Name: isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry
Uploaded: 2019-05-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry at JoVE.com

Ondersteuning voor dit werk kwam van het departement Dermatologie, het Gates Center for regeneratieve geneeskunde aan de Universiteit van Colorado en de Universiteit van Colorado (UC) huidziekte centrum morfologie en Fenotyping cores (NIAMS P30 AR057212). De auteurs erkennen de UC Cancer Center flow Cytometrie Shared resource en ondersteuning Grant (NCI P30 CA046934) voor de werking van de Mass cytometer en zijn dankbaar voor Karen helm en Christine Childs in de kern voor hun deskundig advies over flow en Mass flowcytometrische Technieken.

De Universiteit van Colorado Anschutz Medical campus ' institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité heeft de dierproeven goedgekeurd die in dit protocol worden beschreven.
1. preparaten
<ol><li>Ontwerp een met metaal gelabeld antilichaam paneel. Gebruik de gratis online panel design software12 en omvatten 127iododeoxyuridine (idu), 164dy (dysprosium) GELABELD anti-CCNB1 (cyclin B1), 175Lu (lutetium) phospho (p)-HISTONEH3Ser28</su...

<ol>
	<li>Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+proliferation+markers:+PCNA,+Ki-67,+MCM-2+and+antiapoptotic+protein+Bcl-2+in+colorectal+cancer.">Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer.</a> Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).</li><li>Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+expression+is+superior+to+mitotic+count+and+novel+proliferation+markers+PHH3,+MCM4+and+mitosin+as+a+prognostic+factor+in+thick+cutaneous+melanoma.">Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma.</a> BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).</li><li>Ryan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+S6+signaling+is+associated+with+cell+survival+and+multinucleation+in+hyperplastic+skin+after+epidermal+loss+of+AURORA-A+Kinase.">Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase.</a> Cell Death &amp; Differentiation. , (2018).</li><li>Magaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunocytochemical+labeling+of+cell+and+tissue+samples+with+monoclonal+anti-bromodeoxyuridine.">Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+constancy+in+heteroploidy+and+the+stem+line+theory+of+tumors.">DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors.</a> Science. 174 (4010), 714-717 (1971).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+time-of-flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li><li>Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+for+analysis+of+immune+system+functional+states.">Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Brodie, T. M., Tosevski, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Dimensional+Single-Cell+Analysis+with+Mass+Cytometry.">High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+Stratum+Corneum+Desquamation+Are+the+Predominant+Effect+of+Impaired+ABCA12+Function+in+a+Novel+Mouse+Model+of+Harlequin+Ichthyosis.">Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis.</a> PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).</li><li>Zunder, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li><li>Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mass+cytometry+sample+cryopreservation+after+staining.">Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining.</a> Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).</li><li>Finck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45:+an+emerging+role+as+a+protein+tyrosine+phosphatase+required+for+lymphocyte+activation+and+development.">CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development.</a> Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).</li><li>Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS/FLI-1+induces+rapid+onset+of+myeloid/erythroid+leukemia+in+mice.">EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).</li><li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+and+Efficient+Method+to+Isolate+Primary+Human+Keratinocytes+from+Adult+Skin+Tissue.">A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue.</a> Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).</li><li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis.">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li><li>Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin.">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li><li>Fluhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anatomical+location+on+barrier+recovery,+surface+pH+and+stratum+corneum+hydration+after+acute+barrier+disruption.">Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption.</a> British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).</li><li>Webb, A., Li, A., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+and+phenotype+of+human+adult+keratinocyte+stem+cells+of+the+skin.">Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin.</a> Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).</li><li>Torchia, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+variant+of+Aurora+kinase+A+promotes+genomic+instability+leading+to+highly+malignant+skin+tumors.">A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors.</a> Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).</li><li>Frei, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).</li></ol>

Het in dit document beschreven protocol kan in ongeveer 8 uur worden ingevuld. Het eindresultaat is een suspensie van cellen verrijkt in KCs die kunnen worden geanalyseerd voor eiwit expressie in een celcyclus-afhankelijke manier. Verschillende eerdere studies hebben methoden beschreven om KCS te isoleren van de menselijke en muis huid16,25. Deze studies omvatten ook protocollen voor de isolatie van KCS voor flow flowcytometrieonderzoeken26</sup...

