Name: isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry
Uploaded: 2019-05-09T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry at JoVE.com

この研究のサポートは、コロラド大学とコロラド大学(UC)皮膚疾患センターの再生医学のためのゲートセンター、皮膚科から来ました (NIAMS P30 AR00 AR057212).著者らは、UCがんセンターフローサイトメトリー共有リソースとサポート助成金(NCI P30 CA046934)を認め、カレン・ヘルムとクリスティン・チャイルズのフローと質量サイトメトリックに関する専門家のアドバイスに感謝しています。技術。

コロラド大学アンシュッツ医科キャンパスの施設動物ケアと使用委員会は、このプロトコルに記載されている動物実験を承認しました。
1. 準備
<ol><li>金属タグ付き抗体パネルを設計します。無料のオンラインパネル設計ソフトウェア12を使用し、127イオドデオキシウリジン(IdU)、164 Dy(ジスプロシウム)ラベル付き抗CCNB1(CYCLIN B1)、175 Lu(ルテチウム)ホスホ...

<ol>
	<li>Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+proliferation+markers:+PCNA,+Ki-67,+MCM-2+and+antiapoptotic+protein+Bcl-2+in+colorectal+cancer.">Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer.</a> Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).</li><li>Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67+expression+is+superior+to+mitotic+count+and+novel+proliferation+markers+PHH3,+MCM4+and+mitosin+as+a+prognostic+factor+in+thick+cutaneous+melanoma.">Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma.</a> BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).</li><li>Ryan, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+S6+signaling+is+associated+with+cell+survival+and+multinucleation+in+hyperplastic+skin+after+epidermal+loss+of+AURORA-A+Kinase.">Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase.</a> Cell Death &amp; Differentiation. , (2018).</li><li>Magaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+immunocytochemical+labeling+of+cell+and+tissue+samples+with+monoclonal+anti-bromodeoxyuridine.">Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+immunohistochemistry,+imaging,+and+quantitation:+a+review,+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification,+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis.">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li><li>Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+constancy+in+heteroploidy+and+the+stem+line+theory+of+tumors.">DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors.</a> Science. 174 (4010), 714-717 (1971).</li><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine.">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).</li><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+time-of-flight+mass+spectrometry.">Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li><li>Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+for+analysis+of+immune+system+functional+states.">Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).</li><li>Brodie, T. M., Tosevski, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Dimensional+Single-Cell+Analysis+with+Mass+Cytometry.">High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry.</a> Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).</li><li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis.">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+Stratum+Corneum+Desquamation+Are+the+Predominant+Effect+of+Impaired+ABCA12+Function+in+a+Novel+Mouse+Model+of+Harlequin+Ichthyosis.">Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis.</a> PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).</li><li>Zunder, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li><li>Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+mass+cytometry+sample+cryopreservation+after+staining.">Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining.</a> Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).</li><li>Finck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).</li><li>Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD45:+an+emerging+role+as+a+protein+tyrosine+phosphatase+required+for+lymphocyte+activation+and+development.">CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development.</a> Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).</li><li>Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EWS/FLI-1+induces+rapid+onset+of+myeloid/erythroid+leukemia+in+mice.">EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).</li><li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+and+Efficient+Method+to+Isolate+Primary+Human+Keratinocytes+from+Adult+Skin+Tissue.">A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue.</a> Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).</li><li>Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+proliferation+and+differentiation+capacity+of+stem+cells+using+disaggregated+adult+mouse+epidermis.">Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis.</a> Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).</li><li>Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin.">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li><li>Fluhr, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+anatomical+location+on+barrier+recovery,+surface+pH+and+stratum+corneum+hydration+after+acute+barrier+disruption.">Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption.</a> British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).</li><li>Webb, A., Li, A., Kaur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+and+phenotype+of+human+adult+keratinocyte+stem+cells+of+the+skin.">Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin.</a> Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).</li><li>Torchia, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+variant+of+Aurora+kinase+A+promotes+genomic+instability+leading+to+highly+malignant+skin+tumors.">A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors.</a> Cancer Research. 69 (18), 7207-7215 (2009).</li><li>Frei, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).</li></ol>

このホワイト ペーパーで概説されているプロトコルは、約 8 時間で完了できます。その結果、細胞周期依存的な方法でタンパク質発現を分析できる、KCで濃縮された細胞の懸濁液が得られます。いくつかの以前の研究は、ヒトおよびマウスの皮膚からKCを分離する方法を概説している16,25.これらの研究には、フローサイトメトリー26</su...

