Name: isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry
Uploaded: 2019-05-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry at JoVE.com

Støtte til dette arbejde kom fra Department of Dermatology, Gates Center for regenerativ medicin på University of Colorado og University of Colorado (UC) hudsygdom Center morfologi og Phenotyping kerner (NIAMS P30 AR057212). Forfatterne anerkender UC Cancer Center flow cytometry Shared Resource og support Grant (NCI P30 CA046934) for driften af Mass flowcytometer og er taknemmelig for Karen Helm og Christine Childs i kernen for deres ekspertrådgivning om flow og masse cytometriske Teknikker.

University of Colorado Anschutz Medical campus ' institutionelle Dyrebehandlings-og anvendelses udvalg godkendte de dyreforsøg, der er beskrevet i denne protokol.
1. præparater
<ol><li>Design en metal-Tagged antistof panel. Brug den gratis online panel design software12 og omfatter 127iododeoxyuridine (IDU), 164dy (dysprosium) mærket anti-CCNB1 (cyclin B1), 175Lu (lutetium) fosfo enheder (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3), og <sup...

<ol>
	<li>Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+proliferation+markers:+PCNA,+Ki-67,+MCM-2+and+antiapoptotic+protein+Bcl-2+in+colorectal+cancer.">Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer.</a> Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).</li><li>Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+expression+is+superior+to+mitotic+count+and+novel+proliferation+markers+PHH3,+MCM4+and+mitosin+as+a+prognostic+factor+in+thick+cutaneous+melanoma.">Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma.</a> BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).</li><li>Ryan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+S6+signaling+is+associated+with+cell+survival+and+multinucleation+in+hyperplastic+skin+after+epidermal+loss+of+AURORA-A+Kinase.">Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase.</a> Cell Death &amp; Differentiation. , (2018).</li><li>Magaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunocytochemical+labeling+of+cell+and+tissue+samples+with+monoclonal+anti-bromodeoxyuridine.">Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+constancy+in+heteroploidy+and+the+stem+line+theory+of+tumors.">DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors.</a> Science. 174 (4010), 714-717 (1971).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+time-of-flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li><li>Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+for+analysis+of+immune+system+functional+states.">Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Brodie, T. M., Tosevski, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Dimensional+Single-Cell+Analysis+with+Mass+Cytometry.">High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+Stratum+Corneum+Desquamation+Are+the+Predominant+Effect+of+Impaired+ABCA12+Function+in+a+Novel+Mouse+Model+of+Harlequin+Ichthyosis.">Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis.</a> PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).</li><li>Zunder, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li><li>Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mass+cytometry+sample+cryopreservation+after+staining.">Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining.</a> Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).</li><li>Finck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45:+an+emerging+role+as+a+protein+tyrosine+phosphatase+required+for+lymphocyte+activation+and+development.">CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development.</a> Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).</li><li>Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS/FLI-1+induces+rapid+onset+of+myeloid/erythroid+leukemia+in+mice.">EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).</li><li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+and+Efficient+Method+to+Isolate+Primary+Human+Keratinocytes+from+Adult+Skin+Tissue.">A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue.</a> Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).</li><li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis.">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li><li>Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin.">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li><li>Fluhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anatomical+location+on+barrier+recovery,+surface+pH+and+stratum+corneum+hydration+after+acute+barrier+disruption.">Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption.</a> British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).</li><li>Webb, A., Li, A., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+and+phenotype+of+human+adult+keratinocyte+stem+cells+of+the+skin.">Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin.</a> Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).</li><li>Torchia, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+variant+of+Aurora+kinase+A+promotes+genomic+instability+leading+to+highly+malignant+skin+tumors.">A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors.</a> Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).</li><li>Frei, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).</li></ol>

Protokollen, der er skitseret i dette dokument, kan udfyldes i ca. 8 timer. Slutresultatet er en suspension af celler beriget i KCs, der kan analyseres for protein ekspression i en celle cyklus-afhængig måde. Flere tidligere undersøgelser har skitseret metoder til at isolere KCS fra menneske og mus hud16,25. Disse undersøgelser omfatter også protokoller for isolering af KCs til strømnings cytometri26. Der er imidlertid ikke tidligere...

