoruz. Cas12a 'in benzersiz özelliği, tek bir crRNA dizisini bir hücredeki bireysel crRNAs 'a işleme yeteneğidir, bu da Cas12a Multiplex genom düzenlemesini sağlamak ve birden çok özelliği hedefleyen transkripsiyon düzenleme modülleri geliştirmek için mükemmel bir araçtır. tek kerede ifade kasetleri. Sonunda, farklı bir seviyede karotenoidler üreten üç suşlar ve sarı ve turuncu arasındaki tonlarında renkler elde edildi. Bu suşları ve vahşi tip gerinim ile, nasıl bir akustik sıvı işleyici düz Maya piksel sanat yapmak için kullanılabilir gösterdi-Rosalind Franklin onuruna bu DNA yapısının keşfi katkıda 65 yıl önce onun ünlü fotoğraf 5123 < /C1 >.

CRISPR/CAS enzimleri açıkça moleküler biyoloji devrim ve yaygın olarak daha önce imkansız1bir hızda mühendislik genomlar için araçlar olarak kabul edilmiştir. CRISPR/Cas9 genom düzenleme sistemi tarafından bir Saccharomyces cerevisiae genomu Ilk değişiklik DiCarlo ve Al tarafından rapor edildi . 2, başarılı gen knock-out gösteren ve dışarıdan ortaya oligonükleotidler kullanarak nokta mutasyonları yapma. Daha fazla Maya jıtpr Toolbox gelişmeler dahil: katalytically aktif ölü Cas9 (dCas9) füzyon tarafından transkripsiyonel düzenleme aktivasyon ve transkripsiyon susturma etkinleştirmek için transkripsiyonel efektör etki ile3, uygulama her ikisi için eşzamanlı aktivasyon, baskı ve silme4ile metabolik yol mühendisliği için genom düzenleme ve düzenleyici fonksiyonlar, S. cerevisiae genom5' ten büyük parçaların silinmesi ve çoklu kromozom Fusions6 .
CRISPR/CAS genom düzenleme sistemleri, bakterilerin ve antik çağların adaptif bağışıklık sistemlerinde kökenlerini bulur ve bu sistemler genom düzenleme için moleküler biyologlar tarafından adapte edilmiştir. Bunların işlevselliği, yabancı DNA veya RNA 'nın tanınması için sorumlu RNA kodlamasını içeren kümelenmiş düzenli ara aralıklı kısa Palindromic tekrarlar (CRıNPR) DNA bölgeleri ve RNA destekli endonükleases1,7,8,9. CRISPR/CAS sistemlerinin son genom analizine dayanarak, CRISPR/CAS sistemlerini iki sınıf, beş tip ve 16 alt tip10' a bölmek önerilmiştir. İki sınıf hedef bölünme dahil efektör kompleksleri organizasyonu dayalı ayırt edilir. Tipik olarak, Multi-altbirim örgütlü Crispr/CAS sistemleri Sınıf 1 olarak sınıflandırılır, ancak tek altbirim efektör kompleksler 210,11sınıfına aittir. Bu yazıda, biz sınıf 2 türü V Cas12a, eski adı Cpf110,12, sınıf 2 türü II Cas9 alternatif olarak adlandırılan keşfedin. Cas9 iyi karakterize ve yaygın araştırmalarda kullanılan rağmen, Cas12a ek özellikler sunuyor12. Öncelikle, Cas12a, ek bir Trans-aktivasyonu CRISPR RNA (tracrRNA) gerektirmeden 42-44 nükleotidler CRISPR RNA (crRNA) ile bir kompleks oluşturur. Bu nedenle, Crispr/Cas9 ile kıyaslandığında daha kısa bir kılavuz RNA 'nın genom düzenlemede CRISPR/Cas12a sistemleri ile kullanılabilir. İkincisi, Cas12a 'in benzersiz endonükleaz ve endoribonuclease aktivitesi, crrna öncesi13' ün olgunlaşmasını sağlar. Bu RNase etkinliği, tek bir Crispr crrna dizisinde birden fazla crrnas 'ın kodlamasını sağlar, ancak Cas9 her sözde tek kılavuzdaki RNA (sgrna) veya alternatif olarak örneğin ek bir endonükleaz ifadesi için ayrı bir ifade gerektirir ( Örneğin, Csy4) her sgrna14,15çevreleyen Csy4 için tanıma motifleri ile birlikte. Üçüncü olarak, Cas12a hedef site tanıma bir protospacer bitişik motif gerektirir (Pam) 5 ' sonunda hedef ve Cleaves sonra + 18/+ 23 pozisyon onun Pam yapışkan uçları ile parçalanabilen DNA sonucu, oysa Cas9 bir Pam üzerinde bulunan gerektirir 3 ' sonunda -3 pozisyondan sonra hedef ve Cleaves DNA12' de künt uç kesimleri yaratıyor. Fourthly, PAM 'in uzlaşma nüklenotit dizisi Cas12a ((T) TTV) ve Cas9 (NGG) arasında farklılık gösterir ve bu da T zengin promotör ve Terminatör dizileri16' nın hedefleyen Cas12a için umut verici bir aday olur. Son olarak, yeni bir çalışmada Cas12a için yerel Cas917daha büyük hedef özgüllük bildirdi.
S. cerevisiae 'nin genom düzenlemesi için Crispr/Cas12a sistemini kullanarak, bırden fazla DNA ifadesi kasetlerini bağımsız genomik loci 'ye aynı anda (Multiplex genom düzenleme) giriş üzerine belirli bir odaklanma ile tanıtıyoruz tek bir crRNA dizisi. Protokol temel adımları Şekil 1' de tasvir edilir. Kavramsal bir kanıt olarak, Şekil 2' de şematik olarak gösterildiği gibi β-karoten18 üretimini sağlayan S. cerevisiae genomuna üç Ifade kasetleri giriş için Crispr/Cas12a sistemi uygulandı. Β-karoten üretimi s. cerevisiaefenotipini etkiler: yani, karotenoidler biyosentez için gerekli olan üç heterolog genlerin başarılı bir şekilde tanıtılması üzerine, beyaz S. cerevisiae hücreleri sarı veya turuncu açmak, Her gen organizör ifade gücüne bağlı olarak. Bu yolun basit görsel okumasının nedeniyle, genom düzenleme için gelişmiş Crispr tabanlı sistemler ve yöntemler geliştirmek için tanıtıldı19,20. Bu çalışma, karotenoid genler crte, crtyb ve crti kodlama ifade kasetleri bir Golden Gate klonlama (GGC) yaklaşımı21 heterolog rehberleri ve homolog sonlandırıcılar kullanılarak inşa edilmiştir genlerin ifade sürücü için kullanılır. İfade kasetleri, aynı 50-BP dizileri ile entegrasyon kanadı DNA dizileri (flanking bölgeleri) ile In vivo montaj için izin konektörler denilen benzersiz 50-baz çiftleri (BP) dizileri ile çevrilidir ve sonraki entegrasyon yan bölgeler tarafından belirlenen pozisyonda Maya genomik DNA içine. Farklı Organizatör güçleri kullanarak, farklı seviyelerde karotenoidler üretimi olan suşlar, hücrelerin renginde varyasyon elde edildi. Bu suşları-"Maya Sanat Projesi"22 esinlenerek-bir akustik sıvı işleyici ile bir lekeleme kurulum Rosalind Franklin 4 renkli yüksek çözünürlüklü "Maya fotoğraf" oluşturmak için kullanılmıştır. Franklin (1920-1958) bir İngiliz kimyager ve X-Ray kristalbilimciydi iyi fotoğraf 5123,24,25tarafından DNA yapısının keşfi için onun katkısı ile bilinmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:581px;" width="581">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals specific for the protocol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10787018</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td style="width:175px;">Selection of E. coli transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">BsaI-HF (20 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R353L</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td style="width:175px;">Transfromation of 