遺伝子発現と細胞周期段階との相関は、がんのような過形成性疾患の動物モデルの解析において依然として課題である。この課題の一部は、増殖のマーカーを用いて目的タンパク質(POI)の共検出です。増殖細胞は、G1、S、G2、およびM.Ki67を含む様々な細胞サイクル段階で見つけることができ、増殖の最も一般的に使用されるマーカーの1つであり、細胞周期のすべての段階で発現される。それはヒトおよびマウス組織の両方の分析で広く使用されている1,2,3.しかし、他の一般的な増殖マーカーと同様に、Ki67は個々の細胞周期相を識別しない。より正確なアプローチは、ブロモデオキシリジン(BrdU)のようなチミジンヌクレオチド類似体を、ゲノムを積極的に複製している細胞(すなわち、S相)4、5を使用する。ヌクレオチド類似体の使用に対する欠点の1つは、分析の数時間前に生きた動物に投与する必要があることです。Ki67およびBrdUは、抗体の使用によって固定組織切片で一般的に検出される。このアプローチの1つの利点は、POIの位置が組織アーキテクチャ(例えば、皮膚表皮の基底層)内で確認できることである。このアプローチはまた、遺伝子発現の変化につながる可能性のある組織解離を必要としない。1つの欠点は、OCT凍結またはパラフィン断面に対する組織の固定または処理が抗体標的(すなわち、抗原)を閉塞しうる点である。抗原の検索は、通常、熱または組織の消化を必要とします。染色強度の定量化も困難な場合があります。これは、染色、断面厚、信号検出、および実験者バイアスの変動によるものです。さらに、限られた数のマーカーは最も典型的な実験室のセットアップで同時に検出することができる。しかし、新しい多重染色アプローチは、これらの制限を克服することを約束します。例は、質量サイトメトリーおよびチラミド信号増幅6、7をイメージングしている。
フローサイトメトリーは、増殖細胞を検出するもう一つの強力な技術です。それは同じ細胞のマーカーの多重検出を可能にするが、ほとんどの非血行細胞タイプのための組織の解離を要求する。増殖細胞の分析は、DNAを結合する染料(例えば、ヨウ化プロピジウム(PI))8を使用することによって日常的に行われる。フローサイトメトリーはまた、BrdU組み込み9の検出と組み合わせた場合、細胞周期相のより正確な決定を可能にする。強力なアプローチですが、BrdU/PIフローサイトメトリーには欠点があります。相特異的抗体を含まないと、G2/MおよびG0/G1相を解決することができません。しかしながら、使用できる抗体の数は、細胞の自己蛍光、蛍光色素放出のスペクトル波及、および補償制御の使用によって制限される。この制限は、POI を使用して細胞サイクル マーカーの発現を共に検出するのがより困難で手間のかかることをマークします。より表面的なアプローチは、質量サイトメトリー10、11を使用することです。この技術は、より狭い検出スペクトルを持つ金属共役抗体を使用しています。細胞が金属タグ付き抗体で染色されると、それらは気化され、細胞メトリー飛行時間(CyTOF)質量分析によって検出された金属。これらの特性により、質量サイトメトリーは、既存のプラットフォーム10、11を使用して>40の異なるマーカーの多重検出を可能にします。さらに、サンプル間染色の変動を低減しながら、貴重な抗体の節約につながる金属でサンプルをバーコードすることが可能です。一方、質量サイトメトリーにはいくつかの欠点がある。非血液由来細胞に対して市販の金属タグ付き抗体の数は限られています。DNA含有量の定量化は、蛍光DNA色素および質量サイトメトリーの使用に比べて感受性が低く、蛍光流細胞メトリーと比較して信号検出のダイナミックレンジが低下している。
ここで説明するプロトコルは、マウスの皮膚から新たに単離されたケラチノサイト(KC)からの細胞周期ダイナミクスを分析し、質量サイトメトリーを用いてこれらの細胞における細胞周期特異的タンパク質発現を特徴付けることを目的とした。このプロトコルは、培養細胞と共に使用することも、他の細胞型に適合させることもできる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1157px;" width="1159">
	<tbody>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">12-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229512</td>
			<td style="width:368px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Intercalator solution</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201192A</td>
			<td>125 &#181;M - Ir intercalator solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:237px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:259px;">30525-89-4</td>
			<td>16 %&#160; PFA</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Strainer cap flow tubes</td>
			<td style="width:237px;">Fisher/Corning</td>
			<td style="width:259px;">352235</td>
			<td>35 &#181;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell sieve</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">22363547</td>
			<td>40 &#956;m pore size&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell detatchment solution</td>
			<td style="width:237px;">CELLnTEC</td>
			<td style="width:259px;">CnT-ACCUTASE-100</td>
			<td>Accutase</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Iodine Solution</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher/Purdue</td>
			<td style="width:259px;">67618-151-17</td>
			<td>Betadine 7.5%-iodine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Barcode permeabilization buffer&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Barcodes</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201060</td>
			<td style="width:368px;">Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">pH strips</td>
			<td style="width:237px;">EMD</td>
			<td style="width:259px;">9590</td>
			<td>colorpHast</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">DMEM</td>
			<td style="width:237px;">Hyclone</td>
			<td style="width:259px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:368px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Media</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fine forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-5-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #5</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Curved precision forceps</td>