Correlatie van genexpressie met celcyclus fasen blijft een uitdaging in de analyse van diermodellen van hyperkunststof ziekten zoals kanker. Een deel van deze uitdaging is de co-detectie van eiwitten van belang (POI) met markers van proliferatie. Proliferatieve cellen kunnen worden gevonden in verschillende fasen van de cyclus van de cel, met inbegrip van G1, S, G2, en M. Ki67 is een van de meest gebruikte markers van proliferatie en wordt uitgedrukt in alle fasen van de celcyclus. Het is uitgebreid gebruikt in de analyse van zowel menselijke als muis weefsels1,2,3. Echter, net als andere algemene proliferatie markers, Ki67 niet onderscheiden individuele celcyclus fasen. Een preciezere aanpak maakt gebruik van de opname van thymidine nucleotide-analogen zoals bromodeoxyuridine (Brdu) in cellen die hun genoom actief repliceren (d.w.z. S-fase)4,5. Een nadeel van het gebruik van nucleotide-analogen is de noodzaak om ze te beheren tot levende dieren uren vóór de analyse. Ki67 en BrdU worden vaak aangetroffen op vaste weefsel gedeelten door het gebruik van antilichamen. Een voordeel van deze aanpak is dat de locatie van Poi's kan worden vastgesteld binnen de weefsel architectuur (bijv. de basale laag huid epidermis). Deze aanpak vereist ook geen weefsel dissociatie die kan leiden tot veranderingen in genexpressie. Een nadeel is dat de weefsel fixatie of de verwerking van het weefsel voor LGO bevroren of paraffine snijden de doelen van antilichamen kan occlude (d.w.z. antigenen). Het ophalen van antigenen meestal vereist warmte of weefsel spijsvertering. Kwantificering van kleurings intensiteiten kan ook een uitdaging zijn. Dit is te wijten aan variaties in kleuring, sectie dikte, signaaldetectie en experimenterbias. Bovendien kan een beperkt aantal markers tegelijkertijd worden gedetecteerd in de meeste typische laboratorium opstellingen. Toch, nieuwere multiplex kleuring benaderingen beloven om deze beperkingen te overwinnen; voorbeelden zijn beeldvormings massa cytometrie en tyramide signaalversterking6,7.
Flow flowcytometrieonderzoeken is een andere krachtige technologie om prolifererende cellen op te sporen. Het zorgt voor multiplex detectie van markers in dezelfde cellen, maar vereist weefsel dissociatie voor de meeste niet-hematopoietische celtypen. De analyse van prolifererende cellen wordt routinematig gedaan door het gebruik van kleurstoffen die DNA binden (bijv. Propidium jodide (PI))8. Flow cytometrie maakt ook een nauwkeuriger bepaling van de fasen van de celcyclus mogelijk in combinatie met de detectie van BrdU-opname9. Hoewel een krachtige aanpak, Brdu/Pi flow flowcytometrieonderzoeken heeft zijn nadelen. Het is niet in staat om de G2/M-en G0/G1-fasen op te lossen zonder de toevoeging van fasespecifieke antilichamen. Het aantal antilichamen dat kan worden gebruikt, wordt echter beperkt door cellulaire auto fluorescentie, spectrale overloop van de-emissies en het gebruik van compensatie controles. Deze beperking markt het uitdagender en bewerkelijk om de uitdrukking van celcyclus markeringen met Poi's te co-detecteren. Een meer facile aanpak is het gebruik van massa flowcytometrieonderzoeken10,11. Deze technologie maakt gebruik van metaal geconjugeerde antilichamen die een smaller detectie spectrum hebben. Zodra cellen zijn gekleurd met metaal-gelabelde antilichamen, ze zijn verdampt, en de metalen gedetecteerd door cytometrie tijd-van-vlucht (CyTOF) massaspectrometrie. Door deze eigenschappen, massa cytometrie maakt de multiplex detectie van > 40 verschillende markers met behulp van bestaande platformen10,11. Daarnaast is het mogelijk om stalen streepjescodes met metalen die resulteren in de besparingen van kostbare antilichamen, terwijl het verminderen van monster-naar-monster kleuring variabiliteit. Aan de andere kant, massa cytometrie heeft verschillende nadelen. Er zijn een beperkt aantal commercieel verkrijgbare antilichamen met metaal-Tags voor niet-bloed afgeleide cellen. Kwantificering van DNA-inhoud is minder gevoelig in vergelijking met het gebruik van fluorescerende DNA-kleurstoffen en massa cytometrie heeft een verminderd dynamisch bereik van signaaldetectie in vergelijking met fluorescentie flow cytometrie.
Het protocol dat hier wordt beschreven, is ontworpen om de dynamiek van de celcyclus van nieuw geïsoleerde keratinocyten (KCs) van de muis skin te analyseren en celcyclus specifieke eiwit expressie in deze cellen te karakteriseren met behulp van massa cytometrie. Dit protocol kan ook worden gebruikt met gekweekte cellen of aangepast aan andere celtypen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1157px;" width="1159">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">12-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229512</td>
			<td style="width:368px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Intercalator solution</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201192A</td>
			<td>125 &#181;M - Ir intercalator solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:237px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:259px;">30525-89-4</td>
			<td>16 %&#160; PFA</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Strainer cap flow tubes</td>
			<td style="width:237px;">Fisher/Corning</td>
			<td style="width:259px;">352235</td>
			<td>35 &#181;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell sieve</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">22363547</td>
			<td>40 &#956;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell detatchment solution</td>
			<td style="width:237px;">CELLnTEC</td>
			<td style="width:259px;">CnT-ACCUTASE-100</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Iodine Solution</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher/Purdue</td>
			<td style="width:259px;">67618-151-17</td>
			<td>Betadine 7.5%-iodine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Barcode permeabilization buffer&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Barcodes</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">pH strips</td>
			<td style="width:237px;">EMD</td>
			<td style="width:259px;">9590</td>
			<td>colorpHast</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">DMEM</td>
			<td style="width:237px;">Hyclone</td>
			<td style="width:259px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:368px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Media</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-5-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Curved precision forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-7-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #7</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Calibration Beads</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201078</td>
			<td style="width:368px;">EQ Four Element Calibration Beads</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">HBSS</td>
			<td style="width:237px;">Gibco</td>
			<td style="width:259px;">14175-095</td>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Water</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">SH30538.03</td>
			<td style="width:368px;">Hyclone Molecular Biology grade water</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Iododeoxyuridine</td>
			<td style="width:237px;">&#160;Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I7125</td>
			<td>IdU</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cryo vials</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">366656PK</td>
			<td>internal thread</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201068</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Cell Staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix &#38; Perm buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201067</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix &#38; Perm buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix I buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201065</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix I buffer</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:237px;">Rockland</td>
			<td style="width:259px;">MB-008</td>
			<td>Metal free 10x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">isopropanol-freezing container</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">5100-0001</td>
			<td>Mr.Frosty</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">BP359-500</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Petri dish</td>
			<td style="width:237px;">Kord-Valmark</td>
			<td style="width:259px;">2900</td>
			<td>Supplied by Genesee 32-107&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">15 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">50 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">6-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cisplatin</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">479306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Dispase II</td>
			<td style="width:237px;">Sigma/Roche</td>
			<td style="width:259px;">4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">FBS</td>
			<td style="width:237px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:259px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining&#160; permeabilization buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:237px;">BD</td>
			<td style="width:259px;">309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Type IV Collagenase&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Worthington Bioscience</td>
			<td style="width:259px;">CLSS-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry

Het doel van dit protocol is om te detecteren en te kwantificeren eiwit expressie veranderingen in een cel cyclus-afhankelijke manier met behulp van enkelvoudige cellen geïsoleerd uit de epidermis van de muis huid. Er zijn zeven belangrijke stappen: scheiding van de epidermis van de dermis, vertering van de epidermis, kleuring van de epidermale celpopulaties met cisplatine, monster barcodering, kleuring met metalen gelabelde antilichamen voor celcyclus markers en eiwitten van belang, detectie van met metaal gelabelde antilichamen door massa cytometrie en de analyse van de expressie in de verschillende fasen van de celcyclus. Het voordeel van deze benadering over histologische methoden is het potentieel om het expressie patroon van > 40 verschillende markers in een enkele cel in verschillende fasen van de celcyclus te testen. Deze aanpak maakt het ook mogelijk voor de multivariate correlatieanalyse van eiwit expressie die meer kwantificeerbaar is dan histologische/beeldvormingsmethoden. Het nadeel van dit protocol is dat een schorsing van afzonderlijke cellen nodig is, wat resulteert in het verlies van locatie-informatie die wordt verstrekt door de kleuring van weefsel secties. Deze aanpak kan ook vereisen dat extra markeringen worden opgenomen om verschillende celtypen in de suspensies van ruwe cellen te identificeren. De toepassing van dit protocol is duidelijk in de analyse van hyperplastische huidziekte modellen. Bovendien kan dit protocol worden aangepast voor de analyse van specifieke subtypen van cellen (bv. stamcellen) door toevoeging van Lineage-specifieke antilichamen. Dit protocol kan ook worden aangepast voor de analyse van huidcellen in andere experimentele soorten.