			S. cerevisiae (carrier DNA)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">dNTPs</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>10297018</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">EcoRI-HF</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R3101S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethanol absolute for analysis</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Ethylenediamine-tetraacetic acid</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>ED</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">G418 disulfate salt</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A1720</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Histodenz</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D2158&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Yeast pixel art</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>100993</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Lithium acetate dihydrate</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L6883</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nancy-520 DNA Gel Stain</td>
			<td style="width:144px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>1494</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NEB10 competent E. coli cells</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>C3019H</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Nourseothricin</td>
			<td style="width:144px;">Jena Bioscience</td>
			<td>AB102</td>
			<td style="width:175px;">Selection of S. cerevisiae transformants</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Phusion buffer</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td style="width:175px;">PCRs</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Polyethylene glycol 4000</td>
			<td style="width:144px;">Merck</td>
			<td>7490</td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>854016</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:156px;">Purple loading dye</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>B7024S</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:144px;">QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td style="width:175px;">Purification of plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">RNase coctail enzyme mix</td>
			<td style="width:144px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>46300-018</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">T4 DNA Ligase (1 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>1705218</td>
			<td style="width:175px;">Golden Gate Cloning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:144px;">Invitrogen</td>
			<td>16500500</td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit</td>
			<td style="width:144px;">Promega</td>
			<td>A9282</td>
			<td style="width:175px;">Purification of PCR products and linearized pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Xhol</td>
			<td style="width:144px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td style="width:175px;">Linearization of pRN1120</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Zymolyase 50 mg/ml (5 units/&#181;L)</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1006</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:156px;">Zymolyase storage buffer</td>
			<td style="width:144px;">Zymo Research</td>
			<td>E1004-B</td>
			<td style="width:175px;">Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Chemicals of general use</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">2*Peptone-Yeast extract (PY) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">2*PY medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Demineralized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">ELFO buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">MQ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Multiple steps</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Physiological salt solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Transformation of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Cultivation of S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:156px;">YEPD (2% glucose) agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:175px;">Plate growth of 
			S. cerevisiae</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Falcon tubes (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microplate 96 wells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 0.5 - 10 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Pipette tips 10 - 200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Pipette tips 100 - 1000 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Shake flasks (500 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Sterile filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Centrifuge (Falcon tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Echo 525 acoustic liquid handler</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">NanoDrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Set for eletrophoresis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Table centrifuge (Eppendorfs tubes)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:156px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pCSN067</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101748</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pRN1120</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 101750</td>
			<td>https://www.addgene.org/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">S. cerevisiae strain 
			CEN.PK113-7D</td>
			<td style="width:144px;">EUROSCARF collection</td>
			<td></td>
			<td>http://www.euroscarf.de</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crispr/cas12a multiplex genome editing of saccharomyces cerevisiae and the creation of yeast pixel art