			<td style="width:237px;">Dumont &#38; Fils</td>
			<td style="width:259px;">0109-7-PO</td>
			<td style="width:368px;">Dumostar #7</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Calibration Beads</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201078</td>
			<td style="width:368px;">EQ Four Element Calibration Beads</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">HBSS</td>
			<td style="width:237px;">Gibco</td>
			<td style="width:259px;">14175-095</td>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Water</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">SH30538.03</td>
			<td style="width:368px;">Hyclone Molecular Biology grade water</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Iododeoxyuridine</td>
			<td style="width:237px;">&#160;Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I7125</td>
			<td>IdU</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cryo vials</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">366656PK</td>
			<td>internal thread</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cell Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201068</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Cell Staining buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix &#38; Perm buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201067</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix &#38; Perm buffer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Fix I buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201065</td>
			<td style="width:368px;">Maxpar Fix I buffer</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:237px;">Rockland</td>
			<td style="width:259px;">MB-008</td>
			<td>Metal free 10x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">isopropanol-freezing container</td>
			<td style="width:237px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:259px;">5100-0001</td>
			<td>Mr.Frosty</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">BP359-500</td>
			<td>NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Petri dish</td>
			<td style="width:237px;">Kord-Valmark</td>
			<td style="width:259px;">2900</td>
			<td>Supplied by Genesee 32-107&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">15 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">50 mL conical</td>
			<td style="width:237px;">Olympus/Genesee</td>
			<td style="width:259px;">28-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">6-well plate</td>
			<td style="width:237px;">Cell Treat</td>
			<td style="width:259px;">229506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Cisplatin</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">479306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Dispase II</td>
			<td style="width:237px;">Sigma/Roche</td>
			<td style="width:259px;">4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">DMSO</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">FBS</td>
			<td style="width:237px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:259px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td style="width:259px;">A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining&#160; permeabilization buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Nuclear Antigen Staining buffer</td>
			<td style="width:237px;">Fluidigm</td>
			<td style="width:259px;">201063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:293px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Tuberculin syringe</td>
			<td style="width:237px;">BD</td>
			<td style="width:259px;">309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:293px;">Type IV Collagenase&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Worthington Bioscience</td>
			<td style="width:259px;">CLSS-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and staining of mouse skin keratinocytes for cell cycle specific analysis of cellular protein expression by mass cytometry

