Name: isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry
Uploaded: 2019-05-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry at JoVE.com

وجاء الدعم لهذا العمل من قسم الأمراض الجلدية، ومركز غيتس للطب التجديدي في جامعة كولورادو وجامعة كولورادو (UC) مركز الأمراض الجلدية مورفولوجيا والنوى الفينوتين (NIAMS P30 AR057212). يقر المؤلفون بـ "مركز السرطان في جامعة كاليفورنيا" "الموارد المشتركة للسيتوميتري" ومنحة الدعم (NCI P30 CA046934) لتشغيل مقياس الخلايا الكتلي، وهم ممتنون لكارين هيلم وكريستين تشايلدز في صميم نصائحهم الخبيرة بشأن التدفق ومقياس الخلايا الشامل تقنيات.

وافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للالحيوانات في جامعة كولورادو أنشوتز على التجارب الحيوانية الموصوفة في هذا البروتوكول.
1 - الأعمال التحضيرية
<ol><li>تصميم لوحة الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية. استخدام الحرة على الانترنت لوحة تصميم البرمجيات12 وتشم?...

<ol>
	<li>Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+proliferation+markers:+PCNA,+Ki-67,+MCM-2+and+antiapoptotic+protein+Bcl-2+in+colorectal+cancer.">Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer.</a> Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).</li><li>Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+expression+is+superior+to+mitotic+count+and+novel+proliferation+markers+PHH3,+MCM4+and+mitosin+as+a+prognostic+factor+in+thick+cutaneous+melanoma.">Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma.</a> BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).</li><li>Ryan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+S6+signaling+is+associated+with+cell+survival+and+multinucleation+in+hyperplastic+skin+after+epidermal+loss+of+AURORA-A+Kinase.">Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase.</a> Cell Death &amp; Differentiation. , (2018).</li><li>Magaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunocytochemical+labeling+of+cell+and+tissue+samples+with+monoclonal+anti-bromodeoxyuridine.">Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+constancy+in+heteroploidy+and+the+stem+line+theory+of+tumors.">DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors.</a> Science. 174 (4010), 714-717 (1971).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+time-of-flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li><li>Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+for+analysis+of+immune+system+functional+states.">Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Brodie, T. M., Tosevski, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Dimensional+Single-Cell+Analysis+with+Mass+Cytometry.">High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+Stratum+Corneum+Desquamation+Are+the+Predominant+Effect+of+Impaired+ABCA12+Function+in+a+Novel+Mouse+Model+of+Harlequin+Ichthyosis.">Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis.</a> PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).</li><li>Zunder, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li><li>Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mass+cytometry+sample+cryopreservation+after+staining.">Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining.</a> Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).</li><li>Finck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45:+an+emerging+role+as+a+protein+tyrosine+phosphatase+required+for+lymphocyte+activation+and+development.">CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development.</a> Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).</li><li>Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS/FLI-1+induces+rapid+onset+of+myeloid/erythroid+leukemia+in+mice.">EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).</li><li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+and+Efficient+Method+to+Isolate+Primary+Human+Keratinocytes+from+Adult+Skin+Tissue.">A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue.</a> Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).</li><li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis.">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li><li>Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin.">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li><li>Fluhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anatomical+location+on+barrier+recovery,+surface+pH+and+stratum+corneum+hydration+after+acute+barrier+disruption.">Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption.</a> British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).</li><li>Webb, A., Li, A., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+and+phenotype+of+human+adult+keratinocyte+stem+cells+of+the+skin.">Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin.</a> Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).</li><li>Torchia, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+variant+of+Aurora+kinase+A+promotes+genomic+instability+leading+to+highly+malignant+skin+tumors.">A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors.</a> Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).</li><li>Frei, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).</li></ol>

يمكن إكمال البروتوكول الموضح في هذه الورقة في حوالي 8 ح. والنتيجة النهائية هي تعليق الخلايا المخصب في KCs التي يمكن تحليلها للتعبير عن البروتين بطريقة تعتمد على دورة الخلية. وقد حددت العديد من الدراسات السابقة طرق لعزل KCs من الجلد البشري والماوس16،25. وتشمل هذه ...