Yüksek verimlilik, kullanım kolaylığı ve çok yönlülük kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromik tekrarlar/Crispr ilişkili protein 9 (Crispr/Cas9) sistemi, bir model, Saccharomyces cerevisiaegelişmiş genetik modifikasyon kolaylaştırdı Endüstriyel Biyoteknoloji içinde organizma ve beygir. Crispr ilişkili protein 12A (Cas12a), RNA destekli bir endonükleaz ile Cas9 'den ayırt edilen özelliklerle bu çalışmanın uygulandığı, daha da genom düzenleme amaçları için moleküler Toolbox genişletme. Crispr/Cas12a sisteminin bir yararı, tek bir transkripsiyonel üniteden (tek Crispr RNA (crrna) dizisi) ifade edilen birden fazla kılavuz Rnas ile Multiplex genom düzenlemede kullanılabilirler. Birden fazla heterolog genlerin Multiplex entegrasyonu için, tek bir crrna dizi yapısına göre birden fazla crrnas içeren Crispr/Cas12a sistemini kullanarak S. cerevisiae jenomunun bağımsız lokasyonuna yönelik bir protokol sunuyoruz. Önerilen yöntem, S. cerevisiae 'nin, tek crrna dizisini, transformant seçimi için kullanılabilecek bir Plasmid haline getirmek IÇIN, DNA parçalarının içinde vivo olarak yeniden kombinasyonunu gerçekleştirmesini ve donör DNA 'sının montajına yönelik yeteneğini kullanıyor. istenilen konumlarda genom entegre dizileri. Cas12a, tek crRNA dizisinin ifadesi üzerine amaçlanan pozisyonlarda S. cerevisiae genomunu kolaylaştırarak, seçiciyle önceden ifade edilir. Protokol, tek bir crRNA dizisi ve bağışçı DNA ifade kasetlerinin tasarımını ve inşası içerir ve benzersiz 50-BP DNA konnektörleri dizileri ve ayrı entegrasyon kanat DNA dizileri kullanımı yapma bir entegrasyon yaklaşımı kullanır, hangi basitleştirir standardizasyon ve modülarizasyon ile deneysel tasarım ve uygulama aralığını genişletir. Son olarak, biz inşa edildi farklı renkli karotenoid üreten maya suşları kullanarak bir akustik sıvı işleyici ile Maya piksel sanatı oluşturmak için basit bir teknik göstermektedir.