このプロトコルの目的は、マウス皮膚の表皮から単一細胞を用いて細胞周期依存的な方法でタンパク質発現変化を検出し、定量することである。7つの重要なステップがあります:真皮からの表皮の分離、表皮の消化、シスプラチンを用した表皮細胞集団の染色、サンプルバーコード、細胞周期マーカーおよびタンパク質に対する金属タグ付き抗体での染色質量サイトメトリーによる金属タグ付き抗体の検出、および様々な細胞周期相における発現の分析に関心を持つ。組織学的方法に対するこのアプローチの利点は、細胞周期の異なる段階で1つの細胞における>40の異なるマーカーの発現パターンをアッセイする可能性である。このアプローチはまた、組織学的/イメージング法よりも定量化可能なタンパク質発現の多変量相関分析を可能にする。このプロトコルの欠点は、単一細胞の懸濁液が必要であり、組織切片の染色によって提供される位置情報の損失をもたらす。このアプローチはまた、粗細胞懸濁液中の異なる細胞型を識別するために追加のマーカーを含めることを必要とする場合もある。このプロトコルの応用は、過形成性皮膚疾患モデルの分析において明らかである。さらに、このプロトコルは、系統特異的抗体の添加によって特定のサブタイプの細胞(例えば、幹細胞)の分析に適合させることができる。このプロトコルはまた、他の実験種における皮膚細胞の分析に適合させることができる。