لا يزال ارتباط التعبير الجيني بمراحل دورة الخلايا يشكل تحدياً في تحليل النماذج الحيوانية لأمراض فرط التنسج مثل السرطان. ويتمثل جزء من هذا التحدي في الكشف المشترك عن البروتينات ذات الأهمية مع علامات الانتشار. يمكن العثور على الخلايا التكاثرية في مراحل دورة الخلايا المختلفة بما في ذلك G1، S، G2، وM. Ki67 هي واحدة من علامات الانتشار الأكثر استخداما ويتم التعبير عنها في جميع مراحل دورة الخلية. وقد استخدمت على نطاق واسع في تحليل كلمن الإنسان والأنسجة الماوس 1،2،3. ومع ذلك، مثل غيرها من علامات الانتشار العامة، Ki67 لا يميز مراحل دورة الخلية الفردية. نهج أكثر دقة يستخدم دمج النظائر النيوكليوتيد الثيميدين مثل بروموديوكسيوريبين (BrdU) في الخلايا التي تكرر بنشاط الجينوم (أي المرحلة S)4،5. عيب واحد لاستخدام النظائر النيوكليوتيد هو الحاجة إلى إدارتها للعيش الحيوانات قبل ساعات من التحليل. يتم الكشف عن Ki67 وBrdU عادة على أقسام الأنسجة الثابتة عن طريق استخدام الأجسام المضادة. وتتمثل إحدى مزايا هذا النهج في أنه يمكن التأكد من موقع POIs داخل بنية الأنسجة (على سبيل المثال، الطبقة القاعدية من البشرة الجلدية). ولا يتطلب هذا النهج أيضاً تفكك الأنسجة الذي قد يؤدي إلى تغييرات في التعبير الجيني. أحد العيوب هو أن تثبيت الأنسجة أو معالجة الأنسجة لOCT المجمدة أو تقسيم البارافين قد occlude أهداف الأجسام المضادة (أي، مستضدات). استرجاع المستضدات يتطلب عادة الحرارة أو هضم الأنسجة. كما يمكن أن يكون تحديد حجم التلطيخ أمراً صعباً. ويرجع ذلك إلى الاختلافات في تلطيخ، سمك القسم، وكشف إشارة، والتحيز المجرب. وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن عدد محدود من العلامات في وقت واحد في معظم التجهيزات المختبرية النموذجية. ومع ذلك، فإن نُهُج تلطيخ المضاعفات الأحدث تعد بالتغلب على هذه القيود؛ أمثلة هي التصوير قياس السيتومترية الجماعية وتضخيم إشارة التيراميد6،7.
قياس التدفق هو آخر التكنولوجيا القوية للكشف عن الخلايا المنتشرة. فإنه يسمح للكشف عن متعددة من علامات في نفس الخلايا ولكن يتطلب تفكك الأنسجة لمعظم أنواع الخلايا غير المكونة للدم. يتم تحليل الخلايا المتكاثرة بشكل روتيني باستخدام الأصباغ التي تربط الحمض النووي (على سبيل المثال، بروبيوديوم يوديد (PI))8. تدفق cytometry يسمح أيضا تحديد أكثر دقة من مراحل دورة الخلية عندما يقترن الكشف عن إدراج BrdU9. على الرغم من اتباع نهج قوي، BrdU / PI تدفق قياس السيتومترية لديها عيوبها. وهي غير قادرة على حل مرحلتي G2/M وG0/G1 دون إدراج أجسام مضادة خاصة بالمرحلة. ومع ذلك، فإن عدد الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها محدود بالفلورة الخلوية، والانتشار الطيفي لانبعاثات الفلوروفور، واستخدام ضوابط التعويض. هذا القيد علامات عليه أكثر تحديا وشاقة للكشف عن التعبير عن علامات دورة الخلية مع POIs. وهناك نهج أكثر سهولة هو استخدام قياس السيتومتري ة الشامل10،11. وتستخدم هذه التكنولوجيا الأجسام المضادة المترافقة المعدنية التي لها طيف كشف أضيق. مرة واحدة يتم تلوين الخلايا مع الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية، يتم تبخرها، والمعادن التي تم الكشف عنها عن طريق قياس الطيف الكتلي وقت الطيران (CyTOF). نظرًا لهذه الخصائص، يتيح قياس السيتومتري ة الكتلة الكشف المتعدد المضاعفات عن >40 علامة مختلفة باستخدام الأنظمة الأساسية الموجودة10و11 . وبالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن لعينات الباركود مع المعادن التي تؤدي إلى وفورات الأجسام المضادة الثمينة مع الحد من العينة إلى عينة تلطيخ تقلب. من ناحية أخرى، قياس السيتومتري ة الكتلة لديه العديد من العيوب. هناك عدد محدود من الأجسام المضادة الموسومة بالمعادن المتاحة تجاريا للخلايا المشتقة من الدم غير الدم. القياس الكمي لمحتوى الحمض النووي أقل حساسية مقارنة باستخدام أصباغ الحمض النووي الفلورية والقياس الخلوي الشامل لديه مجموعة ديناميكية منخفضة من الكشف عن إشارة بالمقارنة مع قياس تدفق الفلورة.
تم تصميم البروتوكول الموضح هنا لتحليل ديناميات دورة الخلية من الخلايا الكيراتينية المعزولة حديثا (KCs) من جلد الماوس وتميز خلية دورة تعبير البروتين محددة في هذه الخلايا باستخدام قياس الخلايا الشامل. يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضًا مع الخلايا المستزرعة أو تكييفه مع أنواع الخلايا الأخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1157px;" width="1159">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">12-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229512</td>
			<td style="width:368px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Intercalator solution</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201192A</td>
			<td>125 &#181;M - Ir intercalator solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:237px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:259px;">30525-89-4</td>
			<td>16 %&#160; PFA</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Strainer cap flow tubes</td>