Tabel 1 toont de verwachte celopbrengsten en levensvatbaarheid van volwassen muizen oor (Figuur 1) en neonatale huid onder niet-pathologische omstandigheden. De tabel toont ook representatieve gegevens van dieren uit een gemengde C57/126 achtergrond. Verwacht wordt dat de huid van andere stammen zou resulteren in vergelijkbare celopbrengsten en vivaardigheden. De geschatte opbrengst is afhankelijk van het oppervlak van de huid en geeft aan da...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry at JoVE.com

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolatie en kleuring van de muis huid keratinocyten voor celcyclus specifieke analyse van cellulaire eiwit expressie door massa Cytometrie

Dit protocol beschrijft hoe de huid keratinocyten van Muismodellen te isoleren, te vlekken met metaal-gelabelde antilichamen, en om bevlekte cellen te analyseren door massa cytometrie om het patroon van de expressie van eiwitten van belang in de verschillende celcyclus fasen profiel.

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Dit protocol is belangrijk om twee belangrijke redenen. Nummer een, het stelt een gebruiker in staat om de celcyclus toestanden van huidcellen die zijn geïsoleerd van een diermodel te bepalen. Het stelt ons ook in staat om eiwitexpressie te analyseren in de discrete fasen van de celcyclus.In vergelijking met eerdere methoden voor het bepalen van celproliferatie, onze methode maakt een meer nauwkeurige bepaling van de verschillende fasen in de celcyclus, en we kunnen ook analyseren meer dan 40 verschillende markers in de verschillende stadia van celdeling. Dit verbetert sterk de toepassing en veelzijdigheid van de methode. Dit protocol kan worden gebruikt in kankeronderzoek en bij elk ander type ziekte waar het nodig is om celcyclusspecifieke eiwitexpressiepatronen te bepalen.Bovendien kan dit protocol worden gewijzigd in andere celtypen en in andere modelorganismen. De eerste keer gebruiker moet zich richten op het verkrijgen van de beste kwaliteit celvoorbereiding mogelijk. Dit vereist de tijdige verwerking van de experimentele huid met behulp van verse reagentia, minimale weefselvertering tijd, en zorgvuldige verwijdering van de supernatant na centrifugatie om de integriteit en de hoeveelheid cellen te behouden.Om te beginnen ontwerp je een met metaal getagd antilichaampaneel met behulp van een gratis online paneelontwerpsoftware, zoals beschreven in het manuscript. Bereid vervolgens een IdU-voorraadoplossing voor door IdU-poeder op te lossen met 10 milligram per milliliter in 0,1 normale natriumhydroxide bij 60 graden Celsius. Na het aliquoting IdU voorraad oplossing in microcentrifuge buizen, bevriezen ze op min 20 graden Celsius voor langdurige opslag.Pas onmiddellijk voor gebruik de pH van de IdU-oplossing aan op 7,5 met 12 normaal zoutzuur en test met een pH-strook op een teruggooi aliquot om ervoor te zorgen dat de oplossing zich op pH 7.5 bevindt. Om een twee x paraformaldehyde bevestigingsoplossing te bereiden, combineert u vijf milliliter van 10 x PBS en één milliliter van 16%PFA met 44 milliliter zuiver moleculair gedestilleerd water. Los 300,5 milligram cisplatinepoeder op in 10 milliliter DMSO.Voor experimenten die meer dan één dag moeten worden gebruikt, moet u een cisplatinewerkoplossing van 10 millimolar voorbereiden. Weeg muizen af en bepaal vervolgens een dosis op 0,1 milligram IdU per gram lichaamsgewicht. Beheer de berekende dosis IDU door een intraperitoneale injectie en wacht twee uur voordat cellen worden geoogst.Gebruik een chirurgische kwaliteit schaar om chirurgisch te verwijderen van het oor van de geëuthanaseerde muis eerder geïnjecteerd met IdU aan de basis van het oor. Plaats het oor op een droge petrischaal van 100 millimeter. Scheid de voorste voorzichtig van de achterste huid door fijne tangen te gebruiken om een zak in het midden of de rand van het snijgebied te creëren, trek vervolgens de twee huidflappen uit elkaar en ga verder met zowel de voorste als achterste huiden.Plaats voorzichtig de voorste en achterste huiden van een oor in een put van een 12-well cultuurplaat, gevuld met een milliliter vers bereide dispase / collagenase oplossing, met de derma kant van de huid het aanraken van de oplossing. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende een uur om de huid te verteren. Plaats het verteerde oor of neonatale huid in een schone petrischaal met de opperhuid kant het aanraken van het oppervlak van de schotel.Met behulp van tangen, plat uit de huid en zachtjes schuif de dermis uit de opperhuid door te werken van het centrum naar de randen in een cirkelvormig patroon. Met tangen, pak de opperhuid aan de randen en til het voorzichtig af door het van het oppervlak van de petrischaal te pellen. Plaats de opperhuid voorzichtig op de voorverwarmde cellossingsoplossing in een put van een plaat.Vijf minuten lang incubeer maken bij 37 graden Celsius of 20 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik steriele tangen om de opperhuid te grijpen en te schrobben door de opperhuid tegen de bodem van de schotel te slepen om cellen te scheiden. Voeg een milliliter DMEM met 1%FBS toe en ga door een celzeef van 40 micrometer in een opvangbuis.Spoel goed met nog eens twee milliliter DMEM en voeg toe aan de celsuspensie. Na het centrifugeren op 120 keer g gedurende vijf minuten, zorgvuldig aanzuigen van de supernatant. Resuspend de cel pellet in een tot twee milliliter van DMEM met 1%FBS, en pellet de cellen weer zoals voorheen.Om cellen te labelen om levende en dode cellen te bepalen, wordt één tot drie miljoen cellen opnieuw opgetrokken in één milliliter DMEM met 25 micromolar cisplatine en incubate gedurende één minuut. Blus door te pipetten met een gelijk volume FBS. Na het centrifugeren op 120 keer g gedurende vijf minuten, decanteren de supernatant in een beker met verdund bleekmiddel, en omkeren de buizen om de resterende oplossing drain op een papieren handdoek.Resuspend de cel pellet in twee milliliter barium kation-vrije PBS, en centrifuge ze opnieuw zoals eerder beschreven. Om de cellen te repareren, resuspend de cel pellet in een milliliter van barium kation-vrij PBS. Vortex de cellen onder continu laag vermogen en voeg een milliliter van de twee x PFA fixatie buffer drop-wise.Plaats op een schommelplatform en broed 10 minuten op kamertemperatuur. Na het centrifugeren op 500 keer g gedurende vijf minuten, voorzichtig decanteren de supernatant. Was de cellen met twee milliliter bariumvrije PBS, centrifuge opnieuw onder dezelfde omstandigheden en herhaal de wasstap.Tot slot, resuspend de pellet in twee milliliter barium kation-vrij PBS. Centrifugeer de cellen op 500 keer g gedurende vijf minuten en decanteer de supernatant voorzichtig. Resuspend de cellen in een milliliter van een x fixatie buffer, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en herhaal de centrifugatie.Om de cellen te wassen, voeg een milliliter barcode permeabilisatie buffer. Bereid tijdens celcentrifugatie op 500 keer g gedurende vijf minuten barcodes door 100 microliters barcodepermeabilisatiebuffer aan hen toe te voegen en meng ze onmiddellijk. Resuspend de cel pellet in 800 microliters van barcode permeabilisatie buffer.Voeg barcodeoplossing toe aan de cellen, meng en broed gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Centrifuge op 500 keer g gedurende vijf minuten. Was cellen in twee milliliter van cel vlekken buffer en centrifuge weer.Vervolgens, resuspend een tot drie miljoen cellen in een milliliter van nucleaire antigeen kleuring buffer werken oplossing, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Na het centrifugeren op 500 keer g gedurende vijf minuten, voorzichtig decanteren de supernatant. Resuspend de cellen in een milliliter van nucleaire antigeen kleuring permeabilisatie buffer en centrifuge weer.Na herhaalde resuspensie en centrifugatie, resuspend de celpellet in het resterende volume met zachte vortexing. Voeg 50 microliter intracellulaire antilichaamcocktail toe, meng en broed gedurende 45 