Korrelation af genekspression med celle cyklus faser er fortsat en udfordring i analysen af dyremodeller af hyperplastiske sygdomme som kræft. En del af denne udfordring er co-påvisning af proteiner af interesse (POI) med markører for spredning. Proliferative celler kan findes i forskellige celle cyklus faser herunder G1, S, G2, og M. Ki67 er en af de mest almindeligt anvendte markører for spredning og udtrykkes i alle faser af cellen cyklus. Det er blevet flittigt anvendt i analysen af både humane og mus væv1,2,3. Men ligesom andre generelle spredning markører, Ki67 ikke skelne individuelle celle cyklus faser. En mere præcis tilgang bruger inkorporering af thymidinnukleotid analogerne som bromodeoxyuridine (brdu) i celler, der aktivt Repliker deres genomet (dvs. S-fase)4,5. En ulempe ved brugen af nukleotidanaloner er behovet for at administrere dem til levende dyr timer før analyse. Ki67 og BrdU er almindeligt detekteret på faste vævs sektioner ved brug af antistoffer. En fordel ved denne fremgangsmåde er, at placeringen af POI'er kan fastslås inden for vævs arkitekturen (f. eks. det basale lag hud epidermis). Denne fremgangsmåde kræver heller ikke vævs dissociation, der kan føre til ændringer i genekspression. En ulempe er, at vævs fiksering eller behandling af vævet til OLT-frosset eller paraffin-skæring kan medføre antistofmål (dvs. antigener). Genfinding af antigener kræver typisk varme-eller vævs fordøjelse. Kvantificering af farvnings intensiteter kan også være udfordrende. Dette skyldes variationer i farvning, snittykkelse, signaldetektering, og eksperimententer bias. Desuden kan et begrænset antal markører detekteres samtidigt i de fleste typiske laboratorie opsætninger. Endnu, nyere multiplex farvning tilgange lover at overvinde disse begrænsninger; Eksempler herpå er billedbehandlings massecytometri og tyramid-signal forstærkning6,7.
Flow cytometri er en anden kraftfuld teknologi til at detektere prolifererende celler. Det giver mulighed for multiplex påvisning af markører i de samme celler, men kræver vævs dissociation for de fleste ikke-hæmatopoietiske celletyper. Analyse af prolifererende celler sker rutinemæssigt ved brug af farvestoffer, der binder DNA (f. eks Propidium iodide (PI))8. Flowcytometri giver også mulighed for en mere præcis bestemmelse af celle cyklus faser, når det kombineres med påvisning af BrdU inkorporering9. Selv om en stærk tilgang, brdu/pi flow flowcytometri har sine ulemper. Det er ikke i stand til at løse de G2/M og G0/G1 faser uden inddragelse af fase-specifikke antistoffer. Antallet af antistoffer, der kan anvendes, er dog begrænset af cellulær autofluorescens, spektral afsmittende virkninger af fluoroforet-emissioner og brug af kompensations kontrol. Denne begrænsning Marcus det mere udfordrende og omstændelig at co-detektere udtrykket af celle cyklus markører med POI'er. En mere facile tilgang er at bruge massecytometri10,11. Denne teknologi bruger metal konjugeret antistoffer, der har en smallere detekterings spektrum. Når cellerne er plettet med metal mærkede antistoffer, er de fordampet, og metallerne detekteres ved flowcytometri Time-of-Flight (cytof) massespektrometri. På grund af disse egenskaber muliggør massecytometri multiplex-detektion af > 40 forskellige markører ved hjælp af eksisterende platforme10,11. Desuden er det muligt at stregkode prøver med metaller, der resulterer i besparelser af dyrebare antistoffer og samtidig reducere prøve-til-prøve farvning variation. På den anden side har masse cytometri flere ulemper. Der er et begrænset antal kommercielt tilgængelige metal mærkede antistoffer for ikke-blod afledte celler. Kvantificering af DNA-indholdet er mindre følsomt sammenlignet med brugen af fluorescerende DNA-farvestoffer, og massecytometri har et reduceret dynamisk spektrum af signaldetektering i forhold til fluorescens flow cytometri.
Den protokol, der er beskrevet her, er designet til at analysere celle cyklus dynamik fra nyligt isolerede keratinocytter (KCs) fra mus hud og karakterisere celle cyklus specifikke protein udtryk i disse celler ved hjælp af massecytometri. Denne protokol kan også bruges med dyrkede celler eller tilpasset andre celletyper.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1157px;" width="1159">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">12-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229512</td>
			<td style="width:368px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Intercalator solution</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201192A</td>
			<td>125 &#181;M - Ir intercalator solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:237px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:259px;">30525-89-4</td>
			<td>16 %&#160; PFA</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Strainer cap flow tubes</td>
			<td style="width:237px;">Fisher/Corning</td>
			<td style="width:259px;">352235</td>
			<td>35 &#181;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell sieve</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">22363547</td>
			<td>40 &#956;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell detatchment solution</td>
			<td style="width:237px;">CELLnTEC</td>
			<td style="width:259px;">CnT-ACCUTASE-100</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Iodine Solution</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher/Purdue</td>
			<td style="width:259px;">67618-151-17</td>
			<td>Betadine 7.5%-iodine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Barcode permeabilization buffer&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Barcodes</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">pH strips</td>
			<td style="width:237px;">EMD</td>
			<td style="width:259px;">9590</td>
			<td>colorpHast</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">DMEM</td>
			<td style="width:237px;">Hyclone</td>
			<td style="width:259px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:368px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Media</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-5-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Curved precision forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-7-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #7</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Calibration Beads</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201078</td>
			<td style="width:368px;">EQ Four Element Calibration Beads</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">HBSS</td>
			<td style="width:237px;">Gibco</td>
			<td style="width:259px;">14175-095</td>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Water</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">SH30538.03</td>
			<td style="width:368px;">Hyclone Molecular Biology grade water</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Iododeoxyuridine</td>
			<td style="width:237px;">&#160;Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I7125</td>
			<td>IdU</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cryo vials</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">366656PK</td>
			<td>internal thread</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201068</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Cell Staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix &#38; Perm buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201067</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix &#38; Perm buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix I buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201065</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix I buffer</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:237px;">Rockland</td>
			<td style="width:259px;">MB-008</td>
			<td>Metal free 10x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">isopropanol-freezing container</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">5100-0001</td>
			<td>Mr.Frosty</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">BP359-500</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Petri dish</td>
			<td style="width:237px;">Kord-Valmark</td>
			<td style="width:259px;">2900</td>
			<td>Supplied by Genesee 32-107&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">15 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">50 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">6-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cisplatin</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">479306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Dispase II</td>
			<td style="width:237px;">Sigma/Roche</td>
			<td style="width:259px;">4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">FBS</td>
			<td style="width:237px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:259px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining&#160; permeabilization buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:237px;">BD</td>
			<td style="width:259px;">309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Type IV Collagenase&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Worthington Bioscience</td>
			<td style="width:259px;">CLSS-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry

Målet med denne protokol er at detektere og kvantificere ændringer i protein ekspression i en celle cyklus-afhængig måde ved hjælp af enkeltceller isoleret fra epidermis af mus hud. Der er syv vigtige trin: adskillelse af epidermis fra dermis, fordøjelsen af epidermis, farvning af epidermal cellepopulationer med Cisplatin, prøve barkodning, farvning med metal mærkede antistoffer for celle cyklus markører og proteiner af interesse, påvisning af metal mærkede antistoffer ved massecytometri og analyse af ekspression i de forskellige celle cyklus faser. Fordelen ved denne tilgang over histologiske metoder er potentialet til at assay udtryks mønsteret af > 40 forskellige markører i en enkelt celle i forskellige faser af cellecyklussen. Denne fremgangsmåde giver også mulighed for multivariat korrelationsanalyse af protein ekspression, der er mere kvantificerbare end histologiske/billedbehandlings metoder. Ulempen ved denne protokol er, at en suspension af enkeltceller er nødvendig, hvilket resulterer i tab af lokaliseringsoplysninger fra farvning af vævs sektioner. Denne fremgangsmåde kan også kræve medtagelse af yderligere markører for at identificere forskellige celletyper i rå celle suspensioner. Anvendelsen af denne protokol er tydelig i analysen af hyperplastiske hudsygdoms modeller. Desuden kan denne protokol tilpasses til analyse af specifikke undertyper af celler (f. eks. stamceller) ved tilsætning af Lineage specifikke antistoffer. Denne protokol kan også tilpasses til analyse af hudceller i andre forsøgs arter.