Crisrp/Cas12a kullanarak Multiplex genom düzenleme için protokol üç karotenoid üreten S. cerevisiae suşları crte, crtyb ve crti genler heterolog Rehberleri kullanarak ifade oluşturarak gösterilmiştir yüksek, orta ve düşük mukavemet: gerilme 1, 2 ve 3 sırasıyla (Tamamlayıcı tablo 3). Bu suşların inşası, genomik DNA 'da üç farklı lokasyona ( Şekil 2B'de gösterilmiştir) hedef almak için her bir gerginlik BAŞıNA üç bağışçı DNA ifadesi kasetleri ve altı Flanşlı bölge üretilmesi gerekir. Burada açıklandığı gibi, organizatör, açık okuma çerçevesi, Terminator ve iki bitişik 50-BP konnektörleri dizileri bir altın kapı klonlama reaksiyonu ile bir ifade kaseti içine monte edildi ve montaj PCR tarafından doğrulanmıştır (Şekil 3a). Tek crRNA dizisi sentetik bir DNA parçası olarak sipariş edildi ve PCR tarafından güçlendirilmiş (Şekil 3B). Tek crrna dizisi (Plasmid pRN1120) için alıcı plazmid EkoRI-HF ve Xhoı ile Doğrusallaştırılmış ve doğrusallaştırma Elektroforez (Şekil 3C) tarafından teyit edildi. Sunulan donör DNA ifadesi kasetleri ve yan bölgelerinin tasarım ve nükletotit dizileri, ek tablo 3 ve tamamlayıcı Masa 4' te gösterilir. Tek crRNA dizi ifade kasetleri serisi, Tamamlayıcı Tablo 1' de sağlanır. Tek crrna dizisinde yer alan mesafe tutucular işlevselliği bireysel crrnas19ile singleplex genom düzenleme ile önceden test edildi.
Cas12a kullanarak genom düzenlemenin verimliliği ilk önce dönüşümden sonra elde edilen renkli kolonilerin sayısına göre değerlendirildi (Tablo 1, Şekil 4). Üç inşa suşlarının düzenleme verimliliği% 50 ile% 94 arasında değişmektedir. Özellikle, gerinim oluşturmak için kullanılan ifade kasetleri giriş 1 en düşük düzenleme verimliliği gösterilir, muhtemelen donör DNA doğası nedeniyle neden (yani, bu ifade kasetleri kodlamak crte, Crtyb ve crti üç yüksek mukavemetli promotörler). Ikinci olarak, genomik DNA üzerinde amaçlanan loci üç donör DNA ifadesi kasetleri doğru entegrasyon PCR tarafından teyit edildi (Şekil 5). Primers, istenmeyen DNA 'nın doğru şekilde entegrasyonunun oluştuğu zaman PCR ürünlerinin elde edildiği şekilde tasarlandı. Her dönüşüm deneyi için, dönüşüm plakasının sekiz kolonisi seçilmiş ve test edildi ( Şekil 5' te sadece üçünün sunulmasını unutmayın). Genel olarak, 8 kolonilerin donör DNA, INT1 Locus crte donör DNA doğru entegrasyonu, INT2 Locus ve CRTI de INT3 Locus at crtyb test% >% 90 transformants doğrulandı. Bu sonuçlar, tek bir crRNA dizisi ile birlikte CRISPR/Cas12a sistemi gösterir, aynı anda birden çok loci S. cerevisiae genomu verimli çok katmanlı düzenleme sağlar.
Buna ek olarak, "Maya piksel sanatı" nın, renkli olmayan bir vahşi tip gerginliği ile birlikte inşa edilen üç karotenoid üreten suşları kullanarak yaratılmasını göstermekteyiz. Rosalind Franklin siyah ve beyaz bir resim başlayarak (Şekil 6a), 4-renkli resim (Şekil 6B) ve tespit listesi daha sonra bir agar Mikroplaka kullanarak dört farklı maya suşları nokta için kullanılan yaratıldı Akustik sıvı işleyici, Rosalind Franklin yüksek çözünürlüklü "Maya boyama" sonuçlanan (Şekil 6C, D, E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig1v5.jpg"> Şekil 1 : S. cerevisiae'de Crispr/Cas12a Multiplex genom düzenleme protokolünün iş akışı. İş akışı sunulan yöntemin önemli adımlarını içerir. Ayrıntılar için protokol konusuna bakın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig2.jpg"> Şekil 2 : Tek bir crRNA dizisi kullanarak CRISPR/Cas12a Multiplex genom düzenleme şeması. (A) tek crrna dizisi, Olgun formunda üç crRNAs ünitesinden oluşur, 23 BP kılavuz dizisi (renkli elmaslar) ile LbCas12a (gri kareler) için 20 BP doğrudan tekrar özel. Crrna dizisinin ifadesi SNR52 organizatör ve SUP4 Sonlandırıcı tarafından etkinleştirilir. S. cerevisiae 'nin bir Doğrusallaştırılmış pRN1120 ve pRN1120 (diyagonal çizgiler) ile Homoloji içeren tek crrna dizi ifade kaseti ile dönüşümü, ön ifade edilen hücrelerde dairesel bir Plasmid içine in vivo rekombinasyon sağlar LbCas12a. Tek crRNA dizisi daha sonra Cas12a tarafından işlenir. (B) CAS12A hedeflenen INT1, INT2 ve INT3 genomik hedef sitelere yönlendirilir ve çift sıkışmış kırmalar oluşturur. Dönüşüm karışımında, çevrelerden oluşan donör DNA 'Sı ve karotenoid gen ifade kaseti dahil edildi. Donör DNA meclisleri INT1 (crte), INT2 (crtyb) ve INT3 (crti) loci çevresindeki genomik DNA 'da, 50-BP homolog konnektörleri sıralarının varlığı nedeniyle in vivo rekombinasyon ile bir DNA uzatımı hedeflenmiştir. 5, A, B, C, D veya E. P1 – P3, farklı promotörler olarak belirtilir; T1 – T3, farklı sonlandırıcılar. Bu rakam, Verwaal ve ark. 201819' dan değiştirildi. Sentetik biyoloji açık dil (SBOL) görsel semboller40kullanılarak gösterilen genetik yapıları. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig3.jpg"> Şekil 3 : PCR genom düzenleme deneylerini doğruluyor. (A) birleştirilmiş donör DNA kasetlerini altın kapı klonlama reaksiyonları doğrulama. Elde edilen sonuçlar beklenen uzunlukları ile anlaşmadır. (B) tek crrna dizisinin PCR 'idir. (C) Plasmid pRN1120 linearizasyon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig4.jpg"> Şekil 4 : Multiplex genom düzenleme yaklaşımı kullanarak S. cerevisiae dönüşümleri plakaları. (A) Strain 1 ifade crte, crtyb ve crti üç güçlü Rehberleri (koyu turuncu koloniler). (B) Strain 2 ifade crte, crtyb ve crti üç orta mukavemetli Rehberleri (turuncu koloniler). (C) üç düşük mukavemetli promotörler (sarı koloniler) gelen crte, Crtyb ve crti 3 ifade strain. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig5.jpg"> Şekil 5 : PCR, genomik DNA içinde istenen loci 'de donör DNA ifadesi kasetlerini bütünleştirmeyi doğruluyor. (A) gerilimin üç koloninin doğrulanması 1. (B) 2. gerilimin üç koloninin doğrulanması. (C) 3. gerilimin üç koloninin doğrulanması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig5large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59350/59350fig6.jpg"> Şekil 6 : Rosalind Franklin Maya piksel sanatı. (A) şablon olarak kullanılan Rosalind Franklin 220 x 280 piksel siyah ve beyaz RGB fotoğraf. (B) Rosalind Franklin siyah ve beyaz fotoğrafın bilgisayar dönüşümü 4-renk 64 × 96 piksel listesi içine. (C) fotoğraf Maya piksel sanat 64 ile × 96 Maya kolonileri ile bir yakınlaştırılmış-bölümünde. (D) iki tam yetiştirilen plaka ile akustik bir sıvı işleyici fotoğrafı. (E) 64 ile tam yetiştirilen Mikroplaka fotoğraf × 96 Maya kolonileri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/59350fig6large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Gerilim 1</td>
			<td>Gerilim 2</td>
			<td>Gerilim 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Renkli koloniler</td>
			<td>16</td>
			<td>279</td>
			<td>220</td>
		</tr>
<tr>
<td>Beyaz koloniler</td>
			<td>16</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam koloniler</td>
			<td>32</td>
			<td>297</td>
			<td>238</td>
		</tr>
<tr>
<td>Verimli -liği</td>
			<td>50%</td>
			<td>94%</td>
			<td>92%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Multiplex genom düzenleme yaklaşımı etkinliğini düzenleme.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>crRNA dizi dizisia, b, c, d, e, f</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Catgtttgacagcttatcatcgataatccggagctagcatgcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcag Mehmet mehmet BIR de bu kadar çok zaman var........ BIR de O zaman, ben de bunu yaparım............ BIR de O zaman, ben de bır daha............ mustafa akgül................. (CTGGTGGGAGAGAAAGCTTATGAAatttctactaagtgtagatgtgccgtac) (GCCGGAGCCGACGGAatttctactaagtgtagattgcccctcttatacgattatattTT) hüseyin gülgücün-ben de bir daha... BIR daha DEĞIL, bır daha.......
</td>
		</tr>
<tr>
<td>a. Homoloji pRN1120 (kalın). b. SNR52 organizatör (italik). c. genomik hedef sıraları (altı çizili). d. doğrudan LbCas12a (italik, kalın) için özel tekrarlar Kılavuzu. e. SUP4 Sonlandırıcı (italik). f. Homoloji pRN1120 (kalın).</td>
		</tr>
</tbody></table>Tamamlayıcı Tablo 1: Plasmid pRN1120 ile Homoloji içeren LbCas12a için tek crRNA dizisi.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>Adı</td>
			<td>Sıraa</td>
			<td>Açıklamab</td>
			<td>Noktada kullanılır</td>
		</tr><tr><td>KC-101</td>
			<td>KıZ kız</td>
			<td>Tek crRNA dizisinin amplifikasyon için FW astar</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-102</td>
			<td>BIR daha yok</td>
			<td>Tek crRNA dizisinin amplifikasyon için RV astar</td>
			<td>2.1.4</td>
		</tr><tr><td>KC-103</td>
			<td>BIR daha yok.</td>
			<td>Bağlayıcı 5 ile donör DNA amplifikasyon için FW astar</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-104</td>
			<td>MUSTAFA akgül</td>
			<td>Bağlayıcı A ile donör DNA amplifikasyon için RV astar</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-105</td>
			<td>CGGATCGATGTACACAACCG</td>
			<td>Bağlayıcı B ile donör DNA amplifikasyonu için FW astar</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-106</td>
			<td>Kemal ÖZÇAKıR</td>
			<td>Bağlayıcı C ile donör DNA amplifikasyon için RV astar</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-107</td>
			<td>(Asam)</td>
			<td>Bağlayıcı D ile donör DNA amplifikasyon için FW astar</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-108</td>
			<td>AGGTACAACAAGCACGACCG</td>
			<td>Bağlayıcı E ile donör DNA amplifikasyon için RV astar</td>
			<td>3.6.1</td>
		</tr><tr><td>KC-109</td>
			<td>ÖZGÜL,</td>
			<td>Bağlantı 5 ' INT1 5 ' amplifikasyon için FW astar</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-110</td>