表1は、成人マウス耳(図1)および非病理学的条件下での新生児皮膚からの期待される細胞収量および生存率を示す。この表は、混合C57/126の背景からの動物の代表的なデータも示しています。他の株の皮膚は、同様の細胞収率と生存率をもたらすことが期待されます。おおよその収量は皮膚の表面積に依存し、新生児の皮膚がより多く...

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Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

このプロトコルは、皮膚ケラチノサイトをマウスモデルから単離し、金属タグ付き抗体で染色し、異なる細胞周期相で目的のタンパク質の発現パターンをプロファイリングするために質量サイトメトリーによって染色された細胞を分析する方法について説明する。

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

このプロトコルは、主に 2 つの理由から重要です。第1に、動物モデルから単離された皮膚細胞の細胞周期状態をユーザが決定することができる。また、細胞周期の離散段階でタンパク質発現を分析することもできます。細胞増殖を決定する従来の方法と比較して、我々の方法は、細胞周期における異なる相のより正確な決定を可能にし、また、細胞分裂の様々な段階で40以上の異なるマーカーを分析することができます。これにより、この方法の用途と汎用性が大幅に向上します。このプロトコルは、癌研究や細胞周期特異的なタンパク質発現パターンを決定する必要がある他のタイプの疾患で使用することができます。さらに、このプロトコルは、他の細胞タイプ、および他のモデル生物に変更することができる。初めてユーザーは、可能な限り最高品質の細胞の準備を得ることに焦点を当てる必要があります。そのためには、新鮮な試薬を用いた実験用皮膚のタイムリーな処理、組織消化時間の最小化、遠心分離後の上清の慎重な廃棄が必要であり、細胞の完全性と量を維持します。まず、原稿に記載されているように、無料のオンラインパネル設計ソフトウェアを使用して金属タグ付き抗体パネルを設計します。その後、60°Cで0.1通常の水酸化ナトリウムで1ミリリットルあたり10ミリグラムでIdU粉末を溶解することによってIdUストック溶液を調製します。IdUストック溶液をマイクロ遠心チューブにアリクォートした後、長期保存のためにマイナス20°Cで凍結します。使用直前に、12の通常の塩酸でIdU溶液のpHを7.5に調整し、廃棄アリコート上のpHストリップでテストして溶液がpH 7.5であることを確認します。2つのxパラホルムアルデヒド固定溶液を調製するには、10 x PBSの5ミリリットルと16%PFAの1ミリリットルを44ミリリットルの純粋な分子グレード蒸留水と組み合わせます。100ミリモルシプラチンストック溶液を調製するには、300.5ミリグラムのシスプラチン粉末を10ミリリットルのDMSOに溶解する。1日にわたって使用する実験のために、10ミリモルのシスプラチン作業溶液を調製する。マウスの重量を量り、体重1グラム当たりIdUの0.1ミリグラムで用量を決定する。腹腔内注射によりIDUの計算用量を投与し、細胞を収穫する前に2時間待つ。外科グレードのはさみを使用して、以前に耳の基部にIdUを注射した安楽死させたマウスの耳を外科的に取り除きます。乾いた100ミリメートルのペトリ皿に耳を置きます。細かい鉗子を使って後部皮膚から前部を慎重に分離し、カット領域の中央または端にポケットを作成し、2つの皮膚フラップを引き離し、前部および後部の両方の皮膚を引き出します。12ウェルの培養プレートの1つの井戸に1つの耳の前部および後部の皮を慎重に置き、1ミリリットルの新鮮なディスパーゼ/コラゲナーゼ溶液を充填し、皮膚の皮膚側が溶液に触れる。皮を消化するために1時間摂氏37度でインキュベート。消化した耳または新生児の皮膚を、表皮側が皿の表面に触れたきれいなペトリ皿に入れます。鉗子を使用して、皮膚を平らにし、円形のパターンで中央から端まで働くことによって表皮から真皮を穏やかにスライドさせます。鉗子で、端の表皮をつかみ、ペトリ皿の表面から剥がすことによって穏やかにそれを持ち上げます。慎重にプレートの1つのウェルに温め前の細胞剥離液の上に表皮を置きます。摂氏37度で5分間、室温で20分インキュベートします。滅菌鉗子を使用して表皮をつかみ、表皮を皿の底に引きずり込んで細胞を解負します。1%FBSを含むDMEMを1ミリリットル加え、40マイクロメートルのセルふるいを通して回収管に入れる。DMEMの追加の2ミリリットルでよくすすい、細胞の懸濁液に加えます。120回gで5分間遠心した後、上清を慎重に吸引する。1%FBSを含むDMEMの1〜2ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁し、細胞を以前のように再度ペレットする。細胞にラベルを付けて生細胞と死細胞を決定するには、25個のミクロモルシスプラチンを含むDMEMの1ミリリットルに1〜300万個の細胞を再懸濁し、1分間インキュベートする。同じ量のFBSでピペットを入れる。120回gで5分間遠心した後、上澄み液を希釈した漂白剤を含むビーカーにデカントし、チューブを反転させて残りの溶液をペーパータオルに排出します。バリウムカチオンフリーPBSの2ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁し、前述のように再び遠心分離する。細胞を固定するには、バリウムカチオンフリーPBSの1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。