Tabel 1 viser de forventede celle udbytter og levedygtighed fra voksne mus øre (figur 1) og neonatal hud under ikke-patologiske forhold. Tabellen viser også repræsentative data for dyr fra en blandet C57/126 baggrund. Det forventes, at huden af andre stammer ville resultere i lignende celle udbytter og viabilities. Det omtrentlige udbytte afhænger af hudens overfladeareal og indikerer, at neonatal hud ville være et bedre valg til eksperi...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry at JoVE.com

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolering og farvning af mus hud keratinocytter for celle cyklus specifik analyse af cellulært protein ekspression ved Massecytometri

Denne protokol beskriver, hvordan man isolerer hudens keratinocytter fra musemodeller, til farvning med metal mærkede antistoffer, og til at analysere farvede celler ved massecytometri for at profilere udtryks mønstret af proteiner af interesse i de forskellige celle cyklus faser.

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Denne protokol er vigtig af to hovedårsager. Nummer et, det giver en bruger mulighed for at være i stand til at bestemme celle cyklus stater af hudceller, der er blevet isoleret fra et dyr model. Det giver os også mulighed for at være i stand til at analysere proteinudtryk i de diskrete faser af cellecyklussen.Sammenlignet med tidligere metoder til bestemmelse af cellespredning tillader vores metode en mere præcis bestemmelse af de forskellige faser i cellecyklussen, og vi kan også analysere større end 40 forskellige markører i de forskellige faser af celledelingen. Dette i høj grad øger anvendelsen og alsidigheden af metoden. Denne protokol kan anvendes i kræftforskning og i enhver anden form for sygdom, hvor der er behov for at bestemme cellecyklus specifikke proteinudfoldelsesmønstre.Desuden kan denne protokol ændres til andre celletyper og i andre modelorganismer. Første gang brugeren bør fokusere på at få den bedste kvalitet celle forberedelse muligt. Dette kræver rettidig behandling af eksperimentel hud ved hjælp af friske reagenser, minimal vævs fordøjelsestid og omhyggelig bortskaffelse af supernatanten efter centrifugering for at bevare cellernes integritet og mængde.Til at begynde, designe en metal-tagged antistof panel ved hjælp af en gratis online panel design software, som beskrevet i manuskriptet. Derefter forberede en IdU lager opløsning ved at opløse IdU pulver ved 10 mg pr. milliliter i 0,1 normal natriumhydroxid ved 60 grader Celsius. Efter at have aliquoting IdU lageropløsning i mikrocentrifuge rør, fryse dem ved minus 20 grader Celsius for langtidsopbevaring.Umiddelbart før brug justeres pH-chloropløsningens pH-værdi til 7,5 med 12 normale saltsyresyrer, og der testes med en pH-strimmel på en kasseret aliquot for at sikre, at opløsningen er ved pH 7.5. For at forberede en to x paraformaldehydfastgørelsesopløsning skal du kombinere fem milliliter 10 x PBS og en milliliter 16% PFA med 44 milliliter rent molekylært destilleret vand. For at forberede 100 millimolar cisplatin lager opløsning, opløses 300,5 milligram cisplatin pulver i 10 milliliter DMSO.For forsøg, der skal anvendes over en dag, forberedes en 10 millimolar cisplatin-arbejdsløsning. Vejer mus og derefter bestemme en dosis på 0.1 milligram IdU pr gram kropsvægt. Den beregnede dosis af IDU administreres ved en intraperitoneal injektion, og vent i to timer, før cellerne høstes.Brug et par kirurgiske grade saks til kirurgisk fjerne øret af den aflivede mus tidligere injiceres med IdU i bunden af øret. Placer øret på en tør 100 millimeter petriskål. Fjern forsigtigt den forreste fra den bageste hud ved hjælp af fine kraftærkt til at skabe en lomme i midten eller kanten af det afskårne område, træk derefter de to hudklapper fra hinanden, og fortsæt med både den forreste og bageste skind.Placer forsigtigt den forreste og bageste skind på det ene øre i en brønd af en 12-brønd kultur