			<td>
Mustafa ŞASAK (TGGATATGCAAAGCGATTGGAA) oktay gıtcı ATTCC 'de</td>
			<td>Bağlantı 5 ' INT1 5 ' amplifikasyon için RV astar</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-111</td>
			<td>
GÜLLE BIR daha olmaz. caner aagcgttcctc Bu konuda</td>
			<td>FW astar INT1 3 ' amplifikasyon için bağlayıcı A</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-112</td>
			<td>(TGTCAACTGGAGAGCTATCG)</td>
			<td>Bağlantı A ile INT1 3 ' amplifikasyon için RV astar</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-113</td>
			<td>Bu BIR</td>
			<td>INT2 5 ' ' i bağlayıcı B ile amplifikasyon için FW astar</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-114</td>
			<td>
BIR daha. TGGGTGCAGTCGGTTGTGTACAT (CGATCCGcccttatcaaggatacc) GGTTG</td>
			<td>Bağlayıcı B ile INT2 5 ' amplifikasyon için RV astar</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-115</td>
			<td>
AKGCTTTCCGGCATCTTCCA (GACCACAGTATATCCATCCGCCT) (aktoprak) GGG</td>
			<td>FW astar INT2 3 ' amplifikasyon için bağlayıcı C ile</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-116</td>
			<td>BIR daha yok</td>
			<td>Bağlantı C ile INT2 3 ' amplifikasyon için RV astar</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-117</td>
			<td>(GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTG)</td>
			<td>INT3 5 ' ' i konnektörlü D ile amplifikasyon için FW astar</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-118</td>
			<td>
Gülsen aslan (Aktoprak) IlhanTaçoğlu AAGAACG ürünleri</td>
			<td>Bağlayıcı D ile INT3 5 ' amplifikasyon için RV astar</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-119</td>
			<td>
Emrah özsu BIR daha olmaz. (ADAPAZAS) (GTAC)</td>
			<td>FW astar INT3 3 ' amplifikasyon için konektör E</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-120</td>
			<td>GENÇKıZ çocuk</td>
			<td>RV astar ile INT3 3 ' amplifikasyon için konektör E</td>
			<td>4,4</td>
		</tr><tr><td>KC-121</td>
			<td>BIR daha yok</td>
			<td>Con5-crtE-conA entegrasyonu doğrulama için FW astar INT1 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-122</td>
			<td>(CACTGCTAACTACGTTTACTTC)</td>
			<td>Con5-crtE-conA entegrasyonu doğrulama için FW astar INT1 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-123</td>
			<td>CACTGGAACTTGAGCTTGAG</td>
			<td>INT2 5 ' için conB-crtYB-conC entegrasyonu doğrulama için FW primer</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-124</td>
			<td>Bu BILGI</td>
			<td>ConB-crtYB-conC entegrasyonunun doğrulanması için FW primer INT2 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-125</td>
			<td>CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC</td>
			<td>INT3 5 ' için conD-crtI-conE entegrasyonunun doğrulanması için FW astar</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-126</td>
			<td>ARCGGTAGGTGAAĞ</td>
			<td>INT3 3 ' ' e conD-crtI-conE entegrasyonunun doğrulanması için FW astar</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-127</td>
			<td>Bu konuda</td>
			<td>Con5-crtE-conA entegrasyonu doğrulama için RV astar INT1 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-128</td>
			<td>GTGTGCATGATCTGTGATAAC</td>
			<td>Con5-crtE-conA entegrasyonu doğrulama için RV astar INT1 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-129</td>
			<td>Bu BIR</td>
			<td>ConB-crtYB-conC entegrasyonunun doğrulanması için RV primer INT2 5 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-130</td>
			<td>CCAACGTGCCTTAAAGTCTG</td>
			<td>ConB-crtYB-conC entegrasyonunun doğrulanması için RV primer INT2 3 '</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-131</td>
			<td>(CCTTACCTTCTGGAGCAGCAG)</td>
			<td>INT3 5 ' için conD-crtI-conE entegrasyonunun doğrulanması için RV astar</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td>KC-132</td>
			<td>(CTGGTTACTTCCCTAAGACTG)</td>
			<td>INT3 3 ' için conD-crtI-conE entegrasyonunun doğrulanması için RV astar</td>
			<td>7.4.1</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>a. kalın diziler bağlayıcı sıraları gösterir. b. Ileri ve ters astarlar sırasıyla FW ve RV olarak belirlenir.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tamamlayıcı tablo 2: Primer dizileri.
<img alt="Supplementary Table 3" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable3.jpg"> Tamamlayıcı tablo 3: inşa edilmiş suşların tasarımı.
<img alt="Supplementary Table 4" src="/files/ftp_upload/59350/59350suptable4.jpg"> Tamamlayıcı Tablo 4: donör DNA ifadesi kasetleri ve pullanma bölgelerinin dizileri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59350/Suppl_Table_4.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art at JoVE.com