			<td style="width:237px;">Fisher/Corning</td>
			<td style="width:259px;">352235</td>
			<td>35 &#181;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell sieve</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">22363547</td>
			<td>40 &#956;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell detatchment solution</td>
			<td style="width:237px;">CELLnTEC</td>
			<td style="width:259px;">CnT-ACCUTASE-100</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Iodine Solution</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher/Purdue</td>
			<td style="width:259px;">67618-151-17</td>
			<td>Betadine 7.5%-iodine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Barcode permeabilization buffer&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Barcodes</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">pH strips</td>
			<td style="width:237px;">EMD</td>
			<td style="width:259px;">9590</td>
			<td>colorpHast</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">DMEM</td>
			<td style="width:237px;">Hyclone</td>
			<td style="width:259px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:368px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Media</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-5-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Curved precision forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-7-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #7</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Calibration Beads</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201078</td>
			<td style="width:368px;">EQ Four Element Calibration Beads</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">HBSS</td>
			<td style="width:237px;">Gibco</td>
			<td style="width:259px;">14175-095</td>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Water</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">SH30538.03</td>
			<td style="width:368px;">Hyclone Molecular Biology grade water</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Iododeoxyuridine</td>
			<td style="width:237px;">&#160;Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I7125</td>
			<td>IdU</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cryo vials</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">366656PK</td>
			<td>internal thread</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201068</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Cell Staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix &#38; Perm buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201067</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix &#38; Perm buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix I buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201065</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix I buffer</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:237px;">Rockland</td>
			<td style="width:259px;">MB-008</td>
			<td>Metal free 10x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">isopropanol-freezing container</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">5100-0001</td>
			<td>Mr.Frosty</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">BP359-500</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Petri dish</td>
			<td style="width:237px;">Kord-Valmark</td>
			<td style="width:259px;">2900</td>
			<td>Supplied by Genesee 32-107&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">15 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">50 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">6-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cisplatin</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">479306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Dispase II</td>
			<td style="width:237px;">Sigma/Roche</td>
			<td style="width:259px;">4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">FBS</td>
			<td style="width:237px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:259px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining&#160; permeabilization buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:237px;">BD</td>
			<td style="width:259px;">309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Type IV Collagenase&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Worthington Bioscience</td>
			<td style="width:259px;">CLSS-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry

الهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن وقياس التغيرات في التعبير البروتين بطريقة تعتمد على دورة الخلية باستخدام خلايا واحدة معزولة عن البشرة من جلد الماوس. هناك سبع خطوات هامة: فصل البشرة عن الأدمة، وهضم البشرة، وتلطيخ مجموعات الخلايا الجلدية مع سيسبلاتين، والترميز عينة، وتلطيخ مع الأجسام المضادة المعدنية الموسومة لعلامات دورة الخلية والبروتينات من الفائدة، والكشف عن الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية عن طريق قياس الخلايا الشامل، وتحليل التعبير في مختلف مراحل دورة الخلية. ميزة هذا النهج على الأساليب النسيجية هي إمكانية تحليل نمط التعبير من > 40 علامات مختلفة في خلية واحدة في مراحل مختلفة من دورة الخلية. كما يسمح هذا النهج لتحليل الارتباط متعدد المتغيرات للتعبير البروتيني الذي هو أكثر قابلية للقياس الكمي من أساليب النسيج/التصوير. العيب في هذا البروتوكول هو أن هناك حاجة إلى تعليق الخلايا المفردة، مما يؤدي إلى فقدان معلومات الموقع التي يوفرها تلطيخ أقسام الأنسجة. وقد يتطلب هذا النهج أيضاً إدراج علامات إضافية لتحديد أنواع الخلايا المختلفة في حالات تعليق الخلايا الخام. تطبيق هذا البروتوكول واضح في تحليل نماذج أمراض الجلد فرط البلاستيك. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لتحليل نوع فرعي محدد من الخلايا (مثل الخلايا الجذعية) بإضافة أجسام مضادة خاصة بالنسب. ويمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول لتحليل خلايا الجلد في الأنواع التجريبية الأخرى.

ويبين الجدول 1 الغلة المتوقعة للخلايا وجدوى الأذن الفأرة البالغة (الشكل 1) وجلد حديثي الولادة في ظروف غير مرضية. ويبين الجدول أيضا بيانات تمثيلية للأراضي من خلفية مختلطة من C57/126. ومن المتوقع أن الجلد من سلالات أخرى من شأنه أن يؤدي إلى غلة الخلايا م?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry at JoVE.com

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

عزل وتلطيخ الخلايا الكيراتينية الجلد الماوس لدورة الخلية تحليل محدد للتعبير البروتين الخلوي عن طريق قياس الخلايا الشامل

يصف هذا البروتوكول كيفية عزل خلايا القرنية الجلدية من نماذج الماوس، ووصمة عار مع الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية، وتحليل الخلايا الملونة عن طريق قياس الخلايا الشاملة من أجل تحديد نمط التعبير من البروتينات ذات الأهمية في مراحل دورة الخلية المختلفة.

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

وهذا البروتوكول هام لسببين رئيسيين. رقم واحد، فإنه يسمح للمستخدم لتكون قادرة على تحديد حالات دورة الخلية من خلايا الجلد التي تم عزلها من نموذج حيواني. كما أنه يسمح لنا أن تكون قادرة على تحليل التعبير البروتين في المراحل المنفصلة من دورة الخلية.بالمقارنة مع الأساليب السابقة لتحديد انتشار الخلايا ، تسمح طريقتنا بتحديد أكثر دقة للمراحل المختلفة في دورة الخلية ، ويمكننا أيضًا تحليل أكثر من 40 علامة مختلفة في المراحل المختلفة لتقسيم الخلية. هذا يعزز إلى حد كبير من تطبيق وبراعة الأسلوب. يمكن استخدام هذا البروتوكول في أبحاث السرطان وفي أي نوع آخر من الأمراض حيث توجد حاجة لتحديد أنماط تعبير بروتينية محددة لدورة الخلايا.وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول إلى أنواع الخلايا الأخرى، وفي الكائنات الأخرى النموذجية. يجب أن تركز المرة الأولى للمستخدم على الحصول على أفضل نوعية إعداد الخلية ممكن. وهذا يتطلب معالجة في الوقت المناسب من الجلد التجريبي باستخدام الكواشف الطازجة، والحد الأدنى من الوقت هضم الأنسجة، والتخلص بعناية من المغرور بعد الطرد المركزي للحفاظ على سلامة وكمية الخلايا.للبدء، تصميم لوحة الأجسام المضادة الموسومة بالمعادن باستخدام برنامج تصميم لوحة مجانية عبر الإنترنت، كما هو موضح في المخطوطة. ثم قم بإعداد محلول مخزون IDU عن طريق حل مسحوق IDU عند 10 ملليغرام لكل ملليلتر في 0.1 هيدروكسيد الصوديوم العادي عند 60 درجة مئوية. بعد aliquoting حل الأسهم IdU في أنابيب microcentrifuge، تجميدها في ناقص 20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.قبل الاستخدام مباشرة، ضبط الرقم الH من محلول ادييو إلى 7.5 مع 12 حمض الهيدروكلوريك العادي، واختبار مع شريط الرقم الH على aliquot النبذ لضمان الحل هو في الرقم الH 7.5. لإعداد اثنين من حل إصلاح paraformaldehyde x ، والجمع بين خمسة ملليلتر من 10 × برنامج تلفزيوني ومليلتر واحد من 16 ٪ PFA مع 44 ملليلتر من نقية الجزيئية الصف المقطر المياه. لإعداد 100 مللولير سيسبلاتين الأسهم حل, حل 300.5 ملليغرام من مسحوق سيسبلاتين في 10 ملليلتر من DMSO.للتجارب التي سيتم استخدامها على مدى يوم واحد، وإعداد 10 ملللار سيسبلاتين حل العمل. وزن الفئران ومن ثم تحديد جرعة في 0.1 ملليغرام من IdU لكل غرام من وزن الجسم. إدارة الجرعة المحسوبة من IDU عن طريق حقن داخل الصفاق، وانتظر لمدة ساعتين قبل حصاد الخلايا.استخدم زوجًا من مقصات الصف الجراحي لإزالة أذن الماوس المُسَنََّن سابقًا في قاعدة الأذن جراحيًا. ضع الأذن على طبق بيتري جاف 100 ملليمتر. فصل بعناية الأمامي من الجلد الخلفي باستخدام الملقط غرامة لخلق جيب في منتصف أو حافة منطقة قطع، ثم سحب اللوحات الجلد اثنين بعيدا، والمضي قدما مع كل من الأمامي والخلفي جلود.ضع بعناية الجلود الأمامية والخلفية لأذن واحدة في بئر واحد من لوحة ثقافة 12 بئرًا ، مليئة بميليلتر واحد من محلول dispase/collagenase الطازج ، مع جانب الجلد من الجلد الذي يلمس الحل. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لهضم الجلد. ضع الأذن المهضمة أو جلد الوليد في طبق بيتري نظيف مع جانب البشرة لمس سطح الطبق.باستخدام ملقط، تسطيح الجلد وشريحة بلطف الأدمة قبالة البشرة من خلال العمل من المركز إلى الحواف في نمط دائري. مع ملقط، والاستيلاء على البشرة على حواف ورفع بلطف تشغيله عن طريق تقشير تشغيله قبالة سطح طبق بيتري. ضع البشرة بعناية على محلول انفصال الخلايا المدفأة في بئر واحد من الطبق.احتضان لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية أو 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدام ملقط العقيمة لفهم البشرة وفرك عن طريق سحب البشرة ضد الجزء السفلي من الطبق لتفكك الخلايا. إضافة ملليلتر واحد من DMEM تحتوي على 1٪ FBS، وتمرير من خلال منخل خلية ميكرومتر 40 في أنبوب جمع.شطف جيدا مع اثنين من المليلتر إضافية من DMEM وإضافة إلى تعليق الخلية. بعد الطرد المركزي في 120 مرات ز لمدة خمس دقائق، وpirate بعناية عظمى. Resuspend بيليه الخلية في 1-2 ملليلتر من DMEM تحتوي على 1٪ FBS، و بيليه الخلايا مرة أخرى كما كان سابقا.لتسمية الخلايا لتحديد الخلايا الحية والميتة، resuspend 1-3000000 خلية في ملليلتر واحد من DMEM تحتوي على 25 سيسبلاتين ميكرومولار واحتضان لمدة دقيقة واحدة. إخماد بواسطة الأنابيب مع حجم متساو من FBS. بعد الطرد المركزي في 120 مرة ز لمدة خمس دقائق، decant supernatant في الكأس التي تحتوي على التبييض المخفف، وعكس الأنابيب لاستنزاف الحل المتبقي على منشفة ورقية.إعادة تعليق بيليه الخلية في ملليلترين من برنامج تلفزيوني خالية من الكاتيوم، والطرد المركزي لهم مرة أخرى كما وصف سابقا. لإصلاح الخلايا، resuspend بيليه الخلية في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني خالية من الكاتيون. دوامة الخلايا تحت الطاقة المنخفضة المستمر وإضافة ملليلتر واحد من اثنين x PFA تثبيت العازلة قطرة من الحكمة.ضعه على منصة هزازة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق، بعناية طاردة من زان. غسل الخلايا مع مليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني خالية من الكاتيوم، والطرد المركزي مرة أخرى في ظل نفس الظروف، وتكرار خطوة الغسيل.وأخيرا ، resuspend بيليه في ملليلتر اثنين من الباريوم خالية من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق وdedeant بعناية فائقة. إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من واحد x تثبيت العازلة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة وتكرار الطرد المركزي.لغسل الخلايا، أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للباركود. أثناء الطرد المركزي للخلايا بمعدل 500 مرة ز لمدة خمس دقائق، قم بإعداد الباركود بإضافة 100 ميكرولترات من عازلة الباركود الباركود، واخلطها على الفور. Resuspend بيليه الخلية في 800 microliters من العازلة permeabilization الباركود.إضافة حل الباركود إلى الخلايا، مزيج، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق. غسل الخلايا في مليلتر من خلية تلطيخ العازلة والطرد المركزي مرة أخرى.المقبل، resuspend واحد إلى ثلاثة ملايين خلية في ملليلتر واحد من مستضد نووي تلطيخ حل العمل العازلة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق، بعناية طاردة من زان. إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من المستضد النووي تلطيخ عازلة permeabilization والطرد المركزي مرة أخرى.بعد تكرار إعادة التبجح والطرد المركزي، إعادة تعليق بيليه الخلية في وحدة التخزين المتبقية مع دوامة لطيف. أضف 50 ميكرولترات من كوكتيل الأجسام المضادة داخل الخلايا، واخلطها، وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. إضافة ملليلترين من خلية تلطيخ العازلة.أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في ظل نفس الظروف كما في الخطوة السابقة، وإزالة الفائق. إعادة تعليق بيليه في مليلترين من خلية تلطيخ العازلة، والطرد المركزي في 500 مرة ز لمدة خمس دقائق، وتكرار إعادة تعليق والطرد المركزي. إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من محلول التشابك، وتخزينها لمدة يوم إلى ثلاثة أيام في أربع درجات مئوية.بعد الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى، وغسل بيليه مع مليلتر اثنين من خلية تلطيخ العازلة، والطرد المركزي في ظل نفس الظروف، وإجراء اثنين من يغسل إضافية مع اثنين ملليلتر من الماء، مع نفس الطرد المركزي. Resuspend بيليه الخلية بتركيز مليون خلية لكل ملليلتر مع محلول خرز EQ المخفف ، ثم قم بتشغيل العينات على مقياس الخلايا الكتلي. يتم تحديد إنتاجية الخلايا المتوقعة و قابليتها للبقاء من أذن الماوس البالغة و جلد الوليد.يعتمد العائد التقريبي على مساحة الجلد. تعتبر بشرة الولدان اختيارًا أفضل للتجارب التي تتطلب أعدادًا أكبر من الخلايا. يتم عرض استراتيجية البوابات الأساسية لتحديد الخلايا السليمة والوازية والقابلة للحياة ، بعد التطبيع وdevolution بيانات قياس الخلايا الكتلية المك الشريطية.قد تكون النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة مؤشراً على نوعية الخلايا أو حالتها قبل تلطيخها. تظهر أيضًا الاختلافات في قابلية البقاء بين خلايا سرطانية مُزَدَّمة مقابل خلايا الأذن الماوس المعزولة. تم اِسَرَد الخلايا القابلة للحياة على طول الحدث مقابل CD45 لاستبعاد خلايا الدم.إدراج علامات النسب يسمح لاختيار مجموعات الخلايا ذات الأهمية في مراحل دورة الخلية المختلفة. يتم الحصول على التشكيل الجانبي لدورة الخلية الأساسية عن طريق الكشف عن BrdU مقابل PI في عملية استئصال الخلايا القائمة على الفلورسنت. ومع ذلك، فإن إدراج علامات الانتشار الأخرى ذات القياس الخلوي الكتلي، يسمح بتحديد أكثر دقة لمراحل دورة الخلية.باتباع هذا النهج، يمكن إنشاء ملفات تعريف دورة الخلية لأنواع الخلايا المختلفة أو الظروف التجريبية، مثل ملفات تعريف لـ CD45 سالب مقابل الخلايا الإيجابية CD45 من نفس التجربة. وفي مثال آخر، كشف تحليل العلامات التي تحدد مسارات إشارات EGFR وmTOR PI3K في مرحلة G-One، عن ملامح تعبيرية مماثلة في الخلايا السلبية CD45، كما تظهر في الخلايا الإيجابية CD45، الموضحة باللون الأزرق. يتطلب استئصال الخلايا الشامل الكثير من الخلايا عالية الجودة.إذا كان المستخدم مهتماً بـ مجموعة خلايا نادرة، قد تكون هناك حاجة إلى أعداد أكبر من الخلايا. يمكن استخدام الخلايا الحية المعزولة لتحليل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ، والدراسات الكيميائية الحيوية ، أو يمكن استخدامها في زراعة الأنسجة قبل التثبيت والتلطخ للخلايا الكتلة. يجب على المستخدم استخدام معدات الحماية الشخصية ومجلس الوزراء السلامة عند الضرورة، عند العمل مع paraformaldehyde، حمض الهيدروكلوريك، أو هيدروكسيد الصوديوم.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D عضوي النمط المشارك الثقافة نموذج دعم النخاع التوتة الظهارية تكاثر الخلايا، التمايز ومختلط التعبير الجيني

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

جيل المعدلة وراثيا الثقافات الجلد الميتة عضوي عن طريق الأدمة الإنسان

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

خطوة محددة الفرز ماوس Spermatids بواسطة التدفق الخلوي

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

عزل بصيلات الشعر الخلايا الجذعية والخلايا الكيراتينية البشرة من الجلد الظهرية ماوس

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

تحديد أسلاف ريدثروميلويد وذريتهم في الجنين الماوس عن طريق التدفق الخلوي

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

جيل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

أسلوب مبسط وفعال لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

الأرقاء أعاده برمجه الخلايا الليفية البشرية عن طريق التعبير القسري من عوامل النسخ

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...