連続低電力下の細胞をボルテックスし、ドロップワイズ2 x PFA固定バッファーの1ミリリットルを追加します。ロッキングプラットフォーム上に置き、室温で10分間インキュベートします。500回gで5分間遠心した後、上清を慎重にデカントする。バリウムカチオンフリーPBSの2ミリリットルで細胞を洗浄し、同じ条件下で再び遠心分離機を再び、洗浄工程を繰り返します。最後に、2ミリリットルのバリウムカチオンフリーPBSでペレットを再懸濁する。500回gで5分間遠心分離し、上清を慎重にデカントする。1つのx固定バッファーの1ミリリットルで細胞を再懸濁し、室温で10分間インキュベートし、遠心分離を繰り返します。細胞を洗浄するには、1ミリリットルのバーコードパーメアビライゼーションバッファーを追加します。5分間gの500倍で細胞遠心処理の間、100マイクロリットルのバーコード透過バッファーを添加してバーコードを調製し、すぐに混ぜます。800マイクロリットルのバーコード透過バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。細胞にバーコード溶液を加え、混合し、室温で30分間インキュベートします。5分間500回gで遠心分離機。細胞染色バッファーと遠心分離機の 2 ミリリットルで細胞を再び洗浄します。.次に、核抗原染色緩衝液の1ミリリットルに1〜300万個の細胞を再懸濁し、室温で30分間インキュベートする。500回gで5分間遠心した後、上清を慎重にデカントする。再び1ミリリットルの核抗原染色透過バッファーおよび遠心分離機で細胞を再懸濁する。再懸濁と遠心分離を繰り返した後、残留体積中の細胞ペレットを穏やかな渦で再懸濁する。50マイクロリットルの細胞内抗体カクテルを加え、混合し、室温で45分間インキュベートします。細胞染色バッファーを 2 ミリリットル追加します。.前工程と同じ条件で遠心分離機を再度、上清を除去する。ペレットを2ミリリットルの細胞染色バッファーに再懸濁し、遠心分離機を500回gで5分間再懸濁し、再懸濁および遠心分離を繰り返す。インターカレーション溶液の1ミリリットルで細胞を再懸濁し、摂氏4度で1〜3日間保存します。再び細胞を遠心分離した後、ペレットを2ミリリットルの細胞染色バッファーで洗浄し、同じ条件で遠心分離し、同じ遠心分離で2ミリリットルの水で2回の追加洗浄を行います。希釈されたEQビーズ溶液で1ミリリットル当たり100万個の細胞の濃度で細胞ペレットを再懸濁し、次いで質量細胞量計でサンプルを実行します。成人マウス耳および新生児皮膚からの期待細胞収率および生存率が決定される。おおよその収率は、皮膚の表面積に依存します。新生児の皮膚は、より多くの細胞を必要とする実験のためのより良い選択です。バーコード質量サイトメトリーデータの正規化およびデコンボリューション後に、無傷、単一、生存可能な細胞を選択する基本的な格言戦略が示されている。生存可能な細胞の割合は、染色前の細胞の品質または状態を示すものであってもよい。培養癌細胞と単離されたマウスの耳細胞との間の生存率の違いも示されている。生存可能な細胞は、造血細胞を除外するためにCD45と対比してイベント長にゲート付けされた。系統マーカーを含めることによって、異なる細胞周期段階で目的とする細胞集団を選択することができます。基本的な細胞周期プロファイルは、蛍光ベースのフローサイトメトリーにおけるBrdU対PIの検出によって得られる。しかし、他の増殖マーカーを質量サイトメトリーと組み込んで、細胞周期相をより正確に同定することが可能である。このアプローチに従って、細胞周期プロファイルは、同じ実験のCD45陰性細胞とCD45陽性細胞のプロファイルなど、異なる細胞タイプまたは実験条件に対して構築することができる。別の例では、G−1相におけるEGFRおよびmTOR PI3Kシグナル伝達経路を定義するマーカーの分析は、青色で示されるオレンジ、およびCD45陽性細胞とのCD45陰性細胞における類似の発現プロファイルを明らかにした。質量細胞測定は、高品質の細胞の多くを必要とします。ユーザーが希少な細胞集団に関心を持っている場合は、より多くの細胞が必要になる場合があります。分離された生きた細胞は、DNAまたはRNA分析、生化学的研究、または固化前の組織培養で使用することができ、質量サイトメトリーのために染色する。パラホルムアルデヒド、塩酸、または水酸化ナトリウムを使用する場合は、必要に応じて個人保護装置と安全キャビネットを使用する必要があります。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

髄質胸腺上皮細胞の増殖、分化および無差別遺伝子発現を支える3D器官共培養モデル

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによるマウス精子細胞のステップ固有のソート

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

背マウス皮膚から毛包幹細胞と表皮角化細胞の単離

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

フローサイトメトリーによるマウス胚における赤血球系前駆細胞およびその子孫の同定

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

世代、大人の肌からプライマリ ヒト角化培養

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

転写因子の強制発現によるヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...