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a sistemi, tek bir crRNA dizisi ile birlikte aynı anda birden çok loci 'de S. cerevisiae genomunun verimli çok katmanlı düzenlemesini sağlar. Bu daha sonra Maya piksel sanatı oluşturmak için kullanılan karotenoid üreten maya suşları oluşturarak gösterilmiştir.

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome düzenleme Saccharomyces cerevisiae ve Maya Pixel Art oluşturulması

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Bu protokol, tek bir dönüşüm adımında farklı lokuslarda birden fazla ifade kaseti getirerek Saccharomyces cerevisiae'nin Multipleks Genom Düzenlemesi için yeni bir yöntem göstermektedir. Tek bir crRNA dizisini ifade etmek için bu klonlama ücretsiz plazmid montaj yaklaşımı, hızlı, verimli ve esnek genom düzenleme protokolüne yol açar. Serbest genomik loci üzerinde ücretsiz heterolog genler getirerek karotenoidler üretmek için yabani tip maya hücreleri tasarlayacağız.Tek crRNA dizisi, RNA polimeraz serbest organizatöründen ifade edilen ücretsiz tek tek crRNA'lardan oluşur. Cas12a, crRNA dizisini tek tek crRNA'lara dönüştürür. CRRNA'lar Cas12a'yı genomik DNA'daki hedef lokusa yönlendirir ve cas12a çift iplikçik kırıkları sunar.Aşağı doğru DNA parçaları in vivo rekombinasyon için yeniden birleşir ve genomik DNA'ya entegre. Protokolü gösteren bir doktora öğrencisi olan Klaudia Ciurkot olacak. Jeffery van Wijk, yardımcı bilim adamı.Ve Brenda Vonk, laboratuvarımızdan kıdemli doçent. Sentetik DNA'nın Multiplex Genom Düzenleme deneyleri için tek bir crRNA dizisi aldıktan sonra, PCR amplifikasyon karışımını hazırlayın ve diziyi amplifikasyon için termocycler'a yükleyin. PCR ürünlerini elektroforez ile analiz etmek için numuneleri 5 V/cm'de %0,8 agarose jel üzerinde 40 dakika çalıştırın.DNA merdivenini 100 10000 baz çiftlerinden oluşan DNA parçalarıyla yükleyin Sonra PCR ürünlerini üreticinin talimatlarına göre pcr arıtma kiti kullanarak arındırın. Maya dönüşümü için, 20 mL'lik maya ekstresi peptone dekstroz veya YEPD ortasını içeren 100 mL'lik bir şişede yabani tip mayanın önceden kızartılmasıyla başlar. Bir gecede kuluçka için, 30 santigrat derece, ve dakikada 250 rotasyonertesi sabah, bir gecede kültür öncesi maya hesaplanan hacmi ile taze YEPD orta 20 mL aşılamak.600 nanometre ile ölçülen 1.0 optik yoğunluk ulaşana kadar kültürü sallayarak bir kuluçka makinesine yerleştirin. Maya hücrelerini santrifüj le hasat edin. Maya hücreli peleti oda sıcaklığında 20 mL'lik demineralize suyla yıkayın ve ardından ek bir santrifüj edin.Lityum asetat Tris-EDTA çözeltisi 100 mikrolitre pelet resuspend ve bir mikrosantrifüj tüpü maya aktarın. Maya hücresi süspansiyonu ile beş mikrolitre tek iplikçikli taşıyıcı DNA ve bir mikrogram plazmid pCSN067'yi karıştırın. Daha sonra 600 mikrolitre polietilen glikol LiAc-TE çözeltisini numuneile karıştırın.Bir masa üstü ısı bloğunda 30 derece santigrat ve 450 prm maya hücreleri ve plazmid inkübün. Kuluçka sonunda 70 mL'lik dimetil sülfoksit ile dönüşüm çözeltisini karıştırın. Isı 42 derece santigrat su banyosunda 15 dakika boyunca karışımı şok.Karışımı 15 mL yuvarlak alt boruya aktarın. 30 santigrat derece ve 250 rpm bir gecede kuluçka için tüp e 10 mL YEPD ekleyin. Ertesi sabah, dönüştürülmüş hücreleri santrifüj le toplayın ve supernatantın son 200 mikrolitresi hariç hepsini aspire edin.Kalan supernatant dönüştürülmüş maya hücre pelet resuspend. Plaka 150 mikrolitre dönüşüm karışımı, ve 150 mikrolitre 20 kez seyreltme yepd dönüşüm karışımı kalan 50 mikrolitre, YEPD agar plakaları üzerinde, G418 litre başına 0.2 gram ile desteklenmektedir. 30 santigrat derecede 48 ila 72 saat sonra, G418'in 0,2 g/L'si ile desteklenen yeni bir YEPD agar plakası üzerinde yeniden streaking için tek bir dönüştürücü seçin.