minuten op kamertemperatuur. Voeg twee milliliter celvlekken buffer.Centrifuge opnieuw onder dezelfde omstandigheden als in de vorige stap, en verwijder de supernatant. Resuspend de pellet in twee milliliter van cel vlekken buffer, centrifuge op 500 keer g gedurende vijf minuten, en herhaal de resuspending en centrifugatie. Resuspend de cellen in een milliliter van intercalatie oplossing, en op te slaan voor een tot drie dagen op vier graden Celsius.Na het centrifugeren van de cellen opnieuw, was de pellet met twee milliliter cel vlekken buffer, centrifuge onder dezelfde omstandigheden, en voer twee extra wasbeurten met twee milliliters water, met dezelfde centrifugatie. Resuspend de cel pellet op een concentratie van een miljoen cellen per milliliter met verdunde EQ kraal oplossing, en voer vervolgens de monsters op de massa cytometer. De verwachte celopbrengsten en levensvatbaarheid van volwassen muizenoor en neonatale huid worden bepaald.De geschatte opbrengst is afhankelijk van het oppervlak van de huid. Neonatale huid is een betere keuze voor experimenten die grotere aantallen cellen vereisen. De basisgating strategie om te selecteren voor intacte, enkele en levensvatbare cellen, na normalisatie en deconvolutie van barcoded massa cytometrie gegevens, wordt getoond.Het percentage levensvatbare cellen kan wijzen op de kwaliteit of conditie van de cellen voorafgaand aan het bevlekken. Verschillen in levensvatbaarheid tussen gekweekte carcinoomcellen versus geïsoleerde muis oorcellen worden getoond, ook. Levensvatbare cellen werden gated op gebeurtenislengte versus CD45 om hematopoietische cellen uit te sluiten.De opname van afstammingmarkers maakt de selectie van celpopulaties van belang in verschillende celcyclusfasen mogelijk. Het basiscelcyclusprofiel wordt verkregen door de detectie van BrdU versus PI in fluorescerende stroomcytometrie. Echter, opname van andere proliferatie markers met massa cytometrie, maakt een meer nauwkeurige identificatie van celcyclus fasen.Volgens deze benadering kunnen celcyclusprofielen worden geconstrueerd voor verschillende celtypen of experimentele omstandigheden, zoals de profielen voor CD45-negatieve versus CD45-positieve cellen uit hetzelfde experiment. In een ander voorbeeld, analyse van markers die de EGFR en mTOR PI3K signalering trajecten in de G-one fase te definiëren, bleek soortgelijke expressie profielen in CD45 negatieve cellen, weergegeven in oranje, en CD45 positieve cellen, weergegeven in blauw. Massacytometrie vereist veel cellen van hoge kwaliteit.Als een gebruiker geïnteresseerd is in een zeldzame celpopulatie, kunnen hogere aantallen cellen nodig zijn. Geïsoleerde levende cellen kunnen worden gebruikt voor DNA- of RNA-analyse, biochemische studies, of kunnen worden gebruikt in de weefselkweek voorafgaand aan de fixatie en kleuring voor massacytometrie. De gebruiker moet persoonlijke beschermingsmiddelen en een veiligheidskast gebruiken wanneer dat nodig is, wanneer hij werkt met paraformaldehyde, zoutzuur of natriumhydroxide.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D Organotypische Co-cultuur Model Supporting Medullary Thymic epitheelcelproliferatie, Differentiatie en Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generatie van genetisch gemodificeerde Organotypische Skin Culturen behulp gedevitaliseerde Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

Stap-specifieke sorteren van Muis Spermatiden door flowcytometrie

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Isoleren haarfollikel stamcellen en epidermale keratinocyten van Dorsale Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Identificatie van Erythromyeloid Progenitors En Hun Nakomelingen In De Muis Embryo Door Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generatie en kweken van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

Hemogene herprogrammering van menselijke fibroblasten door afgedwongen expressie van transcriptiefactoren

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...