plade, fyldt med en milliliter frisk-forberedt dispase / kollagenase opløsning, med derma side af huden rører opløsningen. Inkubere ved 37 grader Celsius i en time for at fordøje huden. Placer den fordøjede øre eller neonatal hud i en ren petriskål med epidermis side rører overfladen af skålen.Brug snævler, flade ud huden og forsigtigt skubbe dermis off epidermis ved at arbejde fra midten til kanterne i et cirkulært mønster. Med tæcener, grab epidermis på kanterne og forsigtigt løfte den ud ved at skrælle det ud af overfladen af petriskålen. Placer forsigtigt epidermis på præ-opvarmet celle udstationering løsning i en brønd af en plade.Inkuberes i fem minutter ved 37 grader Celsius eller 20 minutter ved stuetemperatur. Brug sterile kraftbecer til at gribe epidermis og krat ved at trække epidermis mod bunden af skålen for at adskille celler. Der tilsættes en milliliter DMEM, der indeholder 1%FBS, og passere gennem en 40 mikrometercellesele i et opsamlingsrør.Skyl godt med yderligere to milliliter DMEM og tilsæt til celleaffjedringen. Efter centrifugering ved 120 gange g i fem minutter, omhyggeligt aspirere supernatant. Resuspend cell pellet i en til to milliliter DMEM indeholder 1%FBS, og pellet cellerne igen som tidligere.For at mærke celler til bestemmelse af levende og døde celler, resuspend en til tre millioner celler i en milliliter DMEM indeholder 25 mikromolar cisplatin og inkubere i et minut. Dæmp ved pipettering med en tilsvarende mængde FBS. Efter centrifugering ved 120 gange g i fem minutter dekanteres supernatanten i et bægerglas, der indeholder fortyndet blegemiddel, og rørene inverteres for at dræne den resterende opløsning på en køkkenrulle.Opsplitning af cellepellet i to milliliter bariumteringsfri PBS, og centrifuge dem igen som tidligere beskrevet. For at fikse cellerne skal cellepellet resuspenderes i en milliliter bariumkationsfri PBS. Vortex cellerne under kontinuerlig lav effekt og tilsæt en milliliter af de to x PFA fiksering buffer drop-wise.Placer på en gyngeplatform og inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter. Efter centrifugering ved 500 gange g i fem minutter, forsigtigt dekantere supernatant. Cellerne vaskes med to milliliter bariumkationsfri PBS, centrifugere under de samme betingelser, og vasktrinnet gentages.Endelig skal pelleten resuspeneres i to milliliter bariumkationsfri PBS. Centrifuge cellerne ved 500 gange g i fem minutter og forsigtigt dekantere supernatant. Cellerne opsaltres igen i en milliliter af en x fikseringsbuffer, og inkuberes ved stuetemperatur i 10 minutter, og centrifugering gentages.For at vaske cellerne, tilføje en milliliter stregkode permeabilization buffer. Under celle centrifugering ved 500 gange g i fem minutter, forberede stregkoder ved at tilføje 100 mikroliter af stregkode permeabilization buffer til dem, og bland straks. Resuspend cell pellet i 800 mikroliter af stregkode permeabilization buffer.Tilføj stregkodeopløsning til cellerne, bland og inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter. Centrifuge ved 500 gange g i fem minutter. Cellerne vaskes i to milliliter cellefarvningsbuffer og centrifugering igen.Dernæst resuspenderet en til tre millioner celler i en milliliter nukleare antigen farvning buffer arbejder løsning, og inkubere ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter centrifugering ved 500 gange g i fem minutter, forsigtigt dekantere supernatant. Resuspend cellerne i en milliliter nukleare antigen farvning permeabilisering buffer og centrifuge igen.Efter gentagelse resuspension og centrifugering, resuspend cell pellet i restvolumen med blid vortexing. Tilsæt 50 mikroliter intracellulær antistof cocktail, mix, og inkubere ved stuetemperatur i 45 minutter. Tilføj to milliliter cellefarvningsbuffer.Centrifuge igen under de samme betingelser som i det foregående trin, og fjern supernatanten. Pelletsuspendrer pelletet igen i to milliliter cellefarvningsbuffer, centrifuge ved 500 gange g i fem minutter, og resuspendationen og centrifugeringn gentages. Opslæm cellerne i en milliliter intercalation løsning, og opbevares i en til tre dage ved fire grader Celsius.Efter centrifugering af cellerne igen vaskes pellet med to milliliter cellefarvningsbuffer, centrifuge under samme betingelser, og der udføres yderligere to vaske med to milliliter vand med samme centrifugering. Opslæm cellepelletet igen i en koncentration på en million celler pr. milliliter med fortyndet EQ-perleopløsning, og udtjen derefter prøverne på massecytometeret. Forventede celleudbytte og levedygtighed fra voksen mus øre og neonatal hud bestemmes.Det omtrentlige udbytte afhænger af hudens overfladeareal. Neonatal hud er et bedre valg til eksperimenter, der kræver et større antal celler. Den grundlæggende gating strategi for at vælge for intakte, enkelt, og levedygtige celler, efter normalisering og deconvolution af stregkodede masse cytometri data, vises.Procentdelen af levedygtige celler kan være tegn på cellernes kvalitet eller tilstand før farvning. Forskelle i levedygtighed mellem dyrkede karcinomceller versus isolerede museøreceller vises også. Levedygtige celler blev gated på begivenheden længde versus CD45 at udelukke hæmatopoietiske celler.Medtagelsen af afstamningsmarkører giver mulighed for udvælgelse af cellepopulationer af interesse i forskellige cellecyklusfaser. Den grundlæggende cellecyklusprofil opnås ved påvisning af BrdU versus PI i fluorescerende-baseret flowcytometri. Inddragelse af andre spredningsmarkører med massecytometri giver imidlertid mulighed for en mere præcis identifikation af cellecyklusfaser.Efter denne fremgangsmåde kan cellecyklusprofiler konstrueres til forskellige celletyper eller eksperimentelle tilstande, såsom profilerne for CD45 negative versus CD45 positive celler fra det samme eksperiment. I et andet eksempel afslørede analyse af markører, der definerer EGFR- og mTOR PI3K-signalvejene i G-1-fasen, lignende udtryksprofiler i CD45-negative celler, vist med orange og CD45-positive celler, vist med blåt. Massecytometri kræver en masse celler af høj kvalitet.Hvis en bruger er interesseret i en sjælden cellepopulation, kan der være behov for et højere antal celler. Isolerede levende celler kan anvendes til DNA- eller RNA-analyse, biokemiske undersøgelser eller kan anvendes i vævskulturen forud for fikseringen og farvningen for massecytometri. Brugeren skal bruge personligt beskyttelsesudstyr og et sikkerhedsskab, når det er nødvendigt, når der arbejdes med paraformaldehyd, saltsyre eller natriumhydroxid.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D organotypisk co-kultur Model Støtte medullær thymusepitelmonolag celleproliferation, differentiering og Promiskuøs Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generering af genetisk modificerede Organotypiske Skin Cultures Brug devitaliseret Menneskelig Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Trin-specifik Sortering af Mouse spermatider ved flowcytometri

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse af Protein Expression til Studieinformationen Lineage Specification i Mouse præimplantationsperioden Embryoner

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Isolering hårsæk Stamceller og epidermiskeratinocytter fra Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identifikation af erythromyeloidprogenitorer og deres afkom i musembryoen ved flowcytometri

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generation og dyrkning af primære humane keratinocytter fra voksen hud

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

En forenklet og effektiv metode til at isolere primære humane keratinocytter fra voksen hudvæv

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Hemogen omprogrammering af humane fibroblaster ved tvungen ekspression af transkriptionsfaktorer

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...