İkinci dönüşüm için, sadece gösterildiği gibi, 1.0 600 nanometre bir optik yoğunluğu kültürü büyümek. Ve bir mikrosantrifüj tüpüne 20 mikrolitre hücre ekleyin. Santrifüjden sonra hücre peletini 100 mikrolitre LiAc-TE çözeltisinde yeniden askıya alın ve ssDNA ekleyin.Ayrı bir tüpte, tek crRNA dizisinin bir mikrogramını, crRNA dizisi için doğrusallaştırılmış alıcı plazmidinin bir mikrogramını, her donör DNA'sının bir mikrogramını ve her bir yan bölgenin bir mikrogramını birleştirin. Daha sonra DNA karışımını yetkili maya hücrelerinin tüpüne aktarın ve ilk dönüşümde gösterildiği gibi ikinci dönüşümü tamamlayın. Ertesi sabah, santrifüj ile hücreleri toplamak ve supernatant küçük bir aliquot pelet resuspend.Sonra 150 mikrolitre dönüşüm karışımını plakalayın, ve YEPD ortamda dönüşüm karışımı 20 kez seyreltme 150 mikrolitre, YEPD agar plakaları üzerine 0.2 g/L G418 ile takviye, ve 0.2 g/L nourseothricin Sonra 48 ila 72 saat, 30 santigrat derece, tek renkli koloniler elde etmek için yeni bir YEPD plaka üzerinde yeniden streaking için tek renkli transformant seçin. Genom düzenleme verimliliğini belirlemek için, dönüşüm plakaları üzerindeki renkli ve beyaz kolonilerin sayısını sayın ve renkli kolonilerin sayısını toplam koloni sayısına bölün. Maya piksel sanat oluşturmak için, s.cerevisiae suşları üreten üç farklı renkli karotenoid ile YEPD orta 100 mL içeren bireysel 500 mL sallamak şişeleri aşılamak ve vahşi bir türü CEN.PK113-7D suşu. 250 rpm de sallayarak 30 santigrat derece bir gecede kültürleri kuluçka. Her gece kültürünün 0,5 mL'sini tüp başına 0,5 mL steril, iyonik olmayan yoğunluk gradyan ortam içeren tek tek tüplere aktarın ve çözeltileri girdap layarak kısaca karıştırın.Hücre süspansiyonlarını bireysel, nitelikli rezervuar 2'ye 3 kuyuya aktarın. Uygun nitelikli rezervuar kaynak plakasından 50 mL YEPD agar içeren 6144 kuyu luk hedef mikroplakaya her S.cerevisiae suşunun 25 nanolitresini tespit etmek için akustik sıvı işleyici aletinde 6RES_AQ_GPSA2 sıvı kalibrasyon ayarı olan bir csv dosyası kullanın. Tüm kuyular tespit edildiğinde, mikro plakayı 30 degress Santigrat'ta 48 saat kuluçkaya yatırın.Suşların renklerini yoğunlaştırmak için, agar plakalarını en az 72 saat boyunca 4 derecede saklayın. Rosalind Franklin'in bir resmi tabakta belirdi. Gösterildiği gibi, organizatör, açık okuma çerçevesi, terminatör ve iki bitişik 50 bp konektör dizileri bir Golden Gate klonlama reaksiyonu ile bir ifade kaset içine monte edilebilir ve PCR tarafından doğrulandı.TEK crRNA dizisinin PCR tarafından amplifikasyonundan sonra, tek crRNA dizisinin alıcı plazmidi elektroforez tarafından doğrusallaştırılı. Multipleks Genom Düzenleme verimliliği dönüşümden sonra renkli kolonilerin yüzdesi ile hesaplanabilir, ve PCR analizleri sonuçları ile amaçlanan genomik DNA konumlarında donör DNA entegrasyonu onaylamak. Örneğin, Rosalind Franklin'in siyah beyaz resminden başlayarak, dört renkli bir resim ve tespit listesi oluşturuldu ve daha sonra bir agar mikroplaka üzerindeki dört farklı maya suşlarını akustik sıvı işleyicisi aracılığıyla tespit etmek için kullanıldı, gösterildiği gibi, bilim adamının yüksek çözünürlüklü maya boyamaile sonuçlandı.Bu dönüşüm için, yeni hazırlanmış çözeltiler ve yüksek kalitede DNA parçaları kullanın. Bu yöntem, tanımlanmış silmelerin ve nokta mutasyonlarının genomik DNA'ya çok katlı olarak tanıtılması için de uygulanabilir. Buna ek olarak, CRISPR düzenleme deneyleri yapılabilir.Bu yöntem, yapılabilir eşzamanlı değişikliklerin sayısını artırmak için bir dizi içinde ücretsiz crRNA'lardan daha fazlasını tanıtmak için değiştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plazma Litografi Yüzey Desenlendirme Hücre Ağları Oluşturma

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Çok açılı Aydınlatma ve Pixel Super çözünürlüklü istihdam Lensfree On-chip Tomografik Mikroskopi

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Etanol ile lignoselüloz biyo dönüşümünü için Sağlam Pentoz-fermente Maya Evrimi Teknikleri

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

3D Bioprinting&#39;i Kullanan Sferoidlerin Mekanik Entegrasyonu Sergileyen Kalp Doku Oluşturma

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Verimli üretimi ve besleyici-Alerjik IPSCs CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak insan pankreas hücreleri düzenleme

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Meme kanseri arşivleme malzeme kullanarak bir Multiplex RNA temel ifade tahlil duruma getirilmesi

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Western Mısır Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embriyo mikroenjeksiyon Germline dönüştürme veya CRISPR/Cas9 genom düzenleme

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Net kalıp tabanlı yöntemi iskele ücretsiz üç boyutlu kalp doku